CC BY
531
Обзоры
ОБЗОРЫ
Резидентные клетки предшественники в сердце и регенерация миокарда
КА. Рубина, B.C. Мелихова*, Е.В. Парфенова Факультет фундаментальной медицины МГУ им. Ломоносова Российский кардиологический научно-производственный комплекс Институт экспериментальной кардиологии
ООО «Генная и клеточная терапия»
Resident Cardiomyocyte Precursors and Myocardium Regeneration
K.A. Rubina. VS. Melikhova, E.V. Parfenova Moscow State University, Faculty of Medicine Russian Cardiology Research and Production Center Institute of Experimental Cardiology «Gene and Cellular Therapy» Ltd
В обзоре представлена история развития взглядов на возможности регенерации сердечной мышечной ткани. Обсуждены современные данные о существовании и функционировании резидентных клеток-предшественников кардиомиоцитов.
Ключевые слова: сердце, миокард, стволовые клетки сердца.
Введение
Сердечно сосудистые заболевания продолжают лидиро вать в списке по количеству смертельных исходов во всех промышленно развитых странах. Сердечная недостаточность, вызываемая ишемической болезнью сердца (ИБС) или кар диомиопатиями (КМП), является одной из главных проблем здоровья взрослого населения. Поэтому для пациентов с тя желой сердечной недостаточностью, у которых традиционное лечение неэффективно или имеет противопоказания, разра батываются альтернативные лечебные подходы. В связи с этим в медицине появился ряд новых методов, стимулирую щих регенеративные процессы, которые сегодня можно ус ловно разделить на 3 большие группы: введение рекомби нантных белков и пептидов (факторов роста); генная терапия (введение плазмидных или вирусных генных конструктов, ко дирующих терапевтические белки); и введение клеток раз личного происхождения (как системно, так и локально).
Наиболее часто сердечная недостаточность возникает в результате острого инфаркта миокарда. При инфаркте миокарда (ИМ) последовательно происходят процессы воспаления, некротической и апоптотической гибели кар диомиоцитов (КМЦ), гиперплазии и ремоделирования как инфарцированного, так и здорового участка миокарда. Ин фарктная зона представлена вначале некротическими мае сами по центру очага инфаркта и апоптотической массой гибнущих кардиомиоцитов по периферии. Постепенно по раженная зона растягивается и подвергается рубцеванию, а непораженные участки гипертрофируются и затем дилати руются, адаптируясь к новым условиям функционирования. Микроскопически наблюдается удлинение и истончение
* Адрес для корреспонденции: Varvara Melikhova zv20@yandex.ru
The review represents development of different views on the potential of cardial muscle tissue regeneration as well as up-to-date data on existence and functioning of resident precursors of cardiomyocyte s.
Key words: heart, myocardium, cardiac stem cells.
КМЦ, увеличение расстояния между кардиомиоцитами, миокардиофиброз [1]. Отсутствие выраженной способности КМЦ взрослых млекопитающих к самообновлению до недав него времени являлось общепризнанным фактом: КМЦ не пролиферируют, а замещение дефекта сердечной мышцы происходит без их участия, в основном за счет пролифера ции клеток стромы (фибробластов) (2). Через 1 2 месяца зона инфаркта полностью замещается ригидной фиброзной тка нью, лишенной сократительных элементов, с преобладанием белков внеклеточного матрикса коллагена и эластина.
Целью восстановительной терапии после ИМ, как пра вило, служит стимуляция регенерации сердечной мышцы, частичное или полное восстановление способности к сокра щению, стимуляции ангиогенеза в поврежденном участке и периинфарктной зоне, предотвращение повторных случаев инфаркта или других нарушений деятельности сердца.
Долгое время считалось, что клеточная репаративная регенерация миокарда невозможна, именно поэтому серд це не восстанавливает нормальную функцию после ишеми ческого состояния. Известно, что практически все органы во взрослом организме имеют популяцию клеток предше ственников, способных к самообновлению и отвечающих за тканевый гомеостаз в норме и репарацию органа при по вреждении. Существование таких групп клеток показано в костном мозге [3, 4], печени (5), подкожной жировой ткани [6], эпителии кишечника (7), эпидермисе [8] и т. д.
Взрослое сердце млекопитающих рассматривалось как орган, построенный преимущественно из КМЦ, находящихся в пост митотическом состоянии и не имеющий эндогенной популяции стволовых клеток. В миокарде находится отно сительно постоянное число КМЦ, прекращающих деление после рождения. Считается, что этот жизненно необходимый орган не может восстанавливать потери функционально
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 1, 2007
Обзоры
активной клеточной массы, которая сопровождает инфаркт миокарда, другие повреждения миокарда и нарушения кро вообращения. В ответ на функциональный стресс сердце может лишь увеличивать свою мышечную массу (миокард) за счет клеточной гипертрофии, но не гиперплазии.
Если в сердце не происходит восстановление своей структуры из за отсутствия сколько нибудь значимой по пуляции клеток предшественников, то каким же образом сердце выполняет свою сократительную функцию десяти летиями?
