РЕЖИМЫ СОХРАНЕНИЯ РНК В КЛЕТОЧНЫХ ОСАДКАХ МОЧИ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

Клинические исследования и опыт в онкологии

© А.Н. Тороповский, А.Г. Никитин, Д.А. Викторов, Г.Р. Садртдинова, А.С. Сергатенко, Ю.В. Назарова, Н.Г. Куклина, О.Н. Павлова, В.В. Масляков, 2020

УДК 616.65-006.6-07

РЕЖИМЫ СОХРАНЕНИЯ РНК В КЛЕТОЧНЫХ ОСАДКАХ МОЧИ ПРИ ДИАГНОСТИКЕ РАКА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

А.Н. Тороповский1, А.Г. Никитин1, Д.А. Викторов1, Г.Р. Садртдинова1, А.С. Сергатенко1, Ю.В. Назарова1, Н.Г. Куклина1, О.Н. Павлова1, В.В. Масляков2

1ООО «ТестГен», г. Ульяновск

2Частное учреждение образовательная организация высшего образования «Саратовский медицинский университет «Реавиз», г. Саратов

MODES OF RNA PRESERVATION IN URINE CELL SEDIMENTS IN PROSTATE CANCER DIAGNOSIS

A.N. Toropovsky1, A.G. Nikitin1, D.A. Viktorov1, G.R. Sadrtdinova1, A.S. Sergatenko1, Yu.V. Nazarova1, N.G. Kuklina1, O.N. Pavlova1, V.V. Maslyakov2

1TestGen LLC, Ulyanovsk

2Private institution educational organization of higher education «Medical University «Reaviz», Saratov

Павлова Ольга Николаевна — доктор биологических наук, доцент, научный сотрудник ООО «ТестГен»

432072, г. Ульяновск, 44-й проезд Инженерный, д. 9, офис 13, лаборатория 33-34, тел. +7-927-713-34-36,

e-mail: casiopeya13@mail.ru

Pavlova Olga N. — Doc. of Biol. Sc., Assistant Professor, researcher in TestGen LLC

9 44th passage Engineering, office 13, laboratory 33-34, Ulyanovsk, Russian Federation, 432072, tel. +7-927-713-34-36, e-mail: casiopeya13@mail.ru

Реферат. Рак предстательной железы занимает одно из ведущих мест по летальности среди онкологических заболеваний. Ранняя диагностика рака предстательной железы основывается на определении уровня сывороточного простатического специфического антигена (ПСА) и выполнении пункционной биопсии предстательной железы, однако это привело к увеличению числа выполняемых биопсий простаты, а снижение порога возрастных норм ПСА — к увеличению числа неоправданных биопсий. В связи с этим возникла необходимость в новых биомаркерах рака предстательной железы. РСА3 — некодирующая мРНК, которая экспрессируется исключительно клетками предстательной железы. Особенностью использования в диагностике РПЖ маркера PCA3 является определение уровня экспрессии гена PCA3 в образцах мочи после массажа предстательной железы или без массажа. Высокий уровень PCA3 в клеточном осадке мочи коррелирует с высоким риском выявления РПЖ по результатам биопсии. Материалом для подобных исследований служат образцы свежего или фиксированного в среде для стабилизации и сохранения РНК осадка мочи пациентов с подозрением на рак предстательной железы. Таким образом, цель нашего исследования заключалась в определении оптимальных режимов сохранения РНК в клеточных осадках мочи при диагностике рака предстательной железы. В работе использовали разные режимы хранения осадков мочи. Установлено, что наилучшая сохранность РНК в клеточных осадках мочи с наибольшим сроком хранения и наименьшими потерями РНК составляет 3 суток при -20°С с использованием фиксатора. При необходимости хранения осадков мочи длительное время (до 14 дней) следует также использовать раствор для стабилизации и хранения РНК при температурном режиме -20°С при этом уровень сохранности РНК значительно падает (до 16%). Ключевые слова: ПСА, PCA3, рак предстательной железы, клеточный осадок мочи.

