CC BY
31
УДК 616.233-002-036.1-036.87-07:579.23:612.017
С.1.1льченко, РЕЗУЛЬТАТИ 1МУНОЦИТОХ1М1ЧНИХ
В. О. Бондарева ДОСЛ1ДЖЕНЬ ŒmOBOÏ ОБОЛОНКИ
БРОНХ1В У Д1ТЕЙ З РЕЦИДИВНИМИ ТА ХРОН1ЧНИМИ БРОНХ1ТАМИ
Днтропетровсъка державна медична академiя кафедра пропедевтики дитячих хвороб (зав. - д. мед. н., проф. К. Д. Дука) кафедра патологiчноi анатома та судовоХ медицини (зав. - д. мед. н., проф. 1.С. Шпонъка)
Ключовi слова: dimu, браш-бюпая, рецидивний i хротчнш 6poHxim, iмуноцитохiмiя Key words: children, brush-biopsy, recurrent and chronic bronchitis, immunocytochemistry
Резюме. Проведено цитологическое и иммуноцитохимическое исследование материала браш-биопсии слизистой бронхов детей с рецидивирующими и хроническими бронхитами. В результате изучения экспрессии маркеров СК34@Е12, Ki-67, TGF-fi были выявлены критерии хронизации воспалительного процесса в эпителии бронхов, риска развития фиброза. Эти данные могут быть использованы для оптимизации профилактических методов в детской пульмонологии Summary. Brush-biopsy of bronchial mucous membrane of children with recurrent and chronic bronchitis was investigated cytologically and immu-nocytochemically. Expression of such markers as СК34@Е12, Ki-67, TGF-fi was studied, criteria of chronic inflammation in bronchial epithelium and risk offibrosis progress was revealed. These data may be used for optimization of prophylaxis in Mldren 's pulmonology.
Одтею з актуальных проблем дитячо! пульмонологи е рання дiагностика хрошзацп брон-хiального запалення та профшактика незворот-них порушень функци дихання у дтей та шдлггюв iз повторними затяжними шфекцш-ними бронхгами. Серед причин формування хрошчно! бронхообструкци е порушення муко-цитарного ктренсу, який залежить вщ стану бронхiального секрету, функци епiтелiальних кл^ин, !х спроможност до регенераци, актив-носп фiброзу [1, 2]. Крiм того, велике значення мае стан загального та мюцевого iмунiтету (наяв-нють NK-клiтин, мiграцiя лiмфоцитiв, макро-фапв), як невiд'емного компоненту запалення, що призводить до мпраци фiбробластiв у сли-зову оболонку. Фiброз посилюе гiпоксiю, яка, в свою чергу, е стимулятором пролiферацil та м> граци фiбробластiв. Таким чином, формуеться „хибне коло", яке, при виснаженш компенса-цiйно-адаптивних процесiв, може заюнчитись глибокою перебудовою архiтектонiки бронхiв [3]. Впровадження нових iмуноцитохiмiчних до-слщжень цитологiчного матерiалу з бронх1в дозволяе визначити штенсивнють запального процесу, метапластичш змiни, репаративний потенцiал епiтелiю, доклшчш ознаки ремо-делiнгу бронхiв [1,2]. Це сприяе формуванню груп дтей з високим ризиком фiброзу та пневмосклерозу, розробщ iндивiдуальних лшу-вально-профшактичних програм.
Метою даного дослщження е виявлення особ-ливостей стану ештелда бронхiв при рецидивному та хрошчному бронхiтi на n^^^i ци-тологiчних та iмуноцитохiмiчних дослщжень браш-бiопсiй слизово! оболонки бронхiв.
МАТЕР1АЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛ1ДЖЕНЬ
Матерiалом для iмуноцитологiчного дослщ-ження були браш-бюпси, отриманi при ендо-скопiчному дослщженш шляхом вiдбитку вiд слизово! оболонки бронхiв 27 дiтей вiком 10-18 роюв, i3 хронiчним та рецидивним бронхггом у перiодi клшчно! ремiсi!. Паралельно аналiзували ендоскопiчну характеристику бронх1в. Брон-х1альна браш-бiопсiя включена в сучасний протокол дiагностики хрошчного бронх1ту у дiтей [1,6].
Для iмуноцитологiчного дослiдження мате-рiал наносився ендоскотчною щiткою на обро-блене адгезивною рщиною скло (Super Frost Plus) з подальшою фiксацiею вщповщно до прийнятих стандартiв. Як первинш антитiла викорис-товували моноклональнi антитша до цитокерати-нiв iз високою молекулярною масою (моноклон 34РЕ12, фiрма DakoCytomation), цитокератинiв 7 (моноклон OV-TL 12/30, фiрма DakoCytomation), Ki-67 (клон MIB-1), Р-фракци TGF (регуля-торний полшептид P-рецепторiв, лiофiлiзат NCL-TGF-P, фiрма NovoCastra).
