CC BY
93
© Коллектив авторов, 2019
Щубелко Р.В.1, Зуйкова И.Н.2, Шульженко А.Е.2, Андреев И.В.3, Авоян Г.Э.3, Сурова О.С.3
Рецидивирующие воспалительные заболевания ротоглотки - роль факторов мукозального иммунитета
1 Многопрофильный медицинский центр «Клиника К+31», 119415, Москва, Россия
2 Отделение аллергологии № 6 ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, 115478, Москва, Россия
3 Лаборатория моделирования иммунологических процессов № 91 ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, 115478, Москва, Россия
Частые рецидивы воспалительных заблеваний верхних дыхательных путей (ВДП) - состояние, которое выходит за рамки сугубо оториноларгиологической практики. Очевидно, что в таких случаях речь идет о нарушении защитных механизмов на системном и/или местном уровне. Эти пациенты все чаще попадают в поле зрения иммунологов, поэтому на современном этапе необходимо понимать как этиопатогенез данного состояния, так и варианты иммунологической дисфункции, формирующейся у этой группы пациентов.
Цели исследования - определение спектра микробиологического состава ротоглотки и исследование факторов местного иммунитета у пациентов с частыми рецидивами воспалительных заболеваний ВДП. Материал и методы. Определялась бактериальная микрофлора ротоглотки путем посевов из зева, миндалин, наличие и концентрация вирусов герпес-группы в смешанной слюне (методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени), также определялась концентрация защитных факторов слюны (а-дефензины, кателицидин ЬЬ-37, лактоферрин, секреторный ]^А) у пациентов с частыми рецидивами воспалительных заболевания ВДП вне периода обострения. Результаты. У часто болеющих взрослых микробный пейзаж вне периода обострения представлен сочетанной бактериальной (реже патогенной, в большей степени условно-патогенной) и вирусной (преимущественно ВЭБ, ВГЧ 6-го типа) микрофлорой. Также у этих пациентов отмечается нарушение продукции факторов мукозального иммунитета.
Ключевые слова: ВЭБ; ВГЧ 6-го типа; антимикробные пептиды; дефензины; каталецидин ЬЬ-37; лактоферрин; секреторный ^Л
Статья поступила 18.09.2018. Принята в печать 16.11.2018.
Для цитирования: Щубелко Р.В., Зуйкова И.Н., Шульженко А.Е., Андреев И.В., Авоян Г.Э., Сурова О.С. Рецидивирующие воспалительные заболевания ротоглотки - роль факторов мукозального иммунитета. Иммунология. 2019; 40 (1): 35-42. <1ог 10.24411/0206-4952-2019-11004.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Для корреспонденции
Щубелко Розалия Васильевна -врач аллерголог-иммунолог многопрофильного медицинского центра «Клиники К+31», Москва, Россия E-mail: spapharia@gmail.com https://orcid.org/0000-0001-6993-9831
Shchubelko R.V.1, Zuikova I.N.2, Shuljenko A.E.2, Andreev I.V.3, Avoyan G.E.3, Surova O.S.3
Relapsing inflammatory diseases of the oropharynx - the role of mucosal immunity factors
1 Multidisciplinary Medical Center "Clinic K+31", 119415, Moscow, Russia
2 Department of allergology # 6 FSBI National research Center Institute of Immunology Federal Medical-Biological Agency, 115478, Moscow, Russia
3 Laboratory of Immunological Processes Modeling # 91 FSBI National research Center Institute of Immunology Federal Medical-Biological Agency, 115478, Moscow, Russia
Frequent relapses of inflammatory diseases of the upper respiratory tract (URT) - a condition that goes beyond purely otorhinolaryngological practice. Obviously, in such cases it is a violation of protective mechanisms at the system and/or local level. These patients are increasingly in the field of view of immunologists. Therefore, at the present stage it is necessary to understand both the etiopathogenetic state of this condition and the variants of the immunological dysfunction that forms in this group of patients. The aim of this study was to determine the spectrum of the microbiological composition of the oropharynx and to investigate the factors of local immunity in patients with frequent recurrences of inflammatory diseases of the URT.
