РЕЗИСТЕНТНОСТЬ КЛЕТОК РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ К ПОЛНОСТЬЮ ТРАНСРЕТИНОЕВОЙ КИСЛОТЕ АССОЦИИРОВАНА СО СНИЖЕНИЕМ БАЗАЛЬНОГО УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ ЯДЕРНОГО РЕЦЕПТОРА RARα И ИНДУКЦИИ ЭКСПРЕССИИ ЦИТОХРОМОВ CYP26A1 И CYP26В1 Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

сч сч О сч

DOI: 10.17650/2313-805X-2022-9-2-66-78

(«D]

см >-

Резистентность клеток рака молочной железы § к полностью трансретиноевой кислоте

ассоциирована со снижением базального уровня экспрессии ядерного рецептора RARa и индукции экспрессии цитохромов CYP26A1 и CYP26В1

о и Z

о

сс <

о ж.

ю

< >

а

<

о

а.

и >

А.Д. Еникеев, А.В. Комельков, Н.В. Елкина, М.Е. Аксельрод, С.А. Кузьмичев, Е.М. Чевкина

Научно-исследовательский институт канцерогенеза ФГБУ«Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24

Контакты: Андрей Викторович Комельков [email protected]

Введение. Ретиноевая кислота (РК) является одним из ключевых регуляторов дифференцировки клеток и важнейшим участником таких системных процессов в организме, как эмбриональное развитие, созревание и функционирование клеток иммунной системы, ремоделирование тканей и ряд других. Это соединение обладает противоопухолевой активностью благодаря своей способности стимулировать дифференцировку, индуцировать апоптоз ьс и подавлять пролиферацию клеток злокачественных новообразований. Быстрое приобретение резистентности к РК

и ее аналогам клетками солидных опухолей является одной из основных проблем, ограничивающих широкое применение естественных и синтетических ретиноидов в терапии злокачественных новообразований. Механизмы развития данной резистентности остаются до сих пор малопонятными.

Цель исследования - оценка связи уровня базальной экспрессии ядерного рецептора RARa и РК-индуцированной К экспрессии цитохромов С/Р26А1 и CYP26B1 с резистентностью клеток рака молочной железы к действию полностью

трансретиноевой кислоты.

Материалы и методы. Проведены культивирование клеточных линий, анализ чувствительности клеток рака молочной железы к действию полностью трансретиноевой кислоты, выделение РНК, обратная транскрипция и полимераз-^ ная цепная реакция в реальном времени.

Результаты. В данной работе с использованием экспериментальной модели, включающей 9 линий клеток рака >< молочной железы, различающихся по уровню чувствительности к РК, мы показали, что экспрессия матричной РНК

гена ядерного рецептора РК, RARa, а также уровень индукции матричной РНК генов цитохромов С/Р26А1 и С/Р26В1 в ответ на обработку РК коррелируют с РК-чувствительностью клеток.

Заключение. Таким образом, снижение экспрессии RARa и способности катаболизировать РК являются факторами, ассоциированными с РК-резистентностью клеток рака молочной железы.

Ключевые слова: полностью трансретиноевая кислота, рак молочной железы, RARa, CYP26A1, С/Р26В1, резистентность к ретиноевой кислоте

Для цитирования: Еникеев А.Д., Комельков А.В., Елкина Н.В. и др. Резистентность клеток рака молочной железы к полностью трансретиноевой кислоте ассоциирована со снижением базального уровня экспрессии ядерного рецептора RARa и индукцией экспрессии цитохромов С/Р26А1 и С/Р26В1. Успехи молекулярной онкологии 2022;9(2): 66-78. Э01: 10.17650/2313-805Х-2022-9-2-66-78.

BY 4.0

Resistance of breast cancer cells to all-trans retinoic acid is associated with a decrease in the basal level of nuclear receptor RARa expression and induction of cytochrome CYP26A1 and CYP26B1 expression

A.D. Enikeev, A. V. Komelkov, N. V. Elkina, M.E. Akselrod, S.A. Kuzmichev, E.M. Tchevkina

Research Institute of Carcinogenesis, N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia; 24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478, Russia

Contacts: Andrey Viktorovich Komelkov [email protected]

Introduction. Retinoic acid (RA) is a key regulator of cell differentiation and a critical player in such systemic processes in the body as embryonic development, immune system cell maturation and functioning, tissue remodeling and several others. This compound displays an antitumor activity due to its ability to stimulate differentiation, induce apopto-sis and inhibit proliferation of malignant cells. The rapid acquisition of resistance to RA and its analogues by solid tumor cells is one of the main problems limiting the widespread use of retinoids in the therapy of malignant neoplasms. The mechanisms of RA-resistance are still poorly understood.

The study objective - assessment of the relationship between the basal expression level of the nuclear RARa receptor and the RA-induced expression of the cytochromes CYP26A1 and CYP26B1 with the resistance of breast cancer cells to the action of all-trans-retinoic acid.

Materials and methods. Cell lines were cultured, the sensitivity of breast cancer cells to the action of fully trans-reti-noic acid, RNA isolation, reverse transcription reaction and real-time polymerase chain reaction were analyzed). Results. In present study, using an experimental model represented by 9 breast cancer cell lines with different level of sensitivity to RA, we showed that the expression of the RA nuclear receptor RARa, as well as the level of mRNA induction of CYP26A1 and CYP26B1 cytochromes in response to RA treatment correlate with RA-sensitivity. Conclusion. Thus, a decreaseof RARa expression as well as the reduced ability to catabolize RA are factors associated with RA-resistance of breast cancer cells.

Key words: all-trans retinoic acid, breast cancer, RARa, CYP26A1, CYP26B1, resistance to retinoic acid

For citation: Enikeev A. D., Komelkov A.V., Elkina N.V. et al. Resistance of breast cancer cells to all-trans retinoic acid is associated with a decrease in the basal level of nuclear receptor RARa expression and induction of cytochrome CYP26A1 and CYP26B1 expression. Uspekhi molekulyarnoy onkologii = Advances in Molecular Oncology 2022;9(2):66-78. (In Russ.). DOI: 10.17650/2313-805X-2022-9-2-66-78.

сч сч О СЧ

СЧ

>-

(J

о

—I

о и z о

ОС <

о ж.

to

< >

а

<

ВВЕДЕНИЕ

Внутриклеточная активность ретиноевой кислоты (РК) реализуется преимущественно за счет активации транскрипции ретиноид-респонсивных генов, к которым относятся регуляторы транспорта и метаболизма ретиноидов, в том числе самой РК (гены, кодирующие белки катаболизма ретинола (CRBP1/2), белки, связывающие РК в цитоплазме и транспортирующие ее в ядро (CRABP1/2), белки катаболизма РК (цитохро-мы CYP26) и др.), гормоны (например, гормон роста) и ферменты, вовлеченные в синтез стероидных гормонов (например, EDH17B2), мембранные рецепторы, различные молекулы, регулирующие состав внеклеточного матрикса (тканевой активатор плазминогена, ламинин B1, р3-интегрин и др.) [1, 2]. Также РК напрямую или опосредованно изменяет активность ключевых сигнальных путей и белков, задействованных в регуляции канцерогенеза и опухолевой прогрессии, таких как NF-kB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cell), ИНФу (интерферон у), TGFp (transforming growth factor P), VEGF (vascular endothelial growth factor) [3—5], AP-2 [6], Btg2 [7], гены каспаз 7 и 9, а также активирующих их сериновых про-теаз [5, 8] и других генов, вовлеченных в индукцию апоптоза. К таким генам относятся BIRC5 (сурвивин), Bcl-2 [9, 10], TRAIL (tumor necrosis factor-related apop-tosis-inducing ligand, или Apo-2L), а также C/EBP (epsilon) (CCAAT/enhancer binding protein), UBE1L (ubiq-uitin-activating enzyme E1-like protein) и др. Есть данные об РК-зависимом усилении экспрессии фактора транскрипции SOX9 и опухолевого супрессора PDCD4 [11, 12].

Ретиноевая кислота синтезируется в клетке из предшественников ретинола (витамина А) и его эфиров и существует в виде различных изомеров:

13-цис-РК, 9-цис-РК и полностью трансретиноевой кислоты (all-trans retinoic acid, ATRA). Последний является максимально представленной в клетке формой РК и обладает наибольшей транскрипционной активностью [13, 14]. Удаление избытков РК в клетке осуществляется путем ее катаболизма ферментами семейства P450 системы цитохромов, что приводит к образованию так называемых полярных метаболитов, которые являются физиологически менее активными соединениями. Наибольшей аффинностью к РК обладают цитохромы CYP26A1 и CYP26B1, которые связывают ATRA и другие изоформы РК в цитоплазме и катаболизируют ее до 4-OH-RA, 4-oxo-RA и других соединений, защищая клетку от избытка РК в цитоплазме и препятствуя ее попаданию в ядро [15, 16].