Цитокератини 7 (СК 7) використовувалися як
маркер клгшн залозистого епiтелiю (експресiя у вiйчастих, келихоподiбних клiтинах). Цитоке-ратини 34РЕ12 - маркер плоскокттинно! мета-плазн бронхiального епiтелiю. Ki-67 - визначае пролiферативний потенцiал епiтелiю. TGF-P -трансформуючий фактор росту - один iз най-бiльш ушверсальних маркерiв, що мае вплив на процеси шщацн пролiферащl фiбробластiв, власне пролiферацiю фiбробластiв, синтез компонента екстрацелюлярного матрикса, коопе-рацiю клггин запалення (в першу чергу, мак-рофагiв). На сьогоднi доведена його роль у розвитку хрошчно! обструктивно! хвороби ле-гень у дорослих [5]. Активащя цього фактора залежить i вiд порушень метаболiчного гомео-стазу легень (в т.ч. зниження рiвня глутатiону та антипротеолiтичних фермента).
1нкубащя проводилась у камерах при темпе-ратурi 23 - 250С 30 хв. Титр антитiл шдбирався
iндивiдуально для кожного маркера вщповщно до вимог специфшацн. Iдентифiкацiя реакцй проводилась при нанесенш хромогена DAB (щами-нобензидину) пiд контролем мшроскопа. Продукт реакцн мав коричневий колiр i3 розташу-ванням мiтки в ядрi або на мембраш. Антигеннi детермiнaнти СК34РЕ12, СК 7 та P-TGF лока-лiзувaлись на мембрaнi, субмембранно та в цитоплазм^ Ki-67 - iнтрaнуклеaрно. Для кожного маркера проводили контрольш дослщження для зaпобiгaння псевдопозитивному або псевдонегативному результату. Для диференщю-вання структур тканини мaтерiaл додатково за-барвлювався гемaтоксилiном Майера. Оцшка результaтiв iмуноцитохiмiчноl реакцн здшсню-валась за допомогою методiв, прийнятих в iму-нопстоимн: якiсно - з визначенням ступеня експресй в балах та кшьюсно - у вщсотках за спiввiдношенням до переглянутих кттин (рис.1).
Рис.1. Частота позитивмих iмуноцитохiмiчних реакцш (в %) з дослщмими маркерами в браш-бiопсiйному матерiалi слизовоТ оболонки броммв у д^ей i3 хронiчними та рецидивними бронхггами
РЕЗУЛЬТАТИ ТА IX ОБГОВОРЕННЯ
При цитолопчному aнaлiзi брaш-бiопсiйний мaтерiaл включав клггини бронхiaльного еште-лiю i клiтини запально! шфшьтрацн. У дтей iз рецидивним бронхiтом це були переважно кл> тини цилiндричного ештелда з ознаками про-лiферaцil, клггини плоского епiтелiю, нейтро-фiли. У дтей iз хронiчними бронхiтaми - клггини плоского епiтелiю, клiтини цилiндричного еш-
телiю з менш вираженими ознаками пролiфе-рацн, а також переважно лiмфоцитaрною та макрофагальною шфшьтращею. Бiльшiсть еште-лiaльних клiтин (>80%) мали прояви дистро-фiчних процешв, що спiвпaдaе з даними шших дослiджень [2, 6]. Ендоскопiчними ознаками хрошчного бронхiту були гiперемiя, набряк та фрагменти атрофн слизово1 оболонки бронхiв.
Iмуноцитохiмiчне дослiдження дозволило
08/ Том XIII/ 2
75
встановити, що в груш дтей iз хронiчними бронхiтами пролiферативний потенцiал епiтелiю був нижчим, шж у групi з рецидивним бронх^ом (позитивний Ki-67 3,57±0,03 та 4,5±0,01 на 100 клiтин вiдповiдно, р<0,05). Експресiя СК34РЕ12 була майже однаковою у дiтей з обох груп, але при рецидивному бронхт позитивна реакщя частiше вiдмiчалась одночасно як iз плоским, так i iз залозистим епiтелiем, що е ознакою зворотно! трансформацп. У третини обстежених дтей було iдентифiковано в брониальному ештели P-TGF (рис. 2, 3). Вiрогiдноl рiзницi за частотою виявлення цього маркеру мiж двома групами не було, але визначена пряма корелящя з наявнiстю
xpoHÍ4Horo бронхолегеневого захворювання у родичiв за спiрогафiчними показниками. Це може пiдтверджувати теорда iснування гене-тично! схильностi до ХОЗЛ [1,3,5]. 1нтенсившсть експреси P-TGF була бiльш вираженою у дтей Í3 рецидивним бронхiтом, що свщчить про високий ризик розвитку фiброзивних процесiв у брон-хiальнiй стшщ. При хронiчному бронхiтi екс-пресiя даного маркеру була слабкою, що може свщчити про вже завершену гiстоархiтектонiчну перебудову [3,5]. У браш-бюпсшному матерiалi трьох здорових дiтей (ендоскошя проводилась з приводу асшраци стороншм тiлом) експресiя Р-TGF була вщсутньою.
