CC BY
154
резистентность HELICOBACTER PYLORI к кларитромицину в новосибирске
га
v Ü
Осипенко М.Ф., Бикбулатова Е.А., Шакалите Ю.Д., Чернова Л.Н., Устинов С.Н, Куликов И.В., Максимов В.Н.
Новосибирский государственный медицинский университет, МСЧ МВД, НИИ терапии СО РАМН
с
га ^
Осипенко Марина Федоровна
E-mail: ngma@bk.ru
резюме
Эффективность эрадикационной терапии определяется несколькими факторами, один из которых — чувствительность Helicobacter pylori (Нр) к антибиотикам. Нами проведено исследование резистентности Нр к кларитромицину как препарату, входящему в схему эрадикации первой линии. Мутации Нр A2142G и A2143G были обнаружены в трех образцах слизистой оболочки желудка из 50 образцов Нр-позитивных пациентов. Таким образом, резистентность к кларитромицину составила 6%, что ниже среднероссийских показателей.
summary
Efficiency of eradication therapy is defined by several factors, one of which is sensitivity of Hp to antibiotics. We researched the resistance of Helicobacter pylori (Нр) to clarithromycin. The mutations of Hp (A2142G and A2143G) were found in three samples of gastric biopsy material from 50 Hp-positivity patients. Thus, resistance to clarithromycin is about 6% in Novosibirsk, so we can use the scheme of eradication with clarithromycin.
В последнее десятилетие наблюдается существенный прогресс в лечении заболеваний верхних отделов желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), прежде всего за счет успешной эрадикации Helicobacter pylori (Нр). Эффективность эрадикационной терапии варьирует в различных регионах мира от 30 до 90% [1] и определяется рядом факторов, одним из которых является резистентность микроорганизма к антибактериальным препаратам. Согласно Маастрихтским рекомендациям I-IV, основными антибактериальными препаратами при лечении Нр-ассоциированных заболеваний являются: амоксициллин, кларитроми-цин, метронидазол, препараты висмута, тетрациклин [2]. Обязательным компонентом эрадикационной схемы первой линии является кларитромицин.
Кларитромицин — это 14-членный полусинтетический макролидный антибиотик, который благодаря липофильности легко проникает в слизистую оболочку желудка. Существует несколько механизмов формирования резистентности к кла-ритромицину [3,4]: модификация мишени (метилирование рибосом, мутации в рРНК, мутации в рибосомальных белках L4, L16, L22), активное выведение антибиотика из бактерии (эффлюкс-помпа), ферментативная инактивация.
Метилирование рибосом — самый распространенный механизм устойчивости к кларитромицину. Под действием белков-метилаз происходит диметилирование аденина в V домене 23S рРНК 508-субъединицы рибосомы, в результате чего нарушается связывание макролидов с мишенью действия [5].
Современные методы определения чувствительности к антибиотикам подразделяются на методы серийных разведений (в агаре и бульоне, метод микроразведений), диффузионные (дискодиффу-зионный метод и метод Е-тестов) и молекулярные методы [1; 4]. Молекулярно-генетические методы подразделяются на методы гибридизации с олиго-нуклеотидными зондами, методы анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР-ПДРФ) и методы ПЦР в реальном времени. Наиболее часто применяются тесты, основанные на амплификации 23S рРНК или гибридизации (FISH-анализ) [1; 5].
В целом доля H. pylori, резистентного к терапии кларитромицином, увеличивается, что делает целесообразным и необходимым проведение анализа чувствительности к антибиотикам H. pylori в регионе [3].