Транспорт РК в цитоплазме осуществляют белки семейства iLBP (intracellular lipid binding proteins), прежде всего CRABP1/2 (cellular retinoic acid-binding protein), а также FABP5 (fatty acid-binding protein), которые доставляют ее в ядро, где она взаимодействует с рецепторами, относящимися к семейству рецепторов стероидных и тиреоидных гормонов [17]. Ядерные рецепторы РК представляют собой лиганд-активируе-мые транскрипционные факторы. Взаимодействие с лигандом приводит к их активации, а также к стимуляции транскрипции генов, в промоторе которых имеются определенные последовательности — ретиноид-респонсивные элементы (retinoic acid response element, RARE). Основными типами рецепторов, связывающих РК, являются белки RAR (retinoic acid receptor), RXR (retinoid Х receptor), а также PPAR (peroxisomal proliferator-activated receptor). Максимально эффективным считается RARa, обладающий наибольшей аффинностью к РК. С рецепторами RAR связываются ATRA и 9-цис-РК. Лигандом RXR является 9-цис-РК.

о

а.

в;

£

о ж.

и >

сч сч О сч

сч

>-

и о

-J

о и Z

о

ОС <

о ж.

ю

< >

а

<

о

а. те

>

О

ж.

и >

Экспрессия рецепторов РК регулируется ими самими, что создает петли обратной связи, или другими рецепторами того же семейства, например ERa (estrogen receptor a) [13, 18-20].

Опухоль-супрессорная активность РК показана для многих типов опухолей. Эта кислота не только стимулирует дифференцировку [21-24], но и снижает пролиферативную активность опухолевых клеток [25, 26], активирует процесс апоптоза [27-29], а также подавляет ангиогенез [30, 31]. В клинической практике ATRA наиболее успешно используется в качестве основного препарата при терапии острого промиело-цитарного лейкоза [13, 32-36]. Прошли успешные клинические испытания применения ретиноидов в лечении некоторых форм Т-клеточной лимфомы [37]. Предпринимаются активные попытки использования ATRA и других природных и синтетических ретино-идов в терапии онкологических заболеваний, таких как саркома Капоши [38], плоскоклеточный рак головы и шеи [39], нейробластома [40] и др. [3, 13, 18, 41]. Однако эффективность ретиноидов в терапии большинства солидных опухолей ограничена прежде всего в связи с быстро развивающейся устойчивостью к ним [3, 42, 43].

Механизмы возникновения РК-резистентности до сих пор не до конца понятны. Существует множество гипотез, которые можно условно разделить на несколько основных групп. Согласно первой группе гипотез развитие РК-резистентности связано с ограничением биодоступности ретиноидов, которое происходит из-за снижения метаболизма ретинола, нарушения внутриклеточного транспорта ретинола и ретиноидов (в том числе самой РК), усиления их деградации или удаления из клетки [44]. Устойчивость к РК также может быть вызвана изменением РК-зави-симой транскрипции ретиноид-респонсивных генов, которая может реализовываться за счет «эпигенетического молчания» или подавления активности рецепторов РК, RARa, (возможно, и других) и/или кофакторов, активирующих или подавляющих РК-зависимую транскрипцию, таких как XAB2 [45], ZNF423 [46] или HDAC (вторая группа гипотез) [47]. Согласно гипотезам третьей группы развитие РК-резистентности обусловлено неканонической (негеномной) активностью РК, которая заключается в не зависящей от транскрипции активации белков, играющих ключевую роль в процессах малигнизации клеток. Так, считается, что РК способна регулировать активность МАР-киназ ERK1/2 и р38, а также антиапоптотической киназы AKT [48, 49], что приводит к усилению злокачественного потенциала клеток и вызывает развитие устойчивости к РК [50-53].

Несмотря на множество гипотез о механизмах формирования РК-резистентности, исследований, в которых бы сравнивались различные факторы, потенциально определяющие устойчивость клеток к РК, в рамках единой экспериментальной модели ранее

не проводилось. Недавно мы показали, что клетки рака молочной железы (РМЖ), в отличие от многих других типов эпителиальных опухолей, характеризуются широким диапазоном РК-чувствительности: от полной резистентности до высокой чувствительности [54]. Это обусловливает перспективность данной экспериментальной модели с точки зрения исследования механизмов РК-резистентности.

В данной работе мы впервые сравнили экспрессию основного ядерного рецептора РК RARa, а также ферментов катаболизма этой кислоты, CYP26A1 и CYP26В1, в клетках РМЖ с использованием панели из 9 клеточных линий, различающихся по уровню чувствительности к РК. Анализ показал наличие достоверных корреляций уровня РК-чувствительности с экспрессией матричной РНК (мРНК) гена RARa, а также с уровнем индукции мРНК генов CYP26A1 и CYP26В1 в ответ на инкубацию клеток с ATRA. Таким образом, для клеток РМЖ оба параметра — базальный уровень экспрессии ядерного рецептора РК RARa и степень активации ферментов катаболизма — являются факторами, ассоциированными с РК-резистентностью.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культивирование клеток. В работе были использованы 9 клеточных линий клеток РМЖ. Для культивирования клеток MCF7, MDA-MB-453, MDA-MB-468, MDA-MB-231 и HBL100 использовали среду DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) («ПанЭко», Россия), клеток T47D, SKBR3, HCC1954, HCC1937 - среду RPMI («ПанЭко», Россия). Культивирование проводили в стандартных условиях (37 °C, 5 % CO2) в присутствии глутамина (0,292 мг/мл), смеси пенициллина и стрептомицина (100 ед/мл и 100 мкг/мл соответственно) («ПанЭко», Россия), а также 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (Biological Industries, США).

Анализ чувствительности клеток к ретиноевой кислоте. Полностью трансретиноевую кислоту (Merck, США) растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) для приготовления стокового раствора в концентрации 10 мМ. Клетки высаживали в количестве 50300 тыс. в зависимости от клеточной линии и культивировали в течение 5 сут в присутствии ATRA в диапазоне концентраций 0,1-100 мкМ.

В связи с тем, что ATRA не является цитотоксиче-ским агентом [55], мы оценивали ее влияние на динамику пролиферации клеток, для чего строили кривые роста и сравнивали количество клеток в «нулевой» точке и после инкубации. Клетки снимали 0,25 % раствором трипсин-этилендиаминтетрауксусной кислоты (трипсин-ЭДТА), смешивали с красителем трипано-вый синий 1 : 1 и подсчитывали с помощью камеры Горяева. В качестве контроля для каждой линии использовали клетки, культивируемые параллельно в течение того же времени в среде без ATRA, содержащей ДМСО в соответствующей концентрации. Количество живых клеток в контроле для каждой линии принимали

за 100 %. Чувствительность к РК оценивали в 3 повторах для каждого из измерений, соответствующих каждой концентрации ATRA.

Для анализа уровня экспрессии генов в присутствии РК была выбрана концентрация ATRA, равная 1 мкМ, поскольку она была минимально эффективной в отношении влияния РК на пролиферацию клеток (средняя концентрация начала снижения пролиферации различных линий РК-чувствительных клеток). Клетки инкубировали с ATRA в течение 3 сут.

Выделение РНК. После 72 ч культивирования в стандартных условиях и в присутствии ATRA выделяли тотальную РНК из клеток методом тризольно-хлороформной экстракции с использованием TRI Reagent (Merck, США). Клетки снимали с чашки раствором Версена, осаждали центрифугированием (6 мин, 3600 об./мин), отбирали супернатант, к осадку добавляли 1 мл TRI Reagent и 200 мкл хлороформа и инкубировали 15 мин. После этого центрифугировали 15 мин при 13 200 об./мин, отбирали верхнюю фазу и растворяли ее в 200 мкл изопропанола, перемешивали на вортексе и инкубировали 15 мин. Затем центрифугировали 15 мин при 13 200 об./мин, отбирали супернатант, к осадку добавляли 750 мкл этилового спирта. После этого смесь центрифугировали 15 мин при 13 200 об./мин, отбирали супернатант, к осадку добавляли 50 мкл ddH20. Очистку РНК от примесей ДНК проводили с помощью фермента DNAse I, Amplification Grade (Invitrogen, США). К 2000 нг РНК добавляли 1 ед ДНКазы и инкубировали 15 мин при 25 оС, фермент инактивировали добавлением 1 мкл 25 мМ EDTA при 65 оС в течение 10 мин.

Обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция в реальном времени. Для получения комплементарной ДНК (кДНК) использовали 2000 нг тотальной РНК и проводили реакцию обратной транскрипции с использованием MMLV-ревертазы (в конечной концентрации 5 ед/мкл), случайного декануклеотидного праймера (20 мкМ) («Евроген», Россия). Реакцию проводили при 37 oC в течение 50 мин.

К 100 нг кДНК добавляли по 500 нМ смеси прай-меров (см. таблицу), реакционную смесь для полиме-разной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) в присутствии SYBR-green («Евроген», Россия) и проводили амплификацию в режиме: 95 °С, 15 с; 57 °С, 15 с; 72 °С, 30 с — 42 цикла. Относительный уровень экспрессии мРНК RARa оценивали с помощью расчета dCt для каждой линии. Нормализацию проводили по количеству ПЦР-продукта гена RPL27. Изменение экспрессии мРНК CYP26A1, CYP26B1 при обработке ATRA вычисляли методом ddCt.

Статистическая обработка данных. Все данные были получены в ходе 3 независимых экспериментов. Данные представлены в виде среднего со стандартным отклонением (SD). Для статистической оценки данных использовали двухвыборочный t-критерий Стью-дента для зависимых и независимых выборок, крите-

рий Манна—Уитни, анализ дисперсии (ANOVA) для сравнения нескольких групп (с посттестом Даннетта). Для оценки трендов (значимости изменений переменной в ряду) применяли вариант ANOVA с проведением линейного анализа трендов. Различия считались статистически значимыми при р <0,05. Для проведения расчетов и построения графиков использовали программы GraphPad 8.3 (GraphPad Software, США) и SPSS 26.0 (IBM, США).

Последовательности использованных праймеров для проведения поли-

меразной цепной реакции в реальном времени

Sequences of primers used in real-time polymerase chain reaction

Ген Gene Последовательность Sequence

RPL27 Прямой: ACCGCTACCCCCGCAAAGTG Forward: ACCGCTACCCCCGCAAAGTG Обратный: CCCGTCGGGCCTTGCGTTTA Reverse: CCCGTCGGGCCTTGCGTTTA

RARa Прямой: GGACATTGACCTCTGGGACA Forward: GGACATTGACCTCTGGGACA Обратный: AAGG TCATGGTGTCCTGCTC Reverse: AAGG TCATGGTGTCCTGCTC

CYP26A1 Прямой: CCAGAAAGTGCGAGAAGAGC Forward: CCAGAAAGTGCGAGAAGAGC Обратный: GTCTTCAGAGCAACCCGAAA Reverse: GTCTTCAGAGCAACCCGAAA

CYP26B1 Прямой: GCTGCATGATGAGTGAGGTG Forward: GCTGCATGATGAGTGAGGTG Обратный: CAGGGCAAGGACTACTTGGA Reverse: CAGGGCAAGGACTACTTGGA

РЕЗУЛЬТАТЫ

Корреляция экспрессии ядерного рецептора RARa с чувствительностью клеток рака молочной железы к ре-тиноевой кислоте. Ранее мы показали, что линии клеток РМЖ в значительной степени различаются по уровню чувствительности/резистентности к РК, что позволяет использовать эти клетки в качестве удобной экспериментальной модели для выявления молекулярных характеристик и факторов, связанных с РК-резистентностью. Так, анализ 9 клеточных линий РМЖ показал, что РК оказывает выраженный анти-пролиферативный эффект на клетки линий MCF7, T47D, SKBR3 и HCC1954. Снижение пролиферации в 2 и более раз наблюдалось при инкубации с ATRA уже в концентрации 0,1—1 мкМ. В то же время пролиферация РК-резистентных клеток (линии MDA-MB-453, MDA-MB-468, MDA-MB-231, HBL100, HCC1937) не снижалась даже при инкубации с ATRA в концентрации 10—20 мкМ. Таким образом, выраженные различия между линиями наблюдались в диапазоне 1-10 мкМ.

На основании полученных данных мы разделили исследуемые линии клеток на 2 группы, достоверно различающиеся по уровню пролиферации в присутствии

сч сч о сч

сч

>-

из о

—I

о и Z

о

ОС <

о ж

ю ш и

Z <

>

а

<

о

а.

в;

£

о ж.

и >

сч сч О сч

сч

>-

и о

-J

о и Z

о

ОС <

о ж

ю

< >

а

<

*p <0,05. **p <0,001

О

а. те

>

О

ж.

и >

100

о

* 50

SKBR3 T47D MCF7 HCC1954 MDA-MB-453 HCC1937 MDA-MB-468 HLB100 MDA-MB-231

Клеточные линии / Cell lines

Рис. 1. Сравнение динамики пролиферации клеток рака молочной железы при инкубации с полностью трансретиноевой кислотой (ATRA). Указано количество живых клеток (%) после 5 сут культивирования в присутствии 10 мкМ ATRA по сравнению с контролем. Контроль: за 100 % взято количество живых клеток каждой линии после культивирования в течение того же времени в стандартной среде DMEM с добавлением диметилсульфоксида в концентрациях, соответствующих таковым при разведении ATRA. Диаграммы построены на основании средних значений для 3независимых повторов эксперимента (p <0,001, дисперсионный анализ (ANOVA) с использованием посттеста Даннетта) Fig. 1. Comparing the dynamics of breast cancer cell proliferation during their incubation with all-trans retinoic acid (ATRA). Proportion of viable cells (%) after 5-day cultivation with 10 ^M ATRA compared to control. Control: the number of living cells of each line after their cultivation in a standard DMEM medium during the same time with dimethyl sulfoxide added instead of ATRA (same concentration) was considered as 100 %. The diagrams are based on the mean values for 3 independent repeats of the experiment (p <0.001, analysis of variance (ANOVA) followed by Dunnett's post-hoc test)

ATRA (p <0,001). В качестве порогового значения была выбрана концентрация 10 мкМ. Сравнение динамики пролиферации клеток РМЖ при инкубации с ATRA представлены на рис. 1. Также важно, что пороговая концентрация ATRA для разделения линий на РК-чувствительные и РК-резистентные выбрана нами произвольно. В действительности клетки можно расположить в некий ряд по чувствительности к РК, на одном конце которого будут максимально чувствительные, а на другом - максимально резистентные линии. Так, в группе РК-резистентных клеток выделяют линии, динамика пролиферации которых не менялась по сравнению с контролем даже при инкубации с 50 мкМ ATRA (HBL100, MDA-MB-231). Среди РК-чувствительных линий НСС1954 характеризовалась наименьшей чувствительностью к РК и даже демонстрировала значимые различия при сравнении с другими линиями данной группы (p <0,01). Тем не менее при использовании концентрации ATRA 10 мкМ клеточные линии хорошо подразделялись на РК-чув-ствительные и РК-резистентные (см. рис. 1).

Сравнительный анализ экспрессии RARа, проведенный методом обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени, выявил выраженные и достоверные различия между группой РК-чувствительных и РК-ре-

зистентных клеток (p <0,001) (рис. 2, а). Клетки, чувствительные к РК, характеризовались более высоким уровнем мРНК RARa по сравнению с клетками, резистентными к РК. При расчете разницы в экспрессии RARa между группами РК-чувствительных и РК-резис-тентных линий методом ddCt (delta delta Cycle threshold) выявлено снижение экспрессии в группе резистентных клеточных линий в 5,1 раза (рис. 2, б). Показатель ddCt вычисляли путем вычитания из полученных значений dCt для резистентных клеточных линий значений dCt для чувствительных линий. Относительное изменение экспрессии (разы) рассчитывали как 2-ddCt. Самый высокий уровень мРНК RARa был детектирован в наиболее чувствительных к РК линиях T47D и SKBR3, а линия НСС1954, в которой отмечено наименьшее снижение среди РК-чувствительных клеток пролиферации при обработке ATRA, характеризовалась значимо меньшим уровнем экспрессии RARa по сравнению с другими РК-чувствительными линиями (p <0,05).