В литературе имеются указания на две гипотезы, объяс няющие длительное поддержание миокардом нормальной сократительной функции, посредством не внутриклеточных, а клеточных механизмов, каждая из которых имеет экспе риментальные подтверждения (рис. 1):
1 вероятно, регенеративные процессы все таки проис ходят в миокарде за счет резидентных клеток, которые могут вступать в митотический цикл уже во взрослом организме при повреждении, или слияния клеток предшественников (из КМ) с существующими КМЦ (32, 34);
2 за счет хоуминга циркулирующих прогениторных клеток из КМ, что было показано при пересадке женского донорского сердца мужчине с последующим выявлением ло кализации КМЦ, несущих У хромосому, и этих же клеток в коронарных сосудах в пересаженном сердце (9, 10]. Т.е. клетки реципиента мигрировали и приживались в донорской ткани, формируя эндотелий и гладкомышечные клетки (ГМК) сосудов.
Таким образом, клетки, способные дифференцировать ся в КМЦ во взрослом сердце предположительно могут брать свое начало из:
циркулирующих в крови клеток предшественников, коммитированных в соответствующем кардиомиоцитарном направлении;
реплицирующихся предсуществующих КМЦ (предше ственников КМЦ, оставшихся в миокарде после эмбриоге неза, или стволовых клеток сердца);
сочетанием двух вышеуказанных механизмов, а также слиянием клеток предшественников с миоцитами сердца.
Способы клеточной и генной терапии инфаркта миокарда
За последние 20 лет было разработано несколько спосо бов терапии сердечно сосудистых заболеваний с использо ванием генных и клеточных технологий. Основными целями новых методик были: улучшение сократительной функции сердца, уменьшение размеров постинфарктного рубца и предшествующего некроза, улучшение трофики миокарда путем стимуляции неоангиогенеза, предотвращения повтор ных инфарктов. Для достижения этих целей были использо ваны различные типы клеток и генных конструкций: собствен ные изолированные клетки костного мозга (мезенхимальные негемопоэтические) (11—13], гемапоэтические [14], а так же эндотелиальные клетки предшественники (15, 16], клет ки предшественники, циркулирующие в кровотоке, стро мально сосудистая фракция из подкожной жировой клетчатки (17], скелетные миобласты (миосателлитоциты) (18, 19]. Кроме того, использовали факторы роста, стиму лирующие выход предшественников из костного мозга (20]; генные конструкции и факторы, стимулирующие ангиогенез, а также трансформированные клетки, несущие гены ан гиогенеза (21]. В данный момент некоторые из описанных
Рис. 7. Взгляды на репаративную регенерацию миокарда
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, № 1, 2007
Обзоры
способов применения CK в кардиологии находятся на III ста диях клинических испытаний.
Также есть сообщения о том, что сам процесс развития ишемии и формирования рубца в миокарде способствует выходу эндотелиальных предшественников в кровоток в соответствии с повышением уровня G CSF в крови. На этом основаны первые клинические испытания этого фактора, демонстрирующие его безопасность, однако не свиде тельствующие о его эффективности [22], в исследовании также описываются возможные побочные эффекты такой терапии. В процессе также участвует стромальный фактор роста (Stromal derived factor 1 ), отвечающий за рекрути рование эндотелиальных предшественников в область ишемии [23].
Пересадка ген модифицированных клеток
и генных конструкций
Основной целью генотерапевтических подходов является стимуляция ангиогенеза и ограничение зоны постинфарк тного рубца. В основном, работы в этом направлении были посвящены введению генных конструкций (плазмид) с пос ледовательностями, кодирующими VEGF сосудистый эндотелиальный фактор роста и VEGF R рецептор сосу дистого эндотелиального фактора роста, а также снижение экспрессии TGFß трансформирующего ростового фактора ß, стимулирующего формирование рубца [24, 25].
Трансплантация CD34^ клеток, трансфицированных плазмидой, несущей ген, кодирующий VEGF2, через неделю после экспериментального инфаркта у крыс, вызывала выход ЭПК из КМ и способствовала улучшению васкуляризации по раженного участка. Кроме того, продукт активности гена способствовал выживанию самих клеток, подавляя каспаз ный путь апоптоза [26].
Однако введение плазмидного вектора не слишком эф фективно, т.к. степень трансфекции клеток миокарда, как правило, не превышает 10% [27]. Одним из выходов можно считать использование аденоассоциированных вирусных переносчиков [28]. Основным препятствием, ограничиваю щим применение вирусных переносчиков, является частое развитие иммунного ответа на вирусные белки.
Репаративная регенерация миокарда
Известно, что миокард человека не обладает достаточ ной способностью к восстановлению, однако существует несколько групп животных, способных после различных на рушений восстанавливать миокард естественным способом без формирования рубца.
Прежде всего, речь идет об амфибиях. Тритоны облада ют удивительной способностью к регенерации поврежден ной ткани сердца. Так, без формирования рубца происходит восстановление поврежденного миокарда за счет активной пролиферации собственных КМЦ животного [29].
Аквариумная рыба Darío rerío (zebrafish), характеризуется тем, что регенерация их сердца представляет собой наиболее удобную модель для изучения молекулярных и генетических механизмов, лежащих в основе нормальной регенерации. После хирургического удаления верхушки желудочка серд ца и быстрого образования тромба было зафиксировано де ление кардиомиоцитов, замещение ими дефекта и вытес нение тромбинового сгустка при минимальном рубцевании [30]. Вероятней всего, этот процесс происходит по сценарию, частично повторяющему эмбриогенез, для которого харак терна последовательная экспрессия генов кардиомиоци тарной дифференцировки (Nkx 2,5, GATA 4,GATA 5, Tbx 5).