Abstract. Prostate cancer is one of the leading cancers in terms of lethality. Early diagnosis of prostate cancer is based on determining the level of serum prostatic specific antigen (PSA) and performing a puncture biopsy of the prostate, but this has led to an increase in the number of prostate biopsies performed, and a lowering of the age threshold for PSA has led to an increase in unjustified biopsies. New biomarkers for prostate cancer were therefore needed. PSA3 is a non-coding mRNA that is expressed exclusively by prostate cells. The peculiarity of using PCA3 marker in RPG diagnosis is the determination of the level of expression

of PCA3 gene in urine samples after a prostate massage or without it. The high level of PCA3 in urine cellular deposition correlates with the high risk of PCA3 detection by biopsy results. Fresh or medium-linked samples are used to stabilize and preserve the RNA in urine sludge in patients with suspected prostate cancer. Thus, the aim of our study was to determine the optimal modes of preserving RNA in urine cell sediments for prostate cancer diagnosis. Different modes of urine residue storage were used in the work. It was found that the best RNA preservation in urine cell sediments with the longest storage time and the smallest RNA loss is 3 days at -20°C using a fixer. If it is necessary to store urine sediments for a long time (up to 14 days), a solution should also be used to stabilize and store the RNA at -20°C, while the level of RNA preservation decreases significantly (up to 16%). Key words: PSA, PCA3, prostate cancer, cellular urine sediment.

Актуальность

Рак предстательной железы является вторым наиболее часто диагностируемым раком (у 15% всех мужчин) и шестой по значимости причиной смерти от рака у мужчин во всем мире. 75% мужчин в возрасте 80-85 лет имеют признаки изменения строения ткани предстательной железы (ПЖ), которые соответствуют симптомам рака простаты. Если в указанном возрасте отмечаются характерные для рака простаты симптомы, прогноз обычно неблагоприятный. Такие расстройства наблюдаются в 30% случаев у 30-летних мужчин и в 50% — у 50-летних. При этом в 97% подобные очаги повреждения не вызывают выраженных клинических признаков и протекают бессимптомно.

Ранняя диагностика рака предстательной железы основывается на определении уровня сывороточного простатического специфического антигена (ПСА) и выполнении пункционной биопсии предстательной железы (ПЖ). Применение ПСА-скрининга позволило снизить смертность и повысить пятилетнюю выживаемость пациентов с РПЖ [7, 1, Григорьева М.В., 2017]. Однако стандартная диагностическая модель имеет ряд ограничений, приводящих к большому числу клинически-ненужных биопсий, гипердиагностике (в 1,7-67% случаев) и избыточному лечению РПЖ [3]. Лишь 25% биопсий, выполняемых в связи с повышением уровня сывороточного ПСА, позволяют диагностировать РПЖ [6]. Следует отметить, что чувствительность определения общего ПСА в диагностике РПЖ, по данным различных литературных источников, достаточно высока (68,4-94,0%), но тем не менее данные о его специфичности весьма вариабельны 44,0-57,9% [9].

Для повышения качества ранней диагностики РПЖ были разработаны и предложены различные инструментальные и лабораторные методы

обследования, в том числе тест-системы с моле-кулярно-генетическими маркерами. К наиболее специфичным в отношении РПЖ и многообещающим маркерам относят PCA3 и TMPRSS2-ERG [5].

Чувствительность и специфичность маркера PCA3 по данным разных исследований составляет 65,0-92,5%. Мнения, относительно включения оценки экспрессии РСА3 в моче в стандарт диагностики РПЖ, также расходятся. По данным исследования, посвященного оценке экономической целесообразности применения маркера, выгода, достигнутая за счет исключения ненужных биопсий, не покрывает затрат на определение экспрессии РСА3. Основываясь на анализе «затраты-эффективность», многие исследователи не рекомендуют включение теста РСА3 в стандартную модель обследования пациентов с подозрением на РПЖ (в Великобритании). FDA (U.S. Food and Drug Administration) рекомендует учитывать результаты данного исследования для принятия решения о выполнении повторной биопсии ПЖ у мужчин старше 50 лет [4].