Была также подтверждена гипотеза о наличии значимого тренда (линейной зависимости уменьшения экспрессии RARa от снижения РК-чувствительности (p <0,05) в группе чувствительных к РК клеточных линий. Таким образом, в данных клеточных линиях

0

*p <0,05

10

у 5

*p <0,001

MCF7 HCC1954 MDA-MB-453 HCC1937 MDA-MB-468 HLB100 MDA-MB-231

Клеточные линии / Cell lines

10

У 5

1

Чувствительные линии / Резистентные линии / Sensitive cell lines Resistant cell lines

сч

СЧ

о

СЧ

СЧ

>-

(J

о

—I

о и z о

ОС <

Рис. 2. Анализ экспрессии гена RARa в клетках рака молочной железы с различной чувствительностью к ретиноевой кислоте (РК): а — относительная экспрессия RARa в линиях РК-чувствительных и РК-резистентных клеток. dCt — разница между Ct RARa и Ct референсного гена RPL27 (внутренний контроль). При увеличении значения dCt экспрессия уменьшается (p <0,05; дисперсионный анализ (ANOVA) с использованием посттеста Даннетта); б — сравнение относительной экспрессии гена RARa в группах РК-чувствительных и РК-резистентных клеточных линий. Средние значения dCt в данных группах значимо различались (p <0,001; критерий Манна—Уитни)

Рис. 2. Analysis of RARa expression in breast cancer cells with different sensitivity to retinoic acid (RA): а — relative RARa expression in RA-sensitive and RA-resistant cell lines. dCt — difference between RARa Ct andRPL27(referencegene) Ct (internal control). Expression decreases as dCt increases (p <0.05; analysis of variance (ANOVA) followed by Dunnett's post-hoc test); б — comparison of relative RARa expression between RA-sensitive and RA-resistant cell lines. There was a significant difference in mean dCt between these groups (p <0,001; Mann—Whitney Utest)

О Ж

to

< >

a

<

20 -,

15

Ы 10

I

P

I

I

I

1

l I

I

9 8

I

I I

I

I

CYP26A1 | | CYP26B1

О

a.

в;

о ж.

и >

MCF7 T47D SKBR3 HCC1954 MDA-MB-453 HCC1937

Клеточные линии / Cell lines

MDA-MB-468 HLB100

MDA-MB-231

Рис. 3. Соотношение относительной экспрессии CYP26A1 и CYP26B1 при отсутствии полностью трансретиноевой кислоты в клетках чувствительных и резистентных к ретиноевой кислоте линий. Результаты представлены в виде значений dCt для каждого гена. Разрыв в данных для линии SKBR3 обозначает, что экспрессия CYP26A1 достоверно не детектировалась

Fig. 3. CYP26A1/CYP26B1 relative expression ratio in the absence of all-trans retinoic acid in retinoic acid-sensitive and resistant cell lines. Results are shown as dCt values for each gene. A gap in the data for the SKBR3 line indicates that the expression of CYP26A1 was not reliably detected

а

0

0

T47D

5

0

экспрессия ЯЛЯа изменялась сонаправленно с уровнем РК-чувствительности.

Обнаруженная нами корреляция уровня мРНК ВЛЯа с РК-чувствительностью и сонаправленное изменение этих характеристик в ряду исследуемых линий указывает на то, что снижение экспрессии ВЛЯа происходит параллельно со снижением РК-чувстви-

тельности и может быть одним из механизмов формирования РК-резистентности клеток РМЖ.

Высокий уровень активации экспрессии цитохромов CYP26A1 и С1Г26В1, чувствительных к РК клеток, при инкубации с ретиноевой кислотой. Для проверки гипотезы о связи возникновения РК-резистентности с экспрессией основных ферментов, ответственных за деградацию

сч сч о сч

сч

>-

и о

-J

о и Z

о

ОС <

о ж

ю

< >

а

<

о

а. те

>

О

ж.

и >

РК, был проведен анализ уровней мРНК СУР26А1 и СУР26В1 в клетках рассматриваемой панели линий РМЖ. Результаты анализа базального уровня экспрессии не выявили достоверных различий между группами РК-чувствительных и РК-резистентных линий как для СУР26А1, так и для СУР26В1. В целом при отсутствии РК экспрессия СУР26А1 была достаточно низкой, особенно в некоторых РК-чувствительных линиях. А в наиболее чувствительной линии SKBR3 она практически отсутствовала: детекция сигнала происходила уже за пределами диапазона достоверности значений ПЦР-реакции (>40 циклов). Экспрессия СУР26В1 была выше, чем СУР26А1, практически во всех линиях, и это соотношение не было связано с РК-чувствитель-ностью/резистентностью (рис. 3).

Поскольку экспрессия цитохромов индуцируется в ответ на добавление субстрата, далее мы исследовали уровень активации экспрессии генов СУР26А1 и СУР26В1 в ответ на добавление ATRA. Для этого сравнивались уровни мРНК СУР26А1 и СУР26В1 в стандартных условиях культивации и после инкубации с 1 мкМ ATRA. Данная концентрация ATRA соответствовала началу снижения пролиферации всех РК-чувствительных клеток, но вместе с тем еще не приводила к выраженному подавлению роста максимально РК-чувствительных линий (SKBR3). Таким образом, мы оценивали ранние молекулярные изменения, возникающие под действием ATRA. Результаты рассчитывались по методике ddCt, что соответствует разнице между уровнями мРНК исследуемых генов до и после обработки ATRA. Изменения уровней активации экспрессии СУР26А1 и СУР26В1 в ответ на действие ATRA в клетках всех исследуемых линий, выраженные в относительных единицах (разы), по сравнению с экспрессией в отсутствие ATRA, приведены на рис. 4, а и 4, б соответственно.

Согласно данным, представленным на рис. 4, РК-чувствительные линии характеризовались значительно большей индукцией СУР26А1 по сравнению с группой РК-резистентных линий (р <0,001). Это означает, что клетки, чувствительные к РК, способны эффективнее катаболизировать эту кислоту при увеличении ее внутриклеточной концентрации. В случае СУР26В1 разница в индукции экспрессии между РК-чувстви-тельными и РК-резистентными линиями была не настолько ярко выражена, как в случае СУР26А1, однако тоже была статистически значимой (р <0,02).

Согласно полученным данным РК-резистентные клетки характеризуются, с одной стороны, значимо более низким уровнем экспрессии рецептора ВАЯа, что может ограничивать реализацию транскрипционной активности РК, а с другой стороны — меньшим уровнем активации экспрессии цитохромов в ответ на обработку ATRA. Полученные результаты указывают на то, что резистентные клетки защищаются от ан-типролиферативной опухолесупрессорной активности РК за счет снижения проведения РК-зависимой

внутриклеточной сигнализации (уменьшения экспрессии RARa). В то же время они утрачивают способность быстро индуцировать катаболизм РК, что может быть, скорее, результатом, чем причиной РК-рези-стентности. Иными словами, опухолевые клетки в меньшей степени «опасаются» возрастания концентрации РК и, соответственно, увеличения ее опухоль-супрессорной активности, если являются РК-рези-стентными.

ОБСУЖДЕНИЕ

Ретиноевая кислота является наиболее активным внутриклеточным ретиноидом (производным ретинола, витамина А), роль которого в стимуляции диффе-ренцировки и апоптоза, а также в снижении пролифе-ративной активности показана для многих типов клеток и тканей. Несмотря на очевидный успех применения РК в лечении гематопролиферативных заболеваний, терапия солидных опухолей на основе ретиноидов в качестве агентов для монотерапии или комбинированной терапии не показала высокой эффективности или обладала кратковременным эффектом. Подробно результаты этих исследований представлены в обзоре R.M. Connolly и др. [3].

Ограничение клинического применения РК в основном связано с быстрым развитием РК-рези-стентности клеток опухолей. Несмотря на многочисленные исследования, направленные на поиск причин и путей преодоления устойчивости к РК, механизмы ее возникновения до сих пор малопонятны. Это объясняется сложностью многоуровневых взаимодействий в системе внутриклеточного ретиноевого сигна-линга. В процессах поддержания баланса РК внутри клеток задействовано множество белков, осуществляющих внутриклеточный транспорт и метаболизм ретинола и ретиноидов. Процессы, предшествующие образованию РК (ретинол-ретиналь-РК), обратимы и находятся в динамическом равновесии. Также обратимы и реакции перехода различных стереоизомеров самой РК: 9-цис-РК и 13-цис-РК могут изомеризо-ваться в ATRA и наоборот, хотя первый процесс встречается чаще, поскольку ATRA, как уже говорилось, является наиболее транскрипционно активным изомером РК [14, 56, 57].