Material and methods. The bacterial microflora of the oropharynx was determined by sowing from throat, tonsils, the presence and concentration of herpes-group viruses in whole saliva (real-time PCR
For correspondence
Shchubelko Rosalia V. -doctor allergist-immunologist, Multidisciplinary Medical Center "Clinic K+31", Moscow, Russia E-mail: spapharia@gmail.com https://orcid.org/0000-0001-6993-9831
method). The concentration of protective factors of saliva (a-defensins, catelicidin LL-37, lactoferrin, secretory IgA) was also determined in patients with frequent recurrences of inflammatory diseases of the URT outside the exacerbation period.
Results. In a person who is often ill adults, the microbial landscape outside the period of exacerbation is represented by a combined bacterial (less pathogenic, mostly conditionally pathogenic) and viral (mainly EBV, HHV 6) microflora. Also in these patients there is a disturbance in the production of mucosal immunity factors.
Keywords: EBV; HHV 6; antimicrobial peptides; defensins; catalethicin LL-37; lactoferrin; secretory IgA
Received 18.09.2018. Accepted 16.11.2018.
For citation: Shchubelko R.V., Zuikova I.N., Shuljenko A.E., Andreev I.V., Avoyan G.E., Surova O.S. Relapsing inflammatory diseases of the oropharynx - the role of mucosal immunity factors. Immunologiya. 2019; 40 (1): 35-42. doi: 10.24411/0206-4952-2019-11004. (in Russian)
Acknowledgments. The study had no sponsorship.
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Орофарингеальная слизистая оболочка обеспечивает обработку огромного количества респираторных, пищевых, инфекционных и неинфекционных антигенов, с одной стороны, эффективно и быстро нейтрализуя потенциально опасные биологические субстанции, с другой - формируя толерантность к непатогенным организмам (комменсалам).
Защитные свойства слизистой ротоглотки реализуются особенностями ее структуры и организации. Она представлена многослойным неороговевающим эпителием, создающим плотный механический барьер для проникновения патогенов. Кроме того, слизистая ротоглотки оснащена хорошо развитым иммунологическим аппаратом, являясь зоной активности NALT (nasopharynx-associated lymphoid tissue), включающим как организованные тканевые структуры (миндалины, лимфоидные фолликулы), так и диффузную лимфоидную ткань. Благодаря NALT здесь осуществляются иммунные реакции врожденного и адаптивного иммунитета [1]. Смешанная слюна - еще одна характерная составляющая ротоглотки - играет важную роль в поддержании физико-химического гомеостаза ротовой полости, способствует реэпителизации повреждений слизистой оболочки. Защитные факторы слюны (кати-онные белки, бактерицидные пептиды, ферменты, иммуноглобулины, муцины) являются активными участниками мукозального иммунитета [2].
Основные источники защитных протеинов в слюне -нейтрофилы, первые эффекторные клетки, попадающие в очаг воспаления. Защитные протеины присутствуют в слюне, как правило, в низких, клинически не значимых концентрациях. Однако, несмотря на это, они все же обеспечивают эффективную нейтрализацию патогенов: либо путем локального повышения их концентрации, либо благодаря одновременному воздействию разных защитных белков на один вид патогена. Защитные протеины слюны обладают антибактериальными, противовирусными и противогрибковыми свойствами - они могут связывать патогены, обеспечивая их агглютинацию и изоляцию на поверхности слизистой оболочки, или же непосредственно разрушать микробную мембрану. Эффекты различных компонентов слюны могут быть аддитивными и/ или синергичными. Таким образом, активность защитных факторов слюны носит многофункциональный характер, что позволяет комбинировано воздействовать на антигены, обеспечивая их эффективную элиминацию [3].
Среди защитных факторов ротовой полости особое место занимают бактерицидные, или антимикробные, пептиды (АМП). Они обладают широким спектром антимикробной активности, действуя против грампо-ложительных и грамотрицательных бактерий, а также дрожжевых грибов и некоторых вирусов. В настоящее время стало ясно, что в ротовой полости АМП не только уничтожают патогенные микроорганизмы, но и участвуют в поддержании нормальной микрофлоры.