Наконец, существует линия мышей MRL (модель для изу чения аутоиммунных реакций), способных восстанавливать
миокард без рубцевания. КМЦ этих млекопитающих способ ны вступать в S фазу и замещать участок поврежденной ткани в результате криодеструкции [31]. Считается, что эта наследуемая способность связана с измененной, по срав нению с диким типом, экспрессией матриксных металлопро теиназ, а также их ингибиторов.
Для человека подобные явления нехарактерны, однако еще в прошлом веке у биологов существовали предполо жения о присутствии популяции клеток, способных вносить вклад в регенеративный потенциал сердечной мышцы.
П.П. Румянцев в своей фундаментальной монографии [32] описывает несколько примеров того, что вопреки распространенным взглядам, ни одна из разновидностей КМЦ (желудочковые, предсердные, проводящей системы) даже у взрослых млекопитающих не является чистой по пуляцией статических или необратимых постмитотических клеток. В предсердиях млекопитающих клеток, способных вступать в митоз, ниже, чем в желудочках, но все же мо жет доходить до 60% при обширных ИМ левого желудочка (ИМЛЖ) или до 40% при стенозе аорты у крыс (дистант ная или реперфузионная пролиферация предсердных ми оцитов). Напротив, периинфарктная зона желудочкового миокарда содержит не более 10% возвращающихся в митотический цикл КМЦ [32].
Как правило, реактивная репродукция КМЦ взрослых животных осуществляется согласно закономерностям их пролиферации в нормальном кардиомиогенезе. Образова ние миобластов, лишенных миофибрилл, путем дедиффе ренцировки не происходит. Расположение участвующих в реактивной пролиферации КМЦ зафиксировано в составе мышечных трабекул десмосомами и вставочными дисками. Митотические циклы по продолжительности соизмеримы с самыми длинными циклами в постнатальном кардиомиогенезе [32]. Способные возвращаться в митоз КМЦ пролифериру ют в основном по периферии некротических очагов или диф фузно, как в предсердиях при ИМ ЛЖ (регенерационная гипертрофия).
Однако, все эти данные получены П.П. Румянцевым и кол легами с помощью метода радиоавтографии, который, без сомнения, может определить наличие делящихся клеток в образце, но не несет информации об их происхождении и функциональной значимости. Проще говоря, когда речь идет о 40% митозов в постинфарктном сердце, то, вероятно, де лятся прежде всего, фибробласты стромы миокарда.
Между тем, согласно общепринятой точке зрения, КМЦ желудочков человека являются терминально дифференци рованными. Их количество является фиксированным и до стигает оптимума в течение нескольких месяцев после рождения. Однако в последнее время возросло количество работ, посвященных исследованию клеток предшествен ников во взрослом сердце человека [33].
В одной из последних работ группы американских уче ных под руководством P. Anversa показано присутствие в миокарде «стволовых клеток», которые обеспечивают его регенерацию после инфаркта. В исследование были вклю чены сердца от пациентов, умерших в результате острого инфаркта, после трансплантации сердца, а также по причи не хронических инфарктов.
Стволовые клетки сердца (СКС) выявляли по наличию на их поверхности маркеров с kit, MDR 1, Sea 1 подобного эпитопа человека. Кроме того, эти клетки не экспрессиро вали факторы транскрипции и структурные белки КМЦ и ГСК. Рост СКС, их старение и смерть оценивали по длине теломер ных участков хромосом с помощью метода FISH гибридиза ции [34]. Пролиферацию оценивали по экспрессии белков K¡ 67, МСМ5 и фосфорилированной формы гистона НЗ (рис. 2).
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 1, 2007
I
Обзоры
Таблица, Характеристика СКС по данным литературы
Характеристика c-kit Sca-I MDR-1 lsL-1
Кардиомиогенная
дифференцировка + + + +
Клоногенность + + + Нет данных
Способность
к самообновлению + + + +
Мультипотентность + + + Нет данных
Формирование
кардиосфер + + + Нет данных
Присутствие в фетальном/ взрослом сердце + + + +
Остановимся подробнее на использованных маркерах. K¡ 67 ядерный антиген, экспрессирующийся в большин стве пролиферирующих клеток организма человека на всех стадиях клеточного цикла (кроме Go) [35]. Наиболее явно антиген выявляется в S фазе. Авторы работы сравнивают коэкспрессию K¡ 67 и саркомерного а актина (одновремен ное окрашивание) в нормальном миокарде и постинфарктном сердце. В работе [36] проанализирован материал 20 чело веческих сердец после острого инфаркта, 20 на последней стадии постинфарктной кардиомиопатии и 12 контрольных сердец. Повышенное количество делящихся клеток было достоверно зафиксировано при остром и хроническом ин фарктах по сравнению с контролем. Количество СКС воз растало с 1,5% в контроле до 28% в остром инфаркте и до 14% в случае хронического инфаркта (по уровню активности теломеразы). Митотический индекс СКС возрастал в 29 раз при остром инфаркте, в 14 раз - при хроническом. Коли чество СКС, коммитированных в КМЦ, гладкомышечные клетки и эндотелий возрастало в 85 раз в случае острого инфаркта, в 25 раз при хроническом инфаркте. Однако количество апоптотических p16INK4an р53 позитивных СКС также возрастало и составило 10, 18, 40% в конт роле, хроническом и остром инфарктах соответственно [37]. По результатам экспериментов, размеры í¡n() клеток, а точнее, их объем, составил 203±50 рм3. Т.е. это были дос таточно мелкие клетки, по сравнению с другими типами клеток в сердце.