Следующим уровнем регуляции ретиноевого сиг-налинга является доставка РК к ядерным рецепторам, которая осуществляется белками CRABP1/2 и FABP4/5. Предполагается, что основным транспортером РК, способствующим проведению ее транскрипционной активности, выступает белок CRABP2. Функции CRABP1 на сегодняшний день не до конца понятны, но, возможно, он удерживает РК в цитоплазме, ограничивая ее попадание в ядро и тем самым препятствуя проведению РК-зависимого сигналинга. Данные некоторых исследований указывают на то, что этот белок способствует активации цитохромов CYP26 и катаболизму РК [58-62]. Вместе с тем есть свидетельства

100 -

Y

и

и

и <Г

ш ^

О. Рч|

и

X ^

m ^ ф о

s о, и та ф с и а

ш -с

50

*p <0,001

сч сч о сч

сч

>-

из о

—I

о и Z

о

ос <

о 2

ю

< >

а

<

SKBR3 T47D MCF7 HCC1954 MDA-MB-453 HCC1937 MDA-MB-468 HLB100 MDA-MB-231

Клеточные линии / Cell lines

ш

50

20

s &

S 5

и

ш со

ср

1= ^

u S-

m О

g 15

e та n

w а

s -с m V

s "О ш "о о U:

10

SKBR3

T47D

—I—

MCF7

*p <0,02

о

а.

в;

£

о 2

о >

HCC1954 MDA-MB-453 HCC1937 MDA-MB-468 HLB100 MDA-MB-231 Клеточные линии / Cell lines

а

0

б

0

Рис. 4. Относительная экспрессия генов CYP26A1 и CYP26B1 после инкубации с полностью трансретиноевой кислотой (ATRA) в РК-чувстви-тельных и РК-резистентных клеточных линиях: а — относительная экспрессия CYP26A1. Разрыв в данных для линии SKBR3 характеризует ситуацию, когда экспрессия CYP26A1 сильно (более чем в 100раз) увеличивается после обработки ATRA при отсутствии достоверной детекции экспрессии в стандартных условиях культивации (p <0,001; дисперсионный анализ (ANOVA) с использованием посттеста Даннетта); б — относительная экспрессия CYP26B1. Разрыв данных для линии MCF7характеризует ситуацию, когда экспрессия CYP26B1 после обработки ATRA увеличивается сильнее (более чем в 50 раз), чем в остальных линиях (p <0,02; дисперсионный анализ (ANOVA) с использованием посттеста Даннетта) Fig. 4. Relative expression of CYP26A1 and CYP26B1 genes in RA-sensitive and RA-resistant cell lines after their incubation with all-trans retinoic acid (ATRA): а — relative CYP26A1 expression. A gap in the data for the SKBR3 line indicates that CYP26A1 expression has dramatically increased (more than 100-fold change) after ATRA treatment, while baseline expression in standard conditions could not be reliably detected (p <0.001; analysis of variance (ANOVA) followed by Dunnett's post-hoc test); б — relative expression of CYP26B1. A gap in the data for the MCF7 line indicates that CYP26B1 expression after ATRA treatment has increased more significantly (more than 50-fold change) than in other lines (p <0.02; analysis of variance (ANOVA) followed by Dunnett's post-hoc test)

сч сч О сч

сч

>-

и о

-J

о и Z

о

ОС <

о ж

ю

< >

а

<

о

а. те

>

О

ж.

и >

повышения уровня CYP26A1 в ответ на высокие дозы РК при подавлении CRABP1 [63]. В нескольких работах показана возможная связь белка CRABP1 с РК-ре-зистентностью [63, 64], однако эти данные получены на кератиноцитах или клетках плоскоклеточного эпителия. Выявлена роль белка CRABP2 в регуляции РК-чувствительности для клеток РМЖ линии MCF7. Так, гиперэкспрессия CRABP2 усиливала, а подавление экспрессии снижало чувствительность данных клеток к РК [65]. Однако проведенный нами ранее анализ экспрессии белков CRABP1 и CRABP2 на описанной модели из 9 линий клеток РМЖ не выявил достоверной корреляции с чувствительностью к РК [54].

Белки, связывающие РК, транспортируют ее в ядро, где передают RAR, RXR и PPAR, с помощью которых реализуется транскрипционная активность ретиное-вой кислоты [18]. Важно отметить, что РК-связываю-щие белки обладают избирательностью в отношении доставки РК к определенным рецепторам. Так, предполагается, что CRABP2 транспортирует ее для взаимодействия с RAR и RXR, а FABP4/5 - для связывания с PPAR в/5. Взаимодействие РК с различными рецепторами приводит, по-видимому, к активации транскрипции разных генов и, даже возможно, к противоположному эффекту в отношении роста и выживания клеток [66].

RARp считается опухолевым супрессором. Его экспрессия в опухолях часто снижена [67, 68] в связи с метилированием промотора и изменениями структуры хроматина [69]. Эпигенетическое «молчание» данного белка может быть одним из механизмов возникновения РК-резистентности [70]. Важно отметить, что экспрессия RARp регулируется белком RARa. Опухоль-супрессорная функция RARp (подавление пролиферации и стимуляция апоптоза) также, по-видимому, осуществляется с помощью активации RARa. Так, РК-связанный RARa взаимодействует с последовательностью RARE в промоторе RARp, что приводит к активации его транскрипции и последующей трансактивации экспрессии множества генов, задействованных в регуляции апоптоза, пролиферации и диф-ференцировки [3].

Таким образом, ядерные рецепторы RAR могут быть факторами, определяющими РК-чувствитель-ность клеток. Эта гипотеза была проверена в данной работе. Сравнение экспрессии RARa в РК-чувстви-тельных и РК-резистентных клетках РМЖ показало достоверную корреляцию уровня мРНК данного гена с РК-чувствительностью. Более того, было выявлено, что снижение экспрессии RARa происходит сонаправ-ленно с уменьшением РК-чувствительности в ряду исследуемых клеточных линий. Полученные нами данные согласуются с результатами работы, выполненной на клетках РМЖ с различным гормон-рецеп-торным статусом. Авторы показали, что подавление RARa приводит к снижению РК-чувствительности клеток SKBR3. Также была выявлена коамплифика-

ция RARa с рецептором ERBB2, что указывает на связь РК-чувствительности с экспрессией как RARa, так и эстрогеновых рецепторов [71]. Эти же авторы показали, что RARfi играет большую роль в возникновении РК-чувствительности клеток РМЖ HCC1599 и MB-157, которая реализуется, в частности, за счет активации Notch1-зависимого сигнального пути. Было обнаружено, что подавление RARв приводит к устойчивости данных клеток к действию РК [72].

Есть и другие свидетельства участия рецепторов RAR в развитии РК-чувствительности: так, в РК-ре-зистентных линиях клеток рака пищевода T-1 и T-8 экспрессия генов RARfi подавлена, в то время как РК-чувствительные линии T-2, T-3, T-7, T-12 и T-13 экс-прессируют RARfi на высоком уровне [73]. На клетках нейробластомы - одного из наиболее чувствительных к терапии РК типов солидных опухолей - показано, что проапоптотическая функция РК связана с протео-сомной деградацией RARa, а гиперэкспрессия RARa в клетках нейробластомы приводит к повышению их чувствительности к РК [74].

Еще одним регулятором активности РК и потенциальным фактором, вовлеченным в формирование РК-резистентности, является система ее катаболизма, представленная преимущественно цитохромами семейства P450 и белками CYP26. Деградация ATRA осуществляется преимущественно CYP26A1 и CYP26B1, хотя предполагается, что и другие представители данного семейства, такие как CYP3A4 и CYP2C8, могут участвовать в катаболизме ATRA и 13-цис-РК [75]. Хотя исследований, посвященных анализу связи экспрессии белков CYP26 с РК-чувствительностью опухолевых клеток, очень мало, есть гипотеза о том, что усиление катаболизма РК способствует РК-резистент-ности. На этом основании даже предпринимаются попытки повысить эффективность терапевтического эффекта РК с помощью фармацевтического подавления CYP26 параллельно с назначением ATRA.

В этих целях проводились испытания целого ряда соединений, блокирующих метаболизм РК (retinoic acid metabolism-blocking agents (RAMBAs)) [75, 76]. Однако это не привело к преодолению РК-резистент-ности, что объясняется рядом причин: разнообразием цитохромов, способных катаболизировать в той или иной степени различные изомеры РК (которые, как уже говорилось, могут переходить друг в друга), а также наличием большого количества петель обратной связи, регулирующих экспрессию ретиноид-ре-спонсивных генов (к которым относятся и цитохромы CYP26). Примером такой связи является упомянутое выше возрастание уровня CYP26A1 в ответ на высокие дозы РК при подавлении CRABP1 [63].