Известны 3 механизма разрушения клеточной мембраны антимикробными пептидами: «бочка», «тороидальная пора», «ковер» (рис. 1).
При достижении критической пороговой концентрации пептидов они агрегируются на мембране, что приводит к образованию трансмембранной поры, выстилаемой пептидом, который рассеивает протонные и ионные градиенты - модель «бочка»; в этом случае толщина и однородность мембраны не изменяются. В другом случае при критической концентрации пептида происходит изменение кривизны мембраны, она изгибается внутрь, что приводит к образованию поры, которая выстилается как пептидами, так и липидными группами - модель «тороидальная пора». Этот вариант приводит к уменьшению толщины мембраны и изменению однородности ее поверхности. Некоторые антимикробные пептиды связываются с фосфолипидными
Рис. 1. Механизмы действия антимикробных пептидов [4]
группами электростатическими взаимодеиствиями и выравниваются параллельно поверхности мембраны наподобие ковра до достижения критической пороговой концентрации - модель «ковер». В дальнейшем происходят мицеллизация фрагментов мембраны и сильное снижение ее гомогенности [4].
Дефензины
Дефензины - катионные пептиды молекулярной массой 3-5 кДа. Обычно дефензины содержат около 30 аминокислотных остатков с характерным высоким содержанием аргинина и других основных аминокислот (лизина, гистидина), а также гидрофобных аминокислот (валина, лейцина, пролина). Основные и гидрофобные аминокислоты пространственно разобщены, что придает молекуле пептида амфипатичность.
Для дефензинов характерна Р-складчатая, или шпилькообразная, глобулярная структура, стабилизируемая 3 внутримолекулярными дисульфидными мостиками, связывающими 6 цистеиновых аминокислот. В зависимости от расположения дисульфидных связей выделяют а-, в- и 0-дефензины. Для а-дефензинов характерно следующее распределение дисульфидных связей (указаны номера остатков цистеина, скрепляемых связью): 1-6, 2-4, 3-5. Связь между 1-м и 6-м остатками цистенина делает молекулу циклической. Эта цикличность не характерна для в-дефензинов, тогда как 9-дефензины образуют цикл за счет пептидной связи между крайними, а не цистеиновыми остатками [1].
В настоящее время охарактеризовано 6 групп а-дефензинов (HNP, human neutrophils peptides). Из них 4 группы (HNP-1-4) образуются в нейтрофилах, а еще 2 выделены из клеток Пеннета и обозначаются HD5 и HD6 (от Human Defensin). Все HNP организма человека выделяются из гранул нейтрофилов до созревания и дифференцировки клеток. У здорового человека HNP-1-3 наиболее обильно присутствуют в слюне (около 99%), уровень HNP-4 примерно в 100 раз ниже [5-7].
Положительно
заряженные дефензимы I
+ * + + + +
Отрицательно заряженные ООГо-Г^ _ ООЛГ"й"^ фосфолипиды клеточной QftQi мембраны микроорганизма П и П и
шш
Формирование поры в мембране
Выход веществ * 0 из клетки
Рис. 2. Механизм действия дефензинов [5]
Семейство в-дефензинов (human Beta Defensin, hBD) содержит 6 членов (hBD-1-6), и все они в основном экс-прессируются на эпителиальных клетках кожи и слизистых оболочек (ротовая полость, дыхательные пути, желудочно-кишечный и мочеполовой тракт, почки) [8].
Часть дефензинов синтезируется конститутивно, образование других молекул повышается в ответ на инфекцию или активный синтез провоспалительных цитокинов.
Как а-дефензины, так и в-дефензины имеют широкую антибактериальную активность, основанную на особенностях катионных пептидов, несущих положительный заряд. В отличие от эукариотических клеток, имеющих маленький заряд либо не имеющих его вовсе, мембраны бактериальных клеток заряжены отрицательно. Контакт дефензинов с клетками микроорганизмов не зависит от рецепторов и обусловлен электростатическими взаимодействиями положительно заряженных остатков собственных аминокислот с отрицательно заряженными группами [в составе пепти-догликанов, липолисахаридов (ЛПС) и др.] на поверхности патогенов. Благодаря своему положительному заряду дефензины сначала адсорбируются на отрицательно заряженной мембране бактерии, затем агрегируются и интегрируются в липидный бислой (рис. 2).