Стареющие СКС имели короткие теломеры и 0,3%, 3,8%, 9,6% клеток гибли апоптотическим путем в контроле, при хроническом и остром инфарктах соответственно. Эти па раметры значительно сокращали количество функциональ но компетентных СКС с 26 тысяч на см3 в жизнеспособном миокарде в случае острого инфаркта, до 7 тыс. на см3 при хроническом инфаркте. В семи случаях острых инфарктов были обнаружены кластеры спонтанной регенерации мио карда без видимого слияния клеток.
Во всех исследованных сердцах около 60% СКС коэксп рессировали с kit, MDR 1, Sea 1 подобный эпитоп, и лишь незначительный процент клеток демонстрировал присут ствие одного или двух из этих антигенов. Количество СКС в жизнеспособном миокарде возрастало при остром инфар кте до 40 тыс. на 1 см3 ткани в пограничной зоне и 20 тыс. на 1 см3 в отдаленных участках. В случае хронического инфаркта, где сложно четко выделить пограничную зону, ко личество СКС в целом было снижено (табл.).
Таким образом, ученые заключили, что во взрослом сер дце присутствует пул СКС, а их активация происходит пре имущественно при ишемических состояниях, как ответ на ишемию (гипоксию) ткани. Потеря функционально значимых СКС при хронических ишемических кардиомиопатиях может лежать в основе прогрессивного изнашивания ткани и ее гибели.
В семи сердцах с острым инфарктом были обнаружены зоны интенсивной спонтанной регенерации миокарда. Они представляли собой кластеры размером от 500 цм3 до 5 мм3. Похожее явление не было обнаружено в случаях хронических инфарктов. Отсутствие слияния исследователи доказывали наличием в ядрах мужских сердец одной X и одной У хро мосом, и двух X хромосом в женских сердцах. Незрелые клетки были обнаружены и в стенке сосудов.
Таким образом, главным результатом этой работы яв ляется то, что исследователи показали присутствие незре лой популяции клеток в ткани взрослого сердца, способных к делению и дифференцировке в КМЦ, ГМК, эндотелий, организующиеся в сосудоподобные структуры.
Закономерным вопросом является происхождение этой популяции СКС. На данный момент в источниках литерату ры называют два возможных пути попадания таких клеток в миокард. Первый - СКС это клетки, сохранившиеся с эм бриогенеза и не прошедшие все стадии дифференцировки. Известно, что сердце, кровеносные сосуды, клетки крови и гладкая мускулатура развиваются из несегментированной мезодермы боковых пластинок [38]. Система кровообраще ния является первой функциональной единицей зародыша, а сердце его первым функциональным органом. Презум птивные клетки сердца мигрируют из боковых участков ме зодермы. Когда же клетки достигают передней области за родыша, миграция прекращается. Клетки будущего сердца, двигаясь между эктодермой и энтодермой к середине за родыша, сохраняют тесный контакт с поверхностью энто дермы посредством участия кадгеринов. Причем миграция осуществляется путем хемотаксиса на факторы, секрети руемые энтодермой - BMPs, IGF, TGF р, FGF, LI F, запуская кардиомиогенную дифференцировку примитивных клеток. Введение BMP 2 и BMP 4 in vivo вызывает эктопическую экспрессию транскрипционных факторов кардиомиогене за: Nkx 2.5; GATA 4; GATA 5; GATA 6; MEF2; eHAND; и dHAND, а также структурных и сократительных белков кар диомиоцитов, например, тяжелых цепей сердечного миози на (ventricular myosin heavy chain, vMHC) и тропонина С [39].
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 1, 2007
Обзоры
Показано также, что Nkx 2.5 вызывает дифференцировку мигрирующих клеток мезодермы в зрелые КМЦ [40, 41 ]. Nkx 2.5 активирует синтез и других транскрипционных факторов, в особенности семейства GATA и MEF2. При правильной временной и пространственной организации экспрессии всех этих факторов начинается сборка специ фических полимеров сердечных белков (сердечные изофор ß
пептида и т.д.), созревание органелл и сократительного ап парата. Активность энтодермы в отношении клеток пред шественниц сердечной мышцы, проявляющаяся в секреции BMPs, может однако, эффективно подавляться сигнальны ми молекулами антагонистами, такими как Noggin, который, связываясь с BMP, полностью блокирует кардиомиогенез. Кроме того, естественными антагонистами генов кардио миогенной дифференцировки являются Wingless (Wg) у дрозофилы и Wnt у человека [42]. Дифференцировка кле ток различных сердечных отделов происходит последова тельно: сначала дифференцируются клетки желудочков, а уже затем клетки предсердий [43]. Таким образом, кардио миогенез является многоступенчатым процессом, который регулируется иерархией растворимых факторов (роста), определяющих каждую стадию морфогенеза сердца. Мож но предположить, что на всех ступенях этого процесса в тканях сердца будут оставаться клетки, в которых была заблокирована терминальная дифференцировка.