Проведенный в данной работе анализ экспрессии CYP26A1 и CYP26B1 не выявил корреляции между уровнями мРНК данных генов в стандартных условиях культивации и чувствительностью клеток к РК. При этом экспрессия CYP26B1 была выше, чем экспрессия

CYP26A1, практически во всех линиях. При добавлении ATRA она возрастала, причем уровень этой индукции, особенно CYP26A1, был достоверно выше в РК-чувствительных клеточных линиях. То, что CYP26B1 продемонстрировал активацию экспрессии в меньшей степени, чем CYP26A1, связано, по-видимому, с более высоким базальным уровнем мРНК CYP26B1. Неожиданным результатом было то, что РК-чувствительные клетки продемонстрировали больший уровень индукции CYP26. Ожидалось, что в резистентных клетках катаболизм РК будет, наоборот, выше, что означало бы, что способность деградировать РК является фактором, способствующим развитию РК-резистент-ности. Полученные же результаты указывают на то, что РК-резистентные клетки, скорее, утрачивают или снижают способность катаболизировать РК. Однако они согласуются с данными довольно давно опубликованной работы B.J.M. Van Der Leede и соавт., которая была выполнена также на клетках РМЖ и показала, что индукция метаболизма РК происходит именно в РК-чувствительных клетках [77].

Согласно нашей гипотезе по мере приобретения РК-резистентного фенотипа утрачивается внутриклеточный баланс РК. Мы предполагаем, что в РК-чув-ствительных клетках происходит достаточно активный синтез РК из предшественников благодаря активности ферментов метаболизма ретинола и ретиналя. Это более нормальное состояние клеток, при котором факторы синтеза и катаболизма РК сбалансированы — клетки синтезируют ее, проводят РК-зависимую сигнализа-

цию и, в то же время, способны быстро удалить РК в случае ее избытка с помощью активации экспрессии СУР26. Резистентные к РК клетки ограничивают проведение ретиноевого сигналинга с помощью подавления рецепторов RAR и других механизмов, к которым, вероятно, относится и нарушение синтеза РК. Такие клетки «не ожидают» присутствия высокой концентрации РК, и, даже если ее концентрация искусственно повышается, она им «неопасна», т. е. не приводит к снижению пролиферации, как это происходит в случае РК-чувствительных клеток. Поэтому РК-резистент-ные клетки снижают эффективность системы катаболизма РК, что выражается в уменьшении индукции экспрессии СУР26 в ответ на искусственное увеличение концентрации РК. Проверка данной гипотезы требует дальнейших исследований, которые будут способствовать пониманию механизмов формирования РК-резистентности и повышению эффективности терапии злокачественных солидных опухолей на основе натуральных и синтетических ретиноидов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, экспрессия ядерного рецептора ретиноевой кислоты, ВЛЯа, а также уровень активации экспрессии цитохромов СУР26Л1 и СУР26В1 в ответ на обработку ATRA коррелируют с чувствительностью к РК клеток РМЖ. Полученные данные способствуют лучшему пониманию внутриклеточных механизмов формирования резистентности клеток РМЖ к терапии на основе ретиноидов.

сч сч о сч

сч

>-

из о

—I

о и Z

о

ОС <

о ж

ю

< >

а

<

о

а.

в;

£

ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES

о ж.

1. Rhinn M., Dolle P. Retinoic acid signalling during development. Development 2012;139(5):843-58. DOI: 10.1242/dev.065938.

2. Theodosiou M., Laudet V., Schubert M. From carrot to clinic: an overview

of the retinoic acid signaling pathway. Cel Mol Life Sci 2010;67(9):1423-45. DOI: 10.1007/s00018-010-0268-z.

3. Connolly R.M., Nguyen N.K., Sukumar S. Molecular pathways: current role and future directions of the retinoic acid pathway in cancer prevention and treatment.

Clin Cancer Res 2013;19(7):1651-9. DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-12-3175.

4. Zhang H., Rosdahl I. Expression profiles of p53, p21, bax and bcl-2 proteins

in all-trans-retinoic acid treated primary and metastatic melanoma cells. Int J Oncol 2004;25(2):303-8.

5. Mrass P., Rendl M., Mildner M. et al. Retinoic acid increases the expression of p53 and proapoptotic caspases

and sensitizes keratinocytes to apoptosis: a possible explanation for tumor preventive

action of retinoids. Cancer Res

2004;64(18):6542-8.

DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-04-1129.

6. Luscher B., Mitchell P.J., Williams T., Tjian R. Regulation of transcription factor AP-2 by the morphogen retinoic acid and by second messengers. Genes Dev 1989;3(10):1507-17.

DOI: 10.1101/gad.3.10.1507.

7. Donato L.J., Suh J.H., Noy N. Suppression of mammary carcinoma cell growth by retinoic acid: The cell cycle control gene Btg2 is a direct target

for retinoic acid receptor signaling. Cancer

Res 2007;67(2):609-15.

DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-06-0989.

8. Donato L.J., Noy N. Suppression

of mammary carcinoma growth by retinoic acid: Proapoptotic genes are targets for retinoic acid receptor and cellular retinoic acid-binding protein II signaling. Cancer Res 2005;65(18):8193-9. DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-05-1177.

9. Pratt M.A.C., Niu M., White D. Differential regulation of protein

expression, growth and apoptosis by natural and synthetic retinoids. J Cell Biochem 2003;90(4):692-708. DOI: 10.1002/jcb.10682.

10. Raffo P., Emionite L., Colucci L. et al. Retinoid receptors: pathways

of proliferation inhibition and apoptosis induction in breast cancer cell lines. Anticancer Res 2000;20(3A):1535-43.

11. Afonja O., Raaka B.M., Huang A. et al. RAR agonists stimulate SOX9 gene expression in breast cancer cell lines: Evidence for a role in retinoid-mediated growth inhibition. Oncogene 2002;21(51):7850-60.

DOI: 10.1038/sj.onc.1205985.

12. Afonja O., Juste D., Das S. et al. Induction of PDCD4 tumor suppressor gene expression by RAR agonists, antiestrogen and HER-2/neu antagonist in breast cancer cells. Evidence for a role in apoptosis. Oncogene 2004;23(49):8135-45.

DOI: 10.1038/sj.onc.1207983.

13. Bushue N., Wan Y.-J.Y. Retinoid pathway and cancer therapeutics. Adv Drug Deliv

U >

сч сч О сч

сч

>-

и о

-J

о и Z

о

ОС <

о ж

ю

< >

а

<

о

а. те

>

О

ж.

и >

Rev 2010;62(13):1285-98. DOI: 10.1016/j.addr.2010.07.003.

14. O'Byrne S.M., Blaner W.S. Retinol and retinyl esters: Biochemistry and physiology. J Lipid Res 2013;54(7):1731-43.

DOI: 10.1194/jlr.R037648.

15. Thatcher J.E., Buttrick B., Shaffer S.A. et al. Substrate specificity and ligand interactions of CYP26A1, the human liver retinoic acid hydroxylase. Mol Pharmacol 2011;80(2):228-39.

DOI: 10.1124/mol.111.072413.

16. Stevison F., Jing J., Tripathy S., Isoherranen N. Role of retinoic acid-metabolizing cytochrome P450s, CYP26, in inflammation and cancer. Adv Pharmacol 2015;74:373-412.

DOI: 10.1016/bs.apha.2015.04.006.

17. Tchevkina E.M. Retinoic acid binding proteins and cancer: similarity or polarity? Cancer Ther Oncol Int J 2017;8(2). Available at: https://juniperpublishers. com/ctoij/pdf/CTOIJ.MS.ID.555733.pdf.

18. Soprano D.R., Qin P., Soprano K.J. Retinoic acid receptors and cancers. Annu Rev Nutr 2004;24(1):201-21.

DOI: 10.1146/annurev. nutr.24.012003.132407.

19. Ross-Innes C.S., Stark R., Holmes K.A. Cooperative interaction between retinoic acid receptor-alpha and estrogen receptor in breast cancer. Genes Devel 2010;24(2):171-82. DOI: 10.1101/ gad.552910.

20. Garattini E., Bolis M., Garattini S.K. et al. Retinoids and breast cancer: from basic studies to the clinic and back again. Cancer Treat Rev 2014;40(6):739-49. DOI: 10.1016/j.ctrv.2014.01.001.

21. Breitman T.R., Selonick S.E., Collins S.J. Induction of differentiation of the human promyelocytic leukemia cell line (HL-60) by retinoic acid. Proc Nat Acad Sci USA 1980;77(5):2936-40.

DOI: 10.1073/pnas.77.5.2936.

22. Spinella M.J., Kerley J.S., White K.A., Curtin J.C. Retinoid target gene activation during induced tumor cell differentiation: human embryonal carcinoma as a model.

J Nutr 2003;133(1):273S-6S. DOI: 10.1093/jn/133.1.273S.