В реализации следующей фазы взаимодействия де-фензинов с патогеном решающая роль принадлежит амфипатичности их структуры: положительно заряженные группы продолжают контактировать с анионными молекулами клеточной стенки, а гидрофобные участки способствуют внедрению молекулы в клеточную мембрану патогена, что приводит к нарушению ее целостности. Интеграция дефензинов на поверхности мембраны содействует к формированию ионных каналов, трансмембранных пор, мембранных разрывов, результатом чего является гибель бактерии. На данный момент до конца не выяснено, как катионные пептиды (включая де-фензины) проходят через полисахаридную капсулу бактерии и пептидогликановые слои мембраны, возможно, переваривание пептидогликанов лизоцимом слюны помогает им преодолеть этот барьер.
Кроме своей антибактериальной активности, дефен-зины также проявляют противогрибковые, противовирусные, иммуномодулирующие свойства, способствуя секреции определенных цитокинов, и являются хемо-аттрактантами для дендритных клеток и Т-лимфоцитов [5, 7, 9].
Кателицидины
Кателицидины - положительно заряженные амфи-патические пептиды. Единственный кателицидин человека носит название LL-37, так как он состоит из 37 аминокислотных остатков и содержит 2 остатка лейцина на N-конце. При нейтральных значениях рН пептид LL-37 заряжен положительно, и более половины его аминокислотных остатков неполярны. В водном растворе LL-37 образует беспорядочный клубок, но формирует
а-спираль при встраивании в двойной слой липидов биологических мембран. Способность образовывать а-спираль, по-видимому, и определяет антимикробную активность данного пептида. Механизм антимикробного действия кателицидина человека отличается от такового дефензинов [3, 5]. Предполагается, что LL-37 покрывает мембрану наподобие ковра и разрушает ее аналогично детергентам с образованием множества мицелл (рис. 3).
Этот пептид оказывает синергический антибактериальный эффект с дефензинами. Также LL-37 связывает и нейтрализует бактериальные ЛПС и, весьма вероятно, участвует в реэпитализации ран и язв в полости рта.
В смешанную слюну человеческий кателицидин выделяется нейтрофилами и в меньшей степени эпителиальными клетками. Синтез человеческого кателицидина в различных клетках регулируется факторами роста и дифференцировки и зависит от присутствия микроорганизмов. LL-37 проявляет антимикробную активность против грамположительных и грамотрицательных бактерий. Кателицидин LL-37 является хемоаттрактантом для иммунных клеток и вызывает миграцию нейтрофи-лов, моноцитов и Т-лимфоцитов в зону воспаления.
Некоторые исследователи считают, что человеческий кателицидин является сигналом тревоги (DAMP), и основная его функция - активация антиген-презентирующих клеток [3, 5, 10, 11].
Лактоферрин
Лактоферрин - связывающий ионы металлов кати-онный гликопротеин массой 80 кДа, состоит из одной полипептидной цепи (673 аминокислотных остатка), образующей 2 гомологичных домена, называемых N-и С-долями, в которых идентичны 40% остатков. Каждая доля содержит по одному железосвязывающему центру. Основными источниками лактоферрина слюны являются слюнные железы, нейтрофилы, клетки эпителия слизистой оболочки, жидкость десневой борозды. Лактоферрин - важная составляющая защитных механизмов слизистых оболочек благодаря способности связывать ионы железа, поддерживать кислую рН в очаге инфекции и воспаления и катионным свойствам, что позволяет ему оседать на негативно заряженных мембранах патогенов и связывать анионные молекулы (ДНК, гепарин, гликозамингликан). Лактоферрин активен против бактерий, грибов и вирусов. Лактоферрин является известным скавенджером (поглотителем) ионов железа, образует хелаты с ионами Fe3+ и создает их дефицит, лишая патогенную микрофлору микроэлемента, необходимого для ее пролиферации. Кроме того, многие микроорганизмы экспрессируют на своей поверхности рецепторы для лактоферрина; связывание его с такими рецепторами приводит к гибели микроорганизма, например, вследствие инициации процесса высвобождения липо-полисахаридов из клеточных стенок [1, 12, 13].