LH
материал и методы исследования
Методом случайной выборки было обследовано 50 больных с Нр-ассоциированными заболеваниями, направленных на ФГДС с синдромом диспепсии врачами поликлиники в МСЧ МВД России. Из них 34 (68%) мужчин и 16 (32%) женщин. Хронический антральный гастрит был выявлен у 31 (62%) больного, язвенная болезнь желудка или двенадцатиперстной кишки — у 19 (38%). У 39 (78%) обследованных эрадикация Нр ранее не проводилась, у 11 (22%) ранее проведенная эрадикация первой линии на основе кларитромицина и амоксициллина была неэффективна. Наличие возбудителя Нр было подтверждено с помощью световой микроскопии, непосредственно после забора материала (биоптат слизистой оболочки желудка и цитологическое исследование). Для исследования резистентности биоптаты были заморожены и хранились при температуре -20° в 0,9%-ном физиологическом растворе.
Экстракция ДНК проводилась методом фенол-хлороформной экстракции. Детекцию мутаций А2142С и А2143С в гене 238 рРНК микроорганизма проводили методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (К.БЬР). Для проведения полимеразной цепной реакции использовали следующие праймеры: прямой праймер: 5,-АООТТААОАООАТОСОТСАОТС-3' и обратный праймер 5'-СОСАТОАТАТТСССАТТАОСАОТ-3' [6].
Смесь для ПЦР обьемом 25 мкл включала: 100 ДНК, 1ЧРСК. буфер, 0,2 мол/л каждого прай-мера, 0,2 ммол/л каждого dNTP, 1,5 ммол/л М§С12 и 1 ед. Та§ полимеразы. Амплификация проводилась в следующем температурном режиме: 95 ° С/50 с, 63 ° С/50 сек, 72 ° С/50 с — 33 цикла.
Визуализация продукта ПЦР длинной 267 последовательностей нуклеотидов (п. н.) проводилась в 4%-ном полиакриламидном геле с последующей окраской бромистым этидием. Для определения мутации А2142С использовали рестриктазу бз1у21, для определения мутации А2143С использовали фермент Бзо 311. Рестрикция проводилась согласно протоколу фирмы изготовителя («Сибэнзим»). Продукты рестрикции идентифицировали в 6%-ном полиакриламидном геле. В случае мутации А2142С определялись продукты длинной 24 и 243 п. н., для мутации А2142С определялись продукты рестрикции длинной 33 и 234 п. н.
результаты исследования
Согласно приводимой методике было проанализировано 50 биоптатов. Мутация А2142С была обнаружена в одном образце, мутации А2143С были обнаружены в двух образцах (рис. 1).
Все резистентные к кларитромицину штаммы Нр были выявлены у первичных больных, ранее не получавших эрадикационную терапию (рис. 2).
Среди 11 пациентов, у которых проводимая ранее эрадикация Нр была неэффективна, резистентные штаммы не выявлены, следовательно, причина неудачи связана с другими факторами, наиболее распространенный из которых — это низкий ком-плайнс [7].
обсуждение полученных
результатов
Выявленные в исследовании мутации A2143G и A2142G наряду с А2142С относятся к самым распространенным мутациям Hp. В большинстве случаев Нр содержит два 23S рРНК гена и мутации обнаруживаются в обеих копиях [1; 8]. Применение метронидазола в схемах эрадикации ограничено вследствие высокой резистентности к нему Н. pylori, средний уровень ее по России составляет 55% [9]. Устойчивость H. pylori к амоксициллину в отличие от метронидазола крайне низкая. В большинстве стран устойчивые штаммы не встречаются или их доля не превышает 1% [8].
С учетом редкого использованием метронидазола при эрадикации и низкой резистентности Нр к амоксициллину в значительной степени прогноз эрадика-ционной терапии определяется чувствительностью микроорганизма к кларитромицину как препарату, входящему в состав схем первой линии терапии хе-ликобактериоза [9]. Согласно 3-му Маастрихтскому соглашению, использование кларитромицина имеет смысл только в том случае, если первичная устойчивость к этому антибиотику составляет менее 15-20%.