23. Huang Y., Boskovic G., Niles R.M. Retinoic acid-induced AP-1 transcriptional activity regulates B16 mouse melanoma growth inhibition and differentiation. J Cell Physiol 2003;194(2):162-70.

24. Gudas L.J., Wagner J.A. Retinoids regulate stem cell differentiation. J Cell Physiol 2011;226(2):322-30.

DOI: 10.1002/jcp.22417.

25. Singh B., Murphy R.F., Ding X.-Z. et al. On the role of transforming growth factor-beta in the growth inhibitory effects

of retinoic acid in human pancreatic cancer cells. Mol Cancer 2007;6:82. DOI: 10.1186/1476-4598-6-82.

26. Wu S., Donigan A., Platsoucas C.D. et al. All-trans-retinoic acid blocks cell cycle

progression of human ovarian adenocarcinoma cells at late G1. Exp Cell Res 1997;232(2):277-86. DOI: 10.1006/excr.1997.3495.

27. Pfahl M., Piedrafita F.J. Retinoid targets for apoptosis induction. Oncogene 2003;22(56):9058-62.

28. Sadikoglou E., Magoulas G., Theodoropoulou C. et al. Effect

of conjugates of all-trans-retinoic acid and shorter polyene chain analogues with amino acids on prostate cancer cell growth. Eur J Med Chem 2009;44(8):3175-87. DOI: 10.1016/j.ejmech.2009.03.029.

29. Lee J.H., Yoon J.H., Yu S.J. et al. Retinoic acid and its binding protein modulate apoptotic signals in hypoxic hepatocellular carcinoma cells. Cancer Lett 2010;295(2):229-35.

30. Kini A.R., Peterson L.A., Tallman M.S., Lingen M.W. Angiogenesis in acute promyelocytic leukemia: induction

by vascular endothelial growth factor and inhibition by all-trans retinoic acid. Blood 2001;97(12.):3919-24. DOI: 10.1182/blood.v97.12.3919.

31. Kim M.S., Kim Y.K., Eun H.C. et al. All-trans retinoic acid antagonizes UV-induced VEGF production and an-giogenesis via the inhibition of ERK activation in human skin keratinocytes.

J Invest Dermatol 2006;126(12):2697-706. DOI: 10.1038/sj.jid.5700463.

32. Degos L. All-trans-retinoic acid treatment and retinoic acid receptor alpha gene rearrangement in acute promyelocytic leukemia: a model for differentiation therapy. Int J Cell Cloning 1992;10(2):63-9. DOI: 10.1002/stem.5530100202.

33. Dvorak C.C., Sanders R.P., Dahl G.V.H. et al. Reinduction of relapsed acute promyelocytic leukemia with ATRA and low dose antimetabolite-based chemotherapy. Pediatr Blood Cancer 2007;48(5): 582-5. DOI: 10.1002/pbc.20592.

34. Ahmad Tali M., Bashir Y., Bhat S. et al. Pseudotumour cerebri in acute promyelocytic leukemia on treatment with all-trans-retinoic acid (ATRA) -an experience from a tertiary care centre. Malays J Pathol 2015;37(2):141-4.

35. Degos L., Wang Z.Y. All trans retinoic acid in acute promyelocytic leukemia. Oncogene 2001;20(49):7140-5.

DOI: 10.1038/sj.onc.1204763.

36. Fenaux P., Wang Z.Z., Degos L. Treatment of acute promyelocytic leukemia by retinoids. Curr Top Microbiol Immunol 2007;313:101-28.

DOI: 10.1007/978-3-540-34594-7_7.

37. Duvic M., Hymes K., Heald P. et al. Bexarotene is effective and safe for treatment of refractory advanced-stage cutaneous t-cell lymphoma: multinational phase II—III trial results. J Clin Oncol 2001;19(9):2456-71.

DOI: 10.1200/JCO.2001.19.9.2456.

38. Caselli E., Galvan M., Santoni F. et al. Retinoic acid analogues inhibit human herpesvirus 8 replication. Antivir Ther 2008;13:199-209.

39. Khuri F.R., Lippman S.M., Spitz M.R.

et al. Molecular epidemiology and retinoid chemoprevention of head and neck cancer. J Nat Cancer Ins 1997;89(3):199-211. DOI: 10.1093/jnci/89.3.199.

40. Zuccari G., Carosio R., Fini A. et al. Modified polyvinylalcohol for encapsulation of all-trans-retinoic acid in polymeric micelles. J Control Release 2005;103(2): 369-80. DOI: 10.1016/j.jconrel.2004.12.016.

41. Garattini E., Gianni M., Terao M. Retinoids as differentiating agents

in oncology: a network of interactions with intracellular pathways as the basis for rational therapeutic combinations. Curr Pharmac Design 2007;13(13):1375-400. DOI: 10.2174/138161207780618786.

42. Lippman S.M., Meyskens F.L.J. Treatment of advanced squamous cell carcinoma of the skin with isotretinoin. Ann Int Med 1987;107(4):499-502. DOI: 10.7326/0003-4819-107-4-499.

43. Altucci L., Gronemeyer H. The promise of retinoids to fight against cancer. Nat Rev Cancer 2001;1(3):81-93.

DOI: 10.1038/35106036.

44. Chlapek P., Slavikova V., Mazanek P. et al. Why differentiation therapy sometimes fails: Molecular mechanisms of resistance to retinoids. Int J Mol Sci 2018;19(1):132. DOI: 10.3390/ijms19010132.

45. Ohnuma-Ishikawa K., Morio T. et al. Knockdown of XAB2 enhances all-trans retinoic acid-induced cellular differentiation in all-trans retinoic acid-sensitive and -resistant cancer cells. Cancer Res 2007;67(3):1019-29.

DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-06-1638.

46. Huang S., Laoukili J., Epping M.T. et al. ZNF423 Is Critically required for retinoic acid-induced differentiation and is a marker of neuroblastoma outcome Cancer Cell 2009;15(4):328-40.

DOI: 10.1016/j.ccr.2009.02.023.

47. Cheung B.B., Tan O., Koach J. et al. Thymosin-ß4 is a determinant of drug sensitivity for Fenretinide and Vorinostat combination therapy in neuroblastoma. Mol Oncol 2015;9(7):1484-500.

DOI: 10.1016/j.molonc.2015.04.005.

48. Masia S., Barettino D., de Lera A.R., Alvarez S. Rapid, nongenomic actions

of retinoic acid on phosphatidylinositol-3-kinase signaling pathway mediated by the retinoic acid receptor. Mol Endocrinol 2007;1(10):2391-402. DOI: 10.1210/me.2007-0062.

49. Alsayed Y., Uddin S., Mahmud N. et al. Activation of Rac1 and the p38 mitogen-activated protein kinase pathway

in response to all-trans-retinoic acid. The Journal of biological chemistry. 2001;276(6):4012-9. DOI: 10.1074/jbc.M007431200.

50. García-Regalado A., Vargas M., García-Carrancá A. et al. Mol Cancer 2013;12:44. DOI: 10.1186/1476-4598-12-44.

51. Quintero Barceinas R.S., García-Regalado A., Aréchaga-Ocampo E. et al. All-trans retinoic acid induces proliferation, survival, and migration

in A549 lung Cancer cells by activating the ERK signaling pathway through a transcription-independent mechanism. BioMed Res Int 2015;2015:404368. DOI: 10.1155/2015/404368.

52. Еникеев А.Д., Kомельков A.B., Зборовская И.Б. и др. Неканоническая активность ретиноевой кислоты в отношении активации протеинкиназ

в трансформированных клетках различного происхождения. Успехи молекулярной онкологии 2018;5(4):127—30. [Enikeev A.D., Komelkov A.V., Zborovskaya I.B. et al. Non-canonical activity of retinoic acid in relation to the activation of protein kinases in transformed cells of different origin. Advances in Molecular Oncology 2018;5(4):127-130. (In Russ.) DOI: 10.17650/2313-805X-2018-5-4-127-30. (In Russ.)].

53. Piskunov A., Rochette-Egly C. A retinoic acid receptor RARa pool present

in membrane lipid rafts forms complexes with G protein aQ to activate p38MAPK. Oncogene 2012;31:3333-45.

54. Enikeev A.D., Komelkov A.V.,

Axelrod M.E. et al. CRABP1 and CRABP2 protein levels do not correlate with the sensitivity of breast cancer cells to retinoic acid, but correlate with each other with CRABP2 being an upstream regulator of CRABP1 production. Biochemistry 2021;2(86):259-73. DOI: 10.1134/S0006297921020103.