Как уже упоминалось, лактоферрин несет положительный заряд, благодаря чему он может связываться с мембранами клеток бактерий, разрушая их. Также лак-
^^ Кателицидин человека
(LL-37)
I
ЯШ
оооооооооооо
Кателицидин покрывает наружную мембрану клетки микроорганизма в виде ковра
гЛ -1'
Выход клеточного содержимого наружу
Vv^
Разрушение мембраны с образованием мицелл
Рис. 3. Механизм действия каталецидина LL-37 [5]
тоферрин способен связывать адгезины бактериальных фимбрий, ингибируя эпителиальную адгезию определенных бактерий.
Противовирусная активность лактоферрина базируется на связывании (и блокировке) определенных клеточных гликозамингликанов, используемых вирусами при адсорбции. Это препятствует проникновению вирусных частиц в клетки микроорганизма. Также лактоферрин может нейтрализовать вирусы прямым связыванием либо путем блокировки клеточных рецепторов. Благодаря этим свойствам лактофер-рин предотвращает развитие вирусной инфекции на ранней стадии [1, 12, 13].
Антитела в слюне
Специфические плазмациты МАЬТ в основном се-кретируют димерные формы молекулы ]£А и немного пентамерных молекул, каждая из которых стабилизируется 1-цепью. Оба типа иммуноглобулинов усваиваются из интерстиция и экспортируются в слюну через общие транспортные механизмы эпителия слюнных желез, утилизирующие полимерный иммуноглобули-новый рецептор (р^Я) и секреторный компонент (8С). Секреторный ^А (б^л) и, возможно, секреторный ^М (б^М) экскретируются в слюне конститутивно, при отсутствии стимуляции.
На базолатеральной поверхности эпителия 1-цепь димерного/полимерного и пентамерного связывается с секреторным компонентом р1§К по принципу «ключ в замок», запуская молекулярный транспорт, который заканчивается экзоцитозом 8С-связанных антител через апикальную поверхность клеток в просвет железы или ротовой полости. Процесс экзоцитоза сочетается с отщеплением секреторного компонента от р^Я, после чего остатки 8С по-прежнему включаются
Эпителиальная клетка
В-клетка
plgR
SC
slgA
dlgA
Рис. 4. Секреторный IgA. 1 - Димерный IgA связывается с полимерным иммуноглобулиновым рецептором (pIgR) в lamina propria. 2 - Эндоцитоз и трансцитоз комплекса dIgA + pIgR от базолатеральной к апикальной стороне эпителия слизистой оболочки. 3 - Внутриклеточное протеолитическое расщепление pIgR, создающее секреторный компонент (SC) и sIgA. 4 - Высвобождение SC и sIgA на поверхность слизистой оболочки [14]
в структуру sIgA и sIgM, наделяя секреторные иммуноглобулины устойчивостью против протеолитической деградации (рис. 4).
Свободные SC способны ингибировать эпителиальную адгезию некоторых бактерий, связывать фимбри-альные адгезины бактерий, нейтрализовать некоторые бактериальные токсины. Кроме того, sIgA обладает му-кофильными свойствами, что способствует закреплению его на слизистом слое слизистой оболочки. Секреторные иммуноглобулины слюны обеспечивают инактивацию патогенов: бактерий, грибов и вирусов, а также некоторых микробных токсинов, путем связывания и/ или агглютинации их частиц, фиксируя их на поверхности и иммобилизируя до элиминации, предупреждая инвазию патогенов в подлежащие ткани. Связывание антигена и агглютинация также приводят к фагоцитозу (с последующей антигенной презентацией и лизисом) и к продукции цитокинов в присутствии иммунокомпе-тентных клеток: клеток Лангерганса, дендритных клеток, нейтрофильных гранулоцитов. Все иммуноглобулины независимо от их происхождения и антигенной специфичности способны индуцировать и катализировать образование озона, что приводит к эффективному микробному киллингу. Интересно, что не только полноценные иммуноглобулины способны катализировать реакцию, но и их фрагменты, и даже одиночные аминокислоты: триптофан, метионин, цистеин и гистидин. IgA слюны (секреторный и мономер) не способны непосредственно активировать систему комплемента, тогда как IgG слюны являются активатором комплемента [1, 12, 14].