Распространенность кларитромицин-резистент-ных штаммов H. pylori в значительной степени варьирует между странами и регионами. По данным проспективного многоцентрового исследования в 22 центрах 17 стран Европы уровень устойчивости H. pylori к кларитромицину составил в среднем 9,9% [10]. В 2005 году процент резистентных к кларитромицину штаммов в Москве составил 19,3% [10]. В 2010 году в Москве точечные мутации в позиции A2143G гена 23S рРНК H. pylori, ассоциированные с резистентностью к кларитромицину, выявлены у 14,5% больных [11].
выводы
Таким образом, резистентность к кларитромицину в Новосибирске, по нашим данным, составила 6%, что ниже среднероссийских показателей. При этом резистентные штаммы не выявлены ни у одного пациента, получавшего ранее эрадикационную терапию на основе кларитромицина. Все сказанное выше делает предпочтительным применение в Новосибирске схем лечения Нр на основе кларитромицина с достаточно высоким ожидаемым эффектом от эрадикационной терапии. Методы мо-лекулярно-генетического анализа позволят в дальнейшем выявлять резистентные штаммы, определять динамику их распространенности и прогнозировать эффективность эрадикационной терапии.
IS >
о О
О Я < S 0 5
Я й
Q О И U id
mal а
Q го с|
и га
L
IS
га
ü
ш j
S I-0 ш с га а ш
I-
Рис. 1. Наличие мутации А 21420 и А 21430у пациентов с хроническим гастритом (1) и язвенной болезнью (2).
Рис. 2. Наличие мутаций Нр к кларитромицину у первичных пациентов (1) и получавших эрадикационную терапию ранее (2).
литература
1. Саблин О.А., Ильчишина Т.А. Проблема резистентности Helicobacter pylori к кларитромицину // Consilium medicum. Гастроэнтерология. — 2009. — № 3. — С. 4-8.
2. Malfertheiner P., Megraud F., O/Morgan C. et al. Current concept in the management of Helicobacter pylori infection: the Maastricht III Consensus report // Gut. — 2007. — V.56.
3. Рачина С.А., СтрачунскийЛ.С., Козлов Р.С. Кларитромицин: есть ли потенциал для клинического использования в XXI веке // Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. — 2005. — № 7 (4). — С. 369-392.
4. Lee J., Shin J., Roe I. et al. Impact of clarithromycin resistance on eradication of Helicobacter pylori in infected adults // Antimicrob. Agents Chemother. — 2005. — № 4. — Р. 1600-1603.
5. Стецюк О.У., Андреева И.В. О селекции устойчивости к макролидам // Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. — 2010. — № 12 (3). — С. 255-259.
6. Megraud F., Lehours P. Helicobacter pylori detection and antimicrobial susceptibility testing // Clin. Microbiol. Rev. — 2007. — Vol. 20. — P. 280-322.
7. Осипенко М.Ф., Бикбулатова Е.А., Константинов В.И. Комплайнс: определяющие факторы и пути оптимизации приверженности к лечению // Сиб. мед. обозрение: ежекв. мед. журн. — 2010. — N 5. — С. 94-97.
8. Mograud F. H. pylori antibiotic resistance: prevalence, importance, and advances in testing // Gut. — 2004. — № 53. — Р. 1374-1384.
9. Glupczynski Y., Megroud F., Lopez-Brea M. et at. European multicenter survey of in vitro antimicrobial resistance in Helicobacter pylori // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. — 2000. — Vol. 11. — P. 820-823.
10. Лапина Т.Л. Выбор схемы эрадикационной терапии при Helicobacter pylori в случае необходимости повторного лечения // Врач. — 2008. — № 4. — С. 64-67.
11. Belousova N.L., Lazebnik L.B., Bordin D.S., Miheeva O.M. Moscow study of frequency of site-specific mutations in the 23S rRNA gene of Helicobacter pylori: preliminary data // Turkish J. Gastroenterol. — 2011. — Vol. 22, suppl. 1. — Р. 23.