55. Centritto F., Paroni G., Bolis M. et al. Cellular and molecular determinants of all-trans retinoic acid sensitivity

in breast cancer: Luminal phenotype and RARa expression. EMBO molecular medicine 2015;7(7):950-72. DOI: 10.15252/emmm.201404670.

56. Moise A.R., Noy N., Palczewski K., Blaner W.S. Delivery of retinoid-based therapies to target tissues. Biochemistry 2007;46(15):4449-58.

DOI: 10.1021/bi7003069.

57. Januchowski R., Wojtowicz K., Zabel M. The role of aldehyde dehydrogenase (ALDH) in cancer drug resistance. Biomed Pharmacother 2013;67(7):669-80. DOI: 10.1016/j.biopha.2013.04.005.

58. Boylan J.F., Gudas L.J. The level

of CRABP-I expression influences the amounts and types of all-trans-retinoic acid metabolites in F9 teratocarcinoma

stem cells. J Biol Chem 1992;267(30): 21486-91.

59. Fiorella P.D., Napoli J.L. Expression of cellular retinoic acid binding protein (CRABP) in Escherichia coli. Characterization and evidence

that holo-CRABP is a substrate in retinoic acid metabolism. J Biol Chem 1991;266(25):16572-9.

60. Noy N. Retinoid-binding proteins: mediators of retinoid action. Biochem J 2000;348(Pt 3):481-95.

61. Napoli J.L. Interactions of retinoid binding proteins and enzymes in retinoid metabolism. Biochim Biophys Acta 1999;1440(2-3):139-62.

DOI: 10.1016/s1388-1981(99)00117-1.

62. Napoli J., Posch K., Fiorella P., Boerman M. Physiological occurrence, biosynthesis and metabolism of retinoic acid: evidence for roles of Cellular Retinol-Binding Protein (CRBP) and Cellular Retinoic Acid-Binding Protein (CRABP)

in the pathway of retinoic acid homeostasis. Biomed Pharmacother 1991;45(4-5):131-43. DOI: 10.1016/0753-3322(91)90101-x.

63. Liu R.Z., Garcia E., Glubrecht D.D. et al. CRABP1 is associated with a poor prognosis in breast cancer: Adding

to the complexity of breast cancer cell response to retinoic acid. Mol Cancer 2015;14(1):129. DOI: 10.1186/s12943-015-0380-7.

64. Tang X.-H., Vivero M., Gudas L.J. Overexpression of CRABPI in suprabasal keratinocytes enhances the proliferation of epidermal basal keratinocytes in mouse skin topically treated with all-trans retinoic acid. Exp Cell Res 2008;314(1):38-51. DOI: 10.1016/j.yexcr.2007.07.016.

65. Budhu A.S., Noy N. Direct channeling of retinoic acid between cellular retinoic acid-binding protein II and retinoic acid receptor sensitizes mammary carcinoma cells to retinoic acid-induced growth arrest. Mol Cell Biol 2002;22(8):2632-41. DOI: 10.1128/MCB.22.8.2632-2641.2002.

66. Schug T.T., Berry D.C., Shaw N.S. et al. Opposing effects of retinoic acid on cell growth result from alternate activation of two different nuclear receptors. Cell 2007;129(4):723-73.

DOI: 10.1016/j.cell.2007.02.050.

67. Widschwendter M., Berger J., Daxenbichler G. et al. Loss of retinoic acid receptor ß expression in breast cancer and morphologically normal adjacent tissue but not in the normal breast tissue distant from the cancer. Cancer Res 1997;57(19):4158-61.

68. Mehrotra J., Vali M., McVeigh M. et al. Very high frequency of hypermethylated

genes in breast cancer metastasis to the bone, brain, and lung. Clin Cancer Res 2004;10(9):3104-9. DOI: 10.1158/1078-0432.ccr-03-0118.

69. Sirchia S.M., Ferguson A.T., Sironi E. et al. Evidence of epigenetic changes affecting the chromatin state of the retinoic acid receptor beta2 promoter in breast cancer cells. Oncogene 2000;19(12):1556-63.

DOI: 10.1038/sj.onc.1203456.

70. Sirchia S.M., Ren M., Pili R. et al. Endogenous reactivation of the RARbeta2 tumor suppressor gene epigenetically silenced in breast cancer. Cancer Res 2002;62:2455-61.

71. Paroni G., Fratelli M., Gardini G. et al. Synergistic antitumor activity of lapatinib and retinoids on a novel subtype of breast cancer with coamplification of ERBB2 and RARA. Oncogene 2012;31(29):3431-43. DOI: 10.1038/onc.2011.506.

72. Paroni G., Zanetti A., Barzago M.M. et al. Retinoic acid sensitivity of triple-negative breast cancer cells characterized by constitutive activation of the notch1 pathway: the role of rarß. Cancers 2020;12(10):1-23.

DOI: 10.3390/cancers12103027.

73. Xu X.C., Liu X., Tahara E. et al. Expression and up-regulation of retinoic acid receptor-ß is associated with retinoid sensitivity and colony formation

in esophageal cancer cell lines. Cancer Res 1999;59(10):2477-83.

74. Nagai J.I., Yazawa T., Okudela K. et al. Retinoic acid induces neuroblastoma cell death by inhibiting proteasomal degradation of retinoic acid receptor a. Cancer Res 2004;64(21):7910-7.

DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-04-1178.

75. Nelson C., Buttrick B., Isoherranen N. Therapeutic potential of the inhibition

of the retinoic acid hydroxylases CYP26A1 and CYP26B1 by xenobiotics. Curr Top Med Chem 2013;13(12):1402-8. DOI: 10.2174/1568026611313120004.

76. Diaz P., Huang W., Keyari C.M., Buttrick B. et al. Development and characterization of novel and selective inhibitors of cytochrome P450 CYP26A1, the human liver retinoic acid hydroxylase. J Med Chem 2016;59(6):2579-95. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.5b01780.

77. Van Der Leede B.J.M., Van Den Brink C.E., Pijnappel W.W.M. et al. Autoinduction

of retinoic acid metabolism to polar derivatives with decreased biological activity in retinoic acid-sensitive, but not in retinoic acid-resistant human breast cancer cells. J Biol Chem 1997;272(29):17921-8. DOI: 10.1074/jbc.272.29.17921.

СЧ СЧ

о

СЧ

СЧ

>-

(J

о

—I

о и z о

ОС <

о ж

to

< >

а

<

о m

а.

в;

£ m

о ж.

и >

О

см

см Вклад авторов

^ А.Д. Еникеев: анализ чувствительности опухолевых клеток к ретиноевой кислоте, анализ экспрессии мРНК CYP26A1, CYP26B1, RAR ; А.В. Комельков: статистический анализ данных;

Н.В. Елкина: подбор специфических праймеров и оптимизация условий полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени; ^ М.Е. Аксельрод: работа с культурами клеток;

С.А. Кузьмичев: выделение РНК, анализ литературы по теме статьи; ID Е.М. Чевкина: разработка дизайна исследования, анализ результатов, написание текста статьи.

О

О Ж

> m

о ж.

U >

Authors' contribution

O A.D. Enikeev: analysis of cells' sensitivity to retinoic acid, analysis of mRNA expression of CYP26A1, CYP26B1, RAR ;

A.V. Komelkov: statistical data analysis; © N.V. Elkina: selection of specific primers and optimization of conditions of real time RT-PCR; OC M.E. Axelrod: working with cell cultures;

S.A. Kuzmichev: RNA isolation, literature analysis on the topic of the article; 3 E.M. Tchevkina: study design, analysis of results, article writing.

ORCID авторов / ORCID of authors

А.Д.Еникеев / A.D. Enikeev: https://orcid.org/0000-0002-7628-8616 Н.В. Елкина / N.V. Elkina: https://orcid.org/0000-0002-0503 ^ А.В. Комельков / A.V. Komelkov: https://orcid.org/0000-0003-0766- 163X 00 М.Е. Аксельрод / M.E. Axelrod: https://orcid.org/0000-0003-2778-7870 £ С.А. Кузьмичев / S.A Kuzmichev: https://orcid.org/0000-0003-1660-0898

Z Е.М. Чевкина / E.M. Tchevkina: https://orcid.org/0000-0001-8837-7969 <

О Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. < Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

_ Финансирование. Исследование выполнено при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 19-015-00027A).

5 Financing. The study was supported by the Russian Foundation for Basic Research (project No. 19-015-00027A).

i_

О

те

о

ы

а. те

Статья поступила: 09.12.2021. Принята к публикации: 12.02.2022. Article submitted: 09.12.2021. Accepted for publication: 12.02.2022.