Материал и методы
Цели настоящего исследования - определение спектра микробиологического состава ротоглотки и иссле-
дование факторов местного иммунитета у пациентов с частыми рецидивами воспалительных заболеваний верхних дыхательных путей (ВДП).
Всего обследованы 40 пациентов, мужчин и женщин, которые обращались амбулаторно в клинику ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России по поводу частых обострений хронических воспалительных заболеваний ВДП (фарингит, тонзиллит, тонзилло-фарингит) - часто болеющие взрослые. В среднем частота обострений хронического фарингита/тонзиллита составила не менее 5 раз в год, средний показатель по группе - 7,1 ± 2,1 раза в год.
Группа сравнения состояла из условно здоровых лиц, не переносивших острых или обострений хронических заболеваний ВДП в течение 3 мес перед обследованием (n = 20).
Критерии исключения: признаки хронического тонзиллита токсико-аллергической формы II стадии, атро-фическая и катаральная форма хронического фарингита, хронические риносинуситы, в том числе аллергической этиологии. Кроме того, в исследование не включали пациентов с множественным поверхностным или глубоким кариесом, курящих, а также женщин в период беременности или лактации.
Исследование спектра факторов мукозального иммунитета и бактериально-вирусной флоры ротоглотки проводили вне периода обострения хронических заболеваний ВДП.
Факторы мукозального иммунитета определяли в смешанной слюне, собранной утром натощак в стерильные контейнеры и доставленной в течение 2 ч с момента забора. Количественное определение дефензинов HNP1-3, кателицидина LL-37 и лактоферрина определяли иммуноферментным методом ELISA kit, производитель Hycult Biotechnology (H.B.T.) B.V., Нидерланды (поставщик ЗАО «БиоХимМак», Россия). Количественно секреторный IgA определяли иммунофермент-ным методом ELISA kit Immundiagnostik AG, Германия (поставщик ЗАО «БиоХимМак», Россия).
Вирусную нагрузку определяли в смешанной слюне, собранной утром натощак в стерильные контейнеры и доставленной в течение 2 ч с момента забора. Выявление и количественное определение ДНК вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ), вируса герпеса человека 6-го типа (ВГЧ 6), цито-мегаловируса (ЦМВ) в биоматериале проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс® EBV-скрин/ монитор-FL», «АмплиСенс® HHV6-скрин-титр-FL», «АмплиСенс® CMV-скрин/монитор-FL» разработанных ФБУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора в режиме реального времени с помощью прибора «Applied Biosystems 7300 Real Time PCR System».
Забор биоматериала для микробиологического исследования проводили стерильным тупфером для взятия мазков (Sarstedt), собирали между дужками миндалин, по язычку и задней стенке глотки, не касаясь губ, щек и языка. Материал доставляли в термоконтейнерах в течение 2 ч с момента забора. Посев осуществляли на
нескольких питательных средах: кровяной агар с добавлением 5% крови крупного рогатого скота, на основе колумбийского агара (PRONADISA, Испания); уриселект (Bio-Rad, США); желточно-солевой агар (на основе солевого агара) и агар Сабуро (PRONADISA, Испания). Все посевы культивировали по стандартной методике при температуре 37,0 °С в течение 24-48 ч.
Тинкториальные свойства изучали путем окраски по Граму по общепринятой методике, в соответствии с инструкцией производителя. Биохимическую идентификацию выделенных микроорганизмов осуществляли с помощью полуавтоматического бактериологического фотометра BBL Crystal AutoReader (BD Biosciences); для дрожжевых грибов использовали среду Сабуро (производство фирмы PRONADISA, Испания), с последующей идентификацией на хромогенном