Другой гипотезой возникновения СКС в миокарде взрослых млекопитающих является их миграция с участи ем специфических медиаторов из костного мозга в процес се воспаления. Такие клетки в последствии приживаются в миокарде и могут способствовать его регенерации, диф ференцируясь в КМЦ, эндотелий, ГМК или сливаясь с су ществующими КМЦ. Предположительно, в этих процессах могут активно участвовать лиганд рецепторные оси типа SDF 1/CXCR 4 [44].
Выделение, характеристика и локализация СКС
в миокарде
Во многих работах исследователи выделяли клетки из взрослого сердца на основе присутствия маркеров стволо вых клеток, которые не только экспрессировали их, но так же вели себя как истинные предшественники кардиомио цитов, давая клоны in vitro, экспрессирующие биохимические маркеры КМЦ, ГМК и эндотелия [45].
Другой характеристикой «стволовости» таких клеток является поддержание целостности структур теломер хромосом вследствие нормального (активного) функциони рования теломеразы фермента, осуществляющего пост репликативное достраивание ДНК теломерных участков.
Уровень этого фермента в сердце снижается вскоре пос ле рождения животного и выхода КМЦ из клеточного цикла. Интересно, что активность теломеразы во взрослом мио карде обнаруживается лишь в маленькой популяции клеток сердца, экспрессирующих Sea 1, но не демонстрирующих присутствия каких либо маркеров гемопоэтических стволо вых клеток (с kit, CD45, CD34) и эндотелиальных предше ственников (CD45, CD34, Flk 1 ,Flt 1 ) [45].
Выделенные и очищенные сердечные Sea 1 позитив ные клетки специфически мигрируют в ишемизированный миокард при их системном введении и активируют карди омиогенную программу дифференцировки в СК миокарда. Их значительное количество сливается с присутствующи ми там КМЦ.
Sea 1 позитивные клетки способны дифференциро ваться в КМЦ в культуре. Так, в работе [46] показана диф ференцировка Sea 1 позитивных клеток грызунов (по пуляция отбиралась с помощью сортинга на магнитных
бусах) в сокращающиеся кардиомиоциты в культуре. Кроме того, эти клетки отличало высокое значение соотношения объема цитоплазмы к объему ядра. Эти клетки также диф ференцировались в КМЦ, ГМК и эндотелий и положительно влияли на сердечную функцию у крыс, перенесших инфаркт. Использование конфокального микроскопа позволило воссоздать трехмерную картину поврежденного миокарда с делящимися кластерами клеток на толстых срезах сердца (ранее рассматривались лишь тонкие и полутонкие). Пока не ясна связь этих клеток с малочисленными кардиомио генными предшественниками КМЦ, которые поддерживают способность пролиферировать в ответ на поражение мио карда и постоянно обновляются за счет дифференцировки клеток, подобных стволовым [42, 45, 46].
Происхождение этих клеток попытались объяснить в ра боте [46] это Lin/с kir клетки, выделенные из взрослого сердца крыс. По своим характеристикам это самообнов ляющаяся, Lin/с kir, клоногенная популяция клеток, мультипотентная, дающая in vitro и in vivo начало КМЦ, ГМК, эндотелиальным клеткам. При локальном инициировании в поврежденный крысиный миокард они способствуют вое становлению до 70% пораженной ткани [46].
Е. Messina с соавт. (2004) сообщают о выделении пред шественников кардиомиоцитов из взрослого сердца мышей и человека и показывают также клоногенность этих клеток, малый размер, их способность к образованию клеточных кластеров в культуре («кардиосфер»), экспрессирующих маркеры стволовых клеток, эндотелия и КМЦ. В предыду щих работах отмечалось, что регенерировавший миокард, также содержит именно эти клетки малые кардиомиоци ты [47]. Эти данные свидетельствуют о том, что обновле ние в миокарде может происходить именно за счет клеток сердечных предшественников, однако активность этого про цесса на очень низком уровне.
Представляет интерес использование в терапевтичес ких целях возможности мобилизации эндогенных клеток предшественников КМЦ из их ниши в пределах здорового сердца. В работе K. L. Laugwitz и соавт. (2005) показано присутствие isl 1* клеток в постнатальном сердце крыс, мышей и человека [48]. Исследователи использовали isl 1 в качестве маркера недифференцированных предшествен ников КМЦ в эмбриогенезе. Islet 1 - LIM представляет со бой гомеодоменный фактор транскрипции, маркирующий клеточную популяцию, вносящую заместительный вклад в развитие эмбрионального сердца [48]. Субпопуляция isl 1 * не дифференцированных предшественников остается в серд це эмбриона мыши продолжительное время после рождения, их число значительно снижается в период с 12,5 по 18,5 сут. эмбрионального развития. После рождения лишь незначи тельное количество isl 1* кардиомиобластов все еще выяв ляется в (500 600) в миокарде 1 5 дневных крыс. Места скопления (кластеры) isl 1* клеток были обнаружены и в предсердии, тогда как в желудочке выявлялись лишь еди ничные клетки.
Эксперименты по кокультивированию с неонатальными КМЦ другой линии мышей показывают, что isl 1* клетки представляют собой аутентичную эндогенную популяцию предшественников (кардиомиобластов), которые демонстри руют высокоэффективную степень превращения в клетки с фенотипом «взрослых» КМЦ, со стабильной экспрессией маркеров КМЦ (25%) в отсутствие слияния и обычнымме таболизмом Са2^.