Рис.2. Виражена позитивна мембранна та цитоплазматична експреая з P-TGF (iмуноцитохiмiчний метод, додаткове забарвлення гематоксилшом Майера), збiльшення х 1000 р.
Таким чином, на наш погляд, використання антагонюта P-TGF у терапи ХОЗЛ мае пер-спективне майбутне. Спираючись на лiтературнi [4] та власш данi, слiд зробити висновок: тдвищення глутатiону на поверхнi ресш-раторного епiтелiю е терапевтичною стратепею, що дозволить пiдвищити антиоксидантний за-хист легень та контролювати процес прол> фераци фiбробластiв у дтей, якi хворiють на рецидивний та хрошчний бронхiти. На сьогоднi науково доведено, що такий муколггичний
препарат, як флушуцил (N-ацетилцистеш, роз-чин 10 % - 3 мл, Zambón), мае антиоксидантну дда та е попередником глутатюну. Таким чином, включення флушуцилу (N-ацетилцистехн, роз-чин 10 % - 3 мл, Zambón) у програми лшування загострень (як муколггика) та на перюд проти-рецидивного лiкування (як антиоксиданта та регулятора фiбропластичних процесiв) у дiтей з ознаками хрошзацп бронхiту е обгрунтованим, доцiльним та перспективним.
Рис.3. Виражена позитивна мембранна та цитоплазматична експреая з цитокератинами 34ßE12 (плоскокл^инна метаплазiя бронхiального епiтелiю), збiльшення х 1000 р.
ВИСНОВКИ
1. Iмуноцитохiмiчний аналiз браш-бюпси слизово! оболонки 6poHXiB у дiтей i3 рецидивними та хрошчними бронхiтами показав наявшсть виражено! плоскоклiтинно! метаплази бронхь ального ештелда, що е раннiм маркером початку ремоделшгу бронхiв.
2. За рiвнем експреси Ki-67 встановлено, що вже при рецидивному бронхт пролiферативний потенцiал бронхiального епiтелiю недостатнiй, а це е фактором ризику уповшьнення процешв репараци та iнiцiацi! фiброзу при повторних запальних процесах.
3. Виражена експреая ß-TGF в епiтелi! слизо-
во! оболонки 6poHxÍB у дiтей е маркером потен-цiального ризику розвитку хрошчного обструк-тивного бронхiту, склерогенезу.
4. Програми лшування дiтей Í3 рецидивними та хронiчними бронхiтами повинш складатись з урахуванням iнтенсивностi запального процесу, метапластичних змiн, репаративного потенщалу епiтелiю, ризику формування фiброзу.
5. Флу!муцил (N-ацетилцистеiн, розчин 10 % - 3 мл, Zambón), враховуючи його антиок-сидантну та антифiброзну дiю, може бути одним iз препаратiв вибору в профiлактицi ремоделшгу бронхiв у дiтей, що мають рецидивнi бронхо-легеневi захворювання.
СПИСОК Л1ТЕРАТУРИ
1. Антипк1н Ю.Г., Власенко Н.В., Арабська Л.П. До питання д1агностики перехвдних форм рециди-вуючого бронхггу у дггей // Перинатолопя та педа-атр1я.-2003.-№3.-С.26-28.
2. Антипин Ю.Г., Задорожна Т.Д., Пустовало-ва О.1. Роль 1муноцитох1м1чних дослвджень в раннш д1агностиц1 запальних процеав дихальних шлях1в у дггей // Актуальные вопросы педиатрии.-2006.-№1.-С.45-47.
3. Клеточная биология легких в норме и при патологии / Под ред.В.В.Ерохина.-М.: Медицина, 2000. - С.95-118.
4. Чучалин А.Г., Соодаев С.К., Авдеев С.Н. Флу-
имуцил: механизмы действия и значение в терапии заболеваний органов дыхания.-М.:2атЬоп Group, 2005. - 47c.
5. Boer W., Schadewijk A. Transforming Growth Factor b1 and Recruitment of Macrophages and Mast Cells in Airways in Chronic Obstructive Pulmonary Disease // Am. J. Resp. Crit. Care Med. - 1998. -Vol.158. - P.1955-58.
6. Methods for the Assessment of Endobronchial Biopsies in Clinical Research / Peter Jeffery, Stephen Holgate, Sally Wenzel et al. // Am. J. Resp. Crit. Care Med.-2003.- Vol.168. - P.54-57.
08/ Том XIII/ 2
♦
77