Особенностью использования в диагностике РПЖ маркера PCA3 является определение уровня экспрессии гена PCA3 непосредственно в первой порции мочи после массажа предстательной железы. Высокий уровень PCA3 в клеточном осадке мочи коррелирует с высоким риском выявления РПЖ по результатам биопсии. Материалом для подобных исследований служат образцы свежего или фиксированного в среде для стабилизации и сохранения РНК осадка мочи пациентов с подозрением на рак предстательной железы. Как правило, образцы мочи получают после пальцевого ректального массажа простаты.

Однако на сегодняшний день доказано, что проведение массажа и его характер не влияют на конечную величину экспрессии PCA3, и, как следствие, на чувствительность и специфичность этого метода диагностики — 80,0% образцов мочи,

ONCOLOGY BULLETIN

OF THE VOLGA REGION

собранных без предварительного массажа ПЖ, являются информативными [2, 10].

Цель исследования заключалась в определении оптимальных режимов сохранения РНК в клеточных осадках мочи при диагностике рака предстательной железы.

Материал и методы

Исследование было проведено на базе лаборатории научно-технических разработок ООО «ТестГен».

Биологическим материалом для исследования служили клеточные осадки, полученные из образцов утренней мочи анонимных доноров — мужчин, в возрасте 30-50 лет. Сбор мочи осуществлялся в утреннее время в стерильные контейнеры, массажа простаты не предусматривалось. Образцы клеточного осадка мочи были собраны в ГАУЗ «Республиканский клинический онкологический диспансер МЗ РТ» (г. Казань). Согласие пациента на участие в исследовании имеется. Исследование клеточных осадков мочи производили в лаборатории научно-технических разработок ООО «ТестГен», исследование уровня РСА3 производили набором реагентов для выявления мРНК гена РСА3 и определения уровня его экспрессии методом двустадийной ОТ-ПЦР-РВ «Проста-Тест-24». Чувствительность и специфичность данного теста «Проста-Тест-24» 78,3 и 81,5% соответственно.

В работе были выбраны следующие режимы хранения:

- 1 день хранения, образцы осадков мочи с фиксатором для стабилизации и хранения РНК и без фиксатора на каждый температурный режим — при +4°С, +20°С, -20°С;

- 3 дня хранения, образцы осадков мочи с фиксатором и без фиксатора на каждый температурный режим — при +4°С, +20°С, -20°С;

- 7 дней хранения, образцы осадков мочи с фиксатором и без фиксатора на каждый температурный режим — при +4°С, +20°С, -20°С.

- 14 дней хранения, образцы осадков мочи с фиксатором и без фиксатора на каждый температурный режим — при +4° С, +20° С, -20° С.

Транспортировка образцов мочи из г. Казань в г. Ульяновск, осуществлялась в соответствии с выбранными режимами хранения.

Схема исследования

1. Образцы мочи объемом 70 мл отдельными стерильными наконечниками переносили в пластиковые центрифужные пробирки (7 пробирок по 10 мл — 6 пробирок экспериментальных и 1 пробирка контрольная).

2. Центрифугировали пробирки при 3 000 об/мин. в течение 30 минут.

3. Не задевая осадков, отдельными стерильными наконечниками удаляли супернатант, оставляя около 1000 мкл. Осадок с оставшейся жидкостью тщательно пипетировали и переносили в пробирки на 1,5 мл.

4. Центрифугировали пробирки при 5 000 об/мин. в течение 10 минут, а затем удаляли супернатант.

5. В часть пробирок к полученным осадкам добавляли фиксатор для стабилизации и сохранения РНК объемом 500 мкл.

6. Экспериментальные пробирки убирали на хранение в соответствии с выбранным временным и температурным режимом.