Похожие эксперименты проводили на мышах, популяцию резидентных клеток предшественников из сердца харак теризовали как CD31 /Sca1^ клетки. Популяцию характе ризовали по способности исключать ядерный краситель Hoechst, за это свойство обычно отвечает MDR 1 (multi drug
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 1, 2007
Обзоры
resistance) - это белок, способный выкачивать из клетки лекарственные вещества и красители. Далее, на выделен ных клетках продемонстрировали экспрессию CD31 и Seal, а также не обнаружили маркера islet 1 [49].
Исследователи продемонстрировали дифференциров ку CD31 /Sea'Г клеток в КМЦ с присущими им биохими ческими маркерами и функциональными свойствами (способностью к сокращению, особыми ионными токами) при кокультивировании со взрослыми КМЦ. Для такой диф ференцировки необходим контакт со зрелыми КМЦ из сердца, который становится внешним сигналом из микро окружения, влияющим на клетку предшественник.
Распределение (локализация) СКС в сердце
Несколько работ посвящено выделению и распределе нию незрелых клеток предшественнников в миокарде мле копитающих [42, 50, 51].
Локализация и специфические функции тех или иных групп клеток в сердце зависят от механической нагрузки, приходящейся на данный участок ткани. Нагрузка на стенку желудочка распределена следующим образом она мак симальна в базальной части и середине стенки и значитель но снижается к верхушке, наименьший «механический стресс» зафиксирован в предсердии.
По результатам исследований, именно участки с наи меньшей нагрузкой являются нишами для СКС. Однако для них характерно и образование кластеров в срединной части стенки желудочка (рис. 3).
Рис, 3, Тканевая ниша СКС
Таким образом, явление распределения ниш для СКС зависит от механической нагрузки в данной анатомической области органа. Гомеостаз в таких нишах определяется рав новесием между симметричным и асимметричным делени ем СКС. Кроме того, незрелые клетки в нишах формируют контакты с окружающими поддерживающими клетками по средством интегринов и коннексинов [51].
Заключение
В данный момент ведется поиск оптимального источника клеток для поддержания функций постинфарктного миокар да. Основными целями остаются улучшение кровоснабже ния, увеличение объема фракции выброса, предотвращение повторных инфарктов. Существует ряд вопросов, требующих ответа перед проведением трансплантации. Это происхож дение клеточного материала (сейчас предпочтение отдает ся аутогенным клеткам), способ дифференцировки и ее не обходимость, количество вводимых клеток и способ их введения.
Основными, максимально изученными на данный момент клетками остаются мезенхимальные клетки костного мозга; однако эффективность их применения до сих пор одно значно не доказана. Также стоит упомянуть, что клиничес кие испытания СК в кардиологии хотя и сопряжены с рядом трудностей, все равно опережают фундаментальные иссле дования в этой области по темпам своего развития.
С появлением ряда работ, посвященных описанию попу ляции клеток сердца, способной самообновляться, делить ся и дифференцироваться в ответ на нарушение, возникла возможность приблизиться к пониманию функций СКС, их локализации, молекулярной характеристики и механизмов их возможной активации.
Кроме того, существует мнение, что эффект от введения клеток различного фенотипа, использующихся в предвари тельных клинических экспериментах, может быть обусловлен именно активацией резидентных СКС [52, 53].
Перспективным направлением представляется ис пользование СКС и в клеточной терапии в кардиологии. Эти клетки аутогенны, исходно расположены в сердце и связаны с кардиомиоцитами и эндотелием сосудов сердца по проис хождению и локализации. Таким образом, в будущем при менение СК в кардиологии связано не только с введением стволовых клеток непосредственно в миокард или кровоток, мобилизацией незрелых клеток, а также с манипулировани ем и попыткой регулирования деятельности СКС. Возможно, наилучшего результата можно достичь при сочетании всех трех способов.
Объяснением недостаточной регенерации во время ин фаркта может служить предположение, что СКС приспособ лены к поддержанию нормального баланса клеточной гибели и самообновления миокарда в норме (низкими темпами) и их способности и количества недостаточно для обеспечения адекватной репарации при последствиях ишемии. Существует острая необходимость в понимании роли экзогенных сигна лов (с помощью цитокинов и ростовых факторов) для разра ботки способов стимуляции СКС прямо в миокарде. Остается ряд вопросов, на которые необходимо найти ответы перед началом терапевтического использования СКС:
1. Как обеспечить перемещение СКС из места их рас положения (ниш) в ишемизированный или поврежденный инфарктом участок?
2. Каким образом активировать их пролиферацию и дифференцировку?
3. Как преодолеть недостаток кровоснабжения в пора женном участке и перекинуть сосудистый «мост» между здоровой и ишемизированной тканью?
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 1, 2007
■ И I II II
■m
Обзоры
ЛИТЕРАТУРА:
1. Cleland J.F.G., McGowan J. Heart Failure due to Ischaemic Heart Disease: Epidemiology, Pathophysiology and Progression. J Cardiovasc Pharmacol 1999; 33[suppl. 3):S17S29.
2. Kim W.H., Joo C.U., Ku J.H. et al. Cell cycle regulators during human atrial development. Korean J Intern Med 1998; 13[2):77 82.
3. Orlic D., Kajstura J., Chimenti S., et al. Mobilized bone marrow repair the infracted heart, improving function and survival. PNAS 2001 ; 98:10344 10349.
4. Friedenstein A.J., Gorskaja J.F., Kulagina N.N. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. Exp Hematol 1976; 4:267 274.
5. Koh G.Y., Soonpaa M.H., Klug M.G., et al. Stable fetal cardiomyocyte grafts in the hearts of dystrophic mice and dogs. J Clin Invest 1995; 96[4):203442.
6. Leor J., Patterson М., Quinones M.J. et al. Transplantation of Fetal Myocardial Tissue Into the Infarcted Myocardium of Rat A Potential Method for Repair of Infarcted Myocardium? Circulation 1996; 94: 332 336.
7. Li R.K., Mickle D.A.G., Weisel R.D. et al. Natural history of fetal rat cardiomyocytes transplanted into adult rat myocardial scar tissue. Circulation 1997; 96:179 187.
8. Fernandes K. J. L., McKenzie I. A., Mill P., Smith К. М., Akhavan М., ВагпаЬй
Heider F. A dermal niche for multipotent adult skin derived precursor cells. Nat Cell Biol 2004; 6: 1082 1093.
9. Quaini F., Urbanek K., Beltrami A.P., Finato N., Beltrami C.A., Nadal Ginard B., Kajstura J., Leri A., Anversa P. Chimerism of the transplanted heart. N. Engl. J. Med. 2002; 346: 5 15.
10. Muller A., Pfeiffer P., Koglin J., Schflfers H J., Seeland (J., et al. Cardiomyocytes of non cardiac origin in myocardial biopsies of human transplanted hearts. Circulation 2002; 106 : 31 35.
11 .StrauerB.E., BrehmM., Zeus T., Ki4SteringM.,HernandezA.,etal. Repair of infracted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans. Circulation 2002; 106: 1913 1918.
12. Wollert K.C., Lotz M. J., Lichtenberg S. R., Lippolt P., Breidenbach C., Fichtner S., Korte T., Hornig B., Messinger D. Intracoronary autologous bone marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomised controlled clinical trial. Lancet 2004; 364: 141 148.
13. Katritsis D.G., Sotiropoulou P.A., Karvouni E. Transcoronary transplantation of autologous mesenchymal stem cells and endothelial progenitors into infracted human myocardium. Catheter Cardiovasc Interv 2005; 65: 321 329.
14. Archundia A., Aceves J.L.,Lopez Hernandez М., et al. Direct cardiac injection of G CSF mobilized bone marrow stem cells improves ventricular function in old myocardial infarction. Life Sci 2005; 78: 279 283.
15. Stamm С., Westphal B., Kleine H.D., Petzsch М., Kittner С., et al. Autologous bone marrow stem cell transplantation for myocardial regeneration. Lancet 2003; 361: 45 46.
16. Bartunek J., Vanderheyden М., Vandekerckhove B., et al. Intracoronary injection of CD133 positive enriched bone marrow progenitor cells promotes cardiac recovery after recent myocardial infarction: feasibility and safety. Circ 2005; 112:1178 1183.
17. Watanabe C. Intracoronary adipose tissue derived stem cell therapy preserves left ventricular function in a porcine infarct model. Paper presented at Transvascular Cardiovascular Therapeutics Annual Meeting, September 2004, Washington DC, USA.
1 8 . Schflchinger V., Tonn T., Dimmeler S., et al. Bone marrow derived progenitor cell therapy in need of proof of concept: design of the REPAIR AMI trial. Nat Clin Prac Cardiovasc Med 2006; 3 [1 ): 23 28.
19. Menasche P., Hagege A. A., Vilquin J.T., Desnos М., et al. Autologous skeletal myoblast transplantation for severe postinfarction left ventricular dysfunction. J Am Coll Cardiol 2003; 41:1078 83.
20. Erbs S. Linke A., Adams V.,et al.. Transplantation of blood derived progenitor cells after recanalization of chronic coronary artery occlusion: first randomized and placebo controlled study. Circ Res 2005; 97: 756 762.
21. Tirziu D., Simons M. Angiogenesis in the human heart: gene and cell therapy. Angiogenesis. 2005;8[3): 241 51.
22. Ripa R.S., Jorgensen E., Wang Y., et al. Stem cell mobilization induced by subcutaneous granulocyte colony stimulating factor to improve cardiac regeneration after acute ST elevation myocardial infarction: result of the double blind, randomized, placebo controlled stem cells in myocardial infarction (STEMMI) trial. Circulation2006; 113:1983 1992.
23. Askari A.T., Unzek S., Popovic Z.B., et al. Effect of stromal cell derived factor 1 on stem cell homing and tissue regeneration in ischaemic cardiomyopathy. Lancet 2004; 362 : 697 703.
24. Okada H., Takenura G., Kosai K., et al. Postinfarction gene therapy against transforming growth factor beta signal modulates infarct tissue dynamics and attenuates left ventricular remodeling and heart failure. Circ 2005; 111:2430 2437.
25. Losordo D.W. Vale P.R., Hendel R.C., Milliken C.E., Fortuin F.D. Phase S placebo controlled, double blind, Dose escalating trial of myocardial vascular endothelial growth factor 2 gene transfer be catheter delivery in patients with chronic myocardial ischemia. Circ 2002; 105:2012 2018.
26. Shintani S., Kusano K., li М., Iwakura A., Heyd L. et al. Synergistic effect of combined intramyocardial CD34t cells and VEGF2 gene therapy after Ml. Nat ClinPract Cardiovasc Med 2005; 2:123 128.