7. Контрольный образец был получен из той же порции мочи, что и заложенные на хранения осадки. Хранение данного образца не предусматривалось, выделение РНК и реакция обратной транскрипции (ОТ) проводились в тот же день.

8. После истечения срока хранения проводилось выделение РНК набором «Проба-НК» (ООО «ДНК-Технология», Россия) из экспериментальных образцов, затем реакция обратной транскрипции и ПЦР набором «Проста-тест» (ООО «ТестГен», Россия).

Реакция обратной транскрипции проводилась в объеме 50 мкл, согласно инструкции, к набору: 15 мкл ОТ буфера, 4 мкл ОТ ОТТ, 1 мкл ОТ праймеров, 4 мкл ОТ ферментов и 26 мкл РНК-матрицы.

Смеси Температура, °С Продолжительность, мин.

Итоговая смесь 38 90

70 10

ПЦР в режиме реального времени проведена в объеме 20 мкл на амплификатор планшетного типа «ДТпрайм» (ООО «ДНК-Технология», Россия).

Таблица. Режимы хранения осадков мочи Table. Storage Modes of Urine Sediments

Длительность хранения Условия хранения ср. Ср ср. Ср контрольного образца Уровень сохранности РНК, %

Наличие фиксатора Температура хранения, °С KLK3 PCA3 KLK3 PCA3 KLK3 PCA3

1 день Без фиксатора -20 34,5 35,1 32,5 35,1 27,13 100

+4 35,3 34,8 16,1 121,6

+20 32,9 35,3 77,03 87,77

С фиксатором -20 32,8 35,8 82,23 63,34

+4 32,5 34,4 100 157,9

+20 32,5 35,4 100 82,23

3 дня Без фиксатора -20 33,9 36,5 32,5 35,1 40,12 40,12

+4 33,4 36,9 55,59 30,91

+20 34,2 34,6 32,99 138,6

С фиксатором -20 31,4 35,5 204,9 77,03

+4 32,6 36,6 93,68 37,59

+20 32,3 36,4 113,9 42,83

7 дней Без фиксатора -20 34,4 36,5 29,6 33,5 4,51 14,13

+4 33,6 36,1 7,6 18,34

+20 34,4 36,7 4,51 12,4

С фиксатором -20 31,3 35,6 34,08 25,41

+4 32,4 35,9 16,63 20,9

+20 32,4 37,1 16,63 9,55

14 дней Без фиксатора -20 35,5 35,9 29,65 33,5 2,2 20,9

+4 34,6 35,9 3,96 20,9

+20 35,8 - 1,81 -

С фиксатором -20 32,4 35,3 16,63 30,91

+4 36,6 - 1,07 -

+20 32,9 36,6 12 13,24

В составе реакционной смеси содержались: 10x PCR-буфер А, dNTP, MgCl2, H2O, прямые и обратные праймеры (для каждой мишени), ОТ продукты. После прогрева смеси в течение 5 минут при 95°C, ПЦР проводилась согласно следующему режиму: 50 циклов при 94°C в течение 10 секунд и 30 секунд при 65°C. Амплификации проводилась с детекцией флуоресцентного сигнала по каналу FAM, HEX. Регистрацию результатов проводили с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР с детекцией в режиме «реального времени».

Фиксировали средний для двух дублей (по-вторностей) пороговый цикл (Cp) прохождения реакции каждого из генов: KLK3, PCA3.

Интерпретацию результатов для исследуемых образцов проводили только при правильных результатах для ОКО и ПКО данной постановки.

Результаты

Анализ и статистическую обработку результатов исследований проводили общепринятыми методами с использованием программы Microsoft Office Excel 2007 представлены в таблице.

Согласно полученным данным, наиболее оптимальными условиями хранения осадков мочи являются следующие режимы:

— в течение суток без фиксатора при температуре +20°С, уровень сохранности РНК KLK3

ONCOLOGY BULLETIN

OF THE VOLGA REGION

и РСА3 составляет соответственно 77,03% и 87,77%;

— в течение суток с фиксатором при температуре от +20°С до -20°С, уровень сохранности РНК К1.К3 составляет от 82,23 до 100%, а РСА3 — 63,34-82,23%;

— в течение 3 суток с фиксатором при температуре от +20°С до -20°С, уровень сохранности РНК КЬК3 составляет больше 90%, а уровень сохранности РНК РСА3 — от 37,59 до 77%.

При хранении осадков мочи более трех суток (7 и 14 дней) наиболее целесообразным является режим хранения при температуре -20°С с использованием фиксатора для сохранения и стабилизации РНК, при этом выход цикла КЬК3 запаздывает на 2-3 шага, уровень сохранности РНК колеблется в пределах 16,63-34,08%.

Обсуждение результатов

Согласно данным литературы, при оценке результатов различных тест-систем для определения РСА3 ученые обратили внимание на тот факт, что условия сбора мочи для анализа, ее транспортировка и хранение могут по-разному сказываться на результатах. Поскольку число клеток в моче относительно невелико, для увеличения их количества было предложено перед сбором мочи проводить пальцевое ректальное исследование с массажем предстательной железы. Позже несколько групп исследователей доказали, что такой массаж проводить необязательно, его можно заменить 3 ударами по каждой доле предстательной железы, при этом происходит отслоение достаточного для анализа количества клеток, которые попадут в первую порцию мочи пациента. На сегодняшний день доказано, что проведение массажа и его характер не влияют на конечную величину уровня экспрессии РСА3, а также чувствительность и специфичность этого метода диагностики [2].

Также, по мнению некоторых исследователей, на диагностическую точность оценки уровня РСА3 может влиять этап пробоподготовки, то есть способ получения того биоматериала, из которого непосредственно выделяют РНК. Набор РгодепБа предполагает анализ мочи без предварительной подготовки, ее забирают в среду, где проводят лизис клеток и сорбцию исследуемых матричных РНК (мРНК) со специфич-

ными олигонуклеотидами, иммобилизованными на магнитных шариках [11]. При другом подходе РНК выделяют из осадка мочи после центрифугирования [12], ряд авторов перед взятием мочи проводят массаж предстательной железы в целях увеличения доли клеток из ПЖ в осадке мочи [13].

Доклинические исследования показали, что высокий уровень экспрессии РСА3 в моче пациента коррелирует с вероятностью обнаружения у него рака предстательной железы по результатам биопсии в большей степени, чем высокие значения ПСА в крови. Значения позитивной и негативной прогностических ценностей для теста на РСА3 выше, чем для теста на ПСА. Эти данные многократно подтверждены исследованиями, проведенными в разных клиниках [14]. В связи с этим следует сделать однозначный вывод, что внедрение метода количественного определения РСА3 в клиническую практику может существенно повысить эффективность диагностирования рака предстательной железы и сократить количество ненужных биопсий.

Диагностические системы на определение уровня РСА3 могут быть особенно полезны в наиболее затруднительных для врача ситуациях, а именно: 1) постоянно повышающийся уровень ПСА при негативных результатах одной или нескольких биопсий; 2) уже диагностированный у пациента хронический простатит; 3) низкий уровень ПСА у пациентов, у которых обнаружили рак предстательной железы, или 4) у которых в роду наблюдали случаи этого онкологического заболевания (мониторинг потенциальных больных).

Между тем диагностическое определение РСА3 имеет и ряд недостатков, о которых необходимо упомянуть. На данный момент не существует некой унифицированной методики сбора мочи и методики проведения массажа предстательной железы перед ее сбором. Это затрудняет прямое сравнение разных клинических исследований по использованию диагностической системы определения уровня экспрессии РСА3 в качестве неинвазивного метода диагностики рака простаты. Стоит также отметить, что пока мало данных о том, как влияет прием различных лекарственных препаратов на уровень экспрессии РСА3 клетками предстательной железы, и

потому этот вопрос требует дальнейших исследований [15].