27.Pislaru S.V., Simari R.D. Gene transferfor ischemic cardiovascular disease: is this the end of the beginning or the beginning of the end? Nat ClinPract Cardiovasc Med 2005; 2: 138 144.
28. Vassalli G., Bueler H., Dudler J., von Segesser L.K., Kappenberger L. Adeno associated virus (AAV) vectors achieve prolonged transgene expression in mouse myocardium and arteries in vivo: a comparative study with adenovirus vectors. Int J Cardiol 2003; 90: 229 238.
29. Brockes J.P., Kumar A., Velloso C.P. Regeneration as an evolutionary variable. J Anat 2001; 199: 3 11.
30. Poss K.D., Wilson L.G., Keating M.T. Heart regeneration in zebrafish. Science 2002; 298: 2188 2190.
31. Leferovich J.M. Bedelbaeva K., Samulewicz S., Zhang X.M., Zwas D. Heart regeneration in MRL mice. PNAS 2001; 98:9830 9835.
32.Румянцев П.П. Кардиомиоциты в процессах репродукции, дифференцировки и регенерации. Наука; 1982.
33. Urbanek К., Quaini F., Bolli R., Leri A., Kajstura J., Anversa P. Myocardial regeneration by activation of multipotent cardiac stem cells in ischemic heart failure. PNAS 2005; 102[24):8692 7.
34. Varma J., Prabhu S., Anversa P.A., Bolli R. Cardiac stem cells delivered intravascularly traverse the vessel barrier, regenerate infarcted myocardium, and improve cardiac function. Proc Natl Acad Sci U S A 2005; 102[10):3766 71.
35. Beltrami A.P., Urbanek K., Kajstura J., et al. Evidence that human cardiac myocytes divide after myocardial infarction. N Engl J Med 2001; 344:1750 1757.
36. Beltrami A.P. Urbanek K., Kajstura J., Yan S.M., Finato N., et al. Cardiac с kit positive cells proliferate in vitro and generate new myocardium in vivo. Circulation 2001; 104: 324.
37. Qh H., Wang S. C., Prahash A, Sano М., Moravec C. S., at al. Telomere attrition and Chk2 activation in human heart failure. PNAS 2003;100:5378 5383.
38. Gilbert S. F. Developmental Biology. 6th ed, 2000.
39. Tzahor E., Lassar A. B. Wnt signals from the neural tube block ectopic cardiogenesis. Genes Dev 2001; 15:255 260.
40. Schultheiss T.M., Xydas S., Lassar A.B. Induction of avian cardiac myogenesis by anterior endoderm. Development 1995; 121[12):4203 14.
41. Andree B., Duprez D., Vorbusch B., Arnold H.H., Brand T. BMP 2 induces ectopic expression of cardiac lineage markers and interferes with somite formation in chicken embryos. Mech Dev 1998;70[1 2): 119 31.
42. Moon R.T., Brown J. D., Torres M.WNTs modulate cell fate and behavior during vertebrate development. Trends Genet 1998; 13:157 162.
43. Markwald R. R., Trusk T., Moreno Rodriguez R. Formation and septation of the tubular heart: Integrating the dynamics of morphology with emerging molecular concepts. In M. de la Cruz and R. R. Markwald (ed.), Living Morphogenesis of the Heart. Birkhauser Press, Boston; 1998.
44. Smadja D.M., Bieche I., Uzan G., Bompais H., Muller L., et al. PAR 1 activation on human late endothelial progenitor cells enhances angiogenesis in vitro with upregulation of the SDF 1 /CXCR4 system. Arterioscler Thromb Vase Biol. 2005;25[11 ):2321 7.
45. Gallo P., Peschle C., Condorelli G. Sources of cardiomyocytes for stem cell therapy: an update. Pediatr Res 2006; 59[4):79R 83R.
46. Beltrami A.P., Barlucchi L., Torella D., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell 2003; 114: 763 776.
47. Messina E., Angelis L.D., Frati G., et al. Isolation and Expansion of Adult Cardiac Stem Cells From Human and Murine Heart. Circ Res 2004; 95: 911 921.
48. Laugwitz К L., Moretti A., Lam J., et al. Postnatal isll i cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages, Nature 2005; 433 :647 653.
49. Wilson S. F., Colucci M.D., Liao R., Pfister Q., Mouquet F., et al. CD31 but Not CD31 ! cardiac side population cells exhibit functional cardiomyogenic differentiation. Circ Res. 2005; 97:52 61.
50. Cesselli D., Beltrami A.P., Urbanek K., Kajstura J., et al Cardiac stem cells are nested in niches of the adult mouse heart and possess the ability to divide and differentiate in the various cardiac lineages. Circulation 2002; 106: I114.
51. Urbanek K., Cesselli D., Rota М., Nascimbene A., Angelis A., HosodaT.,
Bearzi C., Boni A, Bolli R., Kajstura J., Anversa P., Leri A. Stem cell niches in
the adult mouse heart. PNAS 2006; 103 (24): 9226 9231.
52. Yoon Y.S., Wecker A., Heyd L., et al. Clonally expanded novel multipotent stem cells from human bone marrow regenerate myocardium after myocardial infarction. J Clin Invest 2005; 115:326 38.
53.Behfar A., Zindman L.V., Hodgson D.M., et al. Stem cell differentiation requires a paracrine pathway in the heart. FASEB J 2002; 16:1558 66.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 1, 2007