Выводы

Исследования сохранности РНК в клеточных осадках мочи при диагностике рака предстательной железы показали, что наибольший срок хранения осадков с наименьшими потерями РНК составляет 3 суток при -20°С с использованием фиксатора. При необходимости хранения осадков мочи длительное время (до 14 дней) следует также использовать раствор для стабилизации и хранения РНК при температурном режиме -20°С при этом уровень сохранности РНК значительно падает (до 16%).

Литература

1. Ferlay J., Soerjomataram I., Dikshit R., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012 // International Journal of Cancer. — 2015. — Vol. 136, Iss. 5. — P. E359-386.

2. Hessels D., Schalken J.A. The use of PCA3 in the diagnosis of prostate cancer // Nat. Rev. Urol. — 2009. — Vol. 6, Iss. 5. — P. 255-261.

3. Loeb S., Bjurlin M.A., Nicholson J., et al. Overdiagnosis and overtreatment of prostate cancer // European Urology. — 2014. — Vol. 65, Iss. 6. — P. 1046-1055.

4. Nepple K., Strope S., Kibel A., et al. Cost-analysis of pca3 versus PSA in the detection of prostate cancer in men with a prior negative biopsy // General & Epidemiological Trends & Socioeconomics: Practice Patterns, Cost Effectiveness; American Urological Association Education and Research. — 2012. — Abstract №135.

5. Salagierski M., Schalken J.A. Molecular diagnosis of prostate cancer: PCA3 and TMPRSS2:ERG gene fusion // Journal of Urology. — 2012. — Vol. 187. — P. 795-801.

6. Schroder F.H., Hugosson J., Roobol M.J., et al. Screening and prostate-cancer mortality in a

randomized European study // New England Journal of Medicine. — 2009.—Vol. 360, Is. 13. — P. 1320-1328.

7. Schröder F.H., Hugosson J., Roobol M.J., et al. Prostate-Cancer Mortality at 11 Years of Follow-up // New England Journal of Medicine. — 2012. — Vol. 366. — P. 981-990.

8. Schröder F.H., Hugosson J., Roobol M.J., et al. Screening and prostate cancer mortality: results of the European Randomised Study of Screening for Prostate Cancer (ERSPC) at 13 years of follow-up // Lancet. — 2014. — Vol. 384, Is. 9959. — P. 2027-2035.

9. Курзанов А.Н., Стрыгина Е.А., Медведев В.Л. Диагностические и прогностические маркеры рака предстательной железы // Современные проблемы науки и образования. — 2016. — №2. — URL: http:// www.science-education.ru/ru/article/view?id=24439 (дата обращения: 24.05.2020).

10. Павлов К.А., Шкопоров А.Н., Хохлова Е.В., и др. Разработка диагностической тест-системы для ранней неинвазивной диагностики рака простаты, основанной на количественной детекции мРНК гена PCA3 в осадке мочи методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени // Актуальные вопросы онкологии. Вестник РАМН. — 2013. — №5. — С. 45-51.

11. Durand X., Moutereau S., Xylinas E., de la Taille A. Progensa™ PCA3 test for prostate cancer // Expert Rev. Mol Diagn. — 2011. — 11 (2). — P. 137-44.

12. Wang T., Qu X., Jiang J. et al. Diagnostic significance of urinary long non-coding PCA3 RNA in prostate cancer // Oncotarget. — 2017.

13. Quek S.I., Wong O.M., Chen A. et al. Processing of voided urine for prostate cancer RNA biomarker analysis // Prostate. — 2015. — 75 (16). — P. 1886-95.

14. Fradet Y., Saad F., Aprikian A., et al. uPM3, a new molecular urine test for the detection of prostate cancer // Urology. — 2004. — Vol. 64, №2. — P. 311-315.

15. Roobol M.J. Prostate cancer biomarkers to improve risk stratification: is our knowledge of prostate cancer sufficient to spare prostate biopsies safely // Eur. Urol. — 2011. — 60. — P. 223. doi: 10.1016/j.eururo.2011.04.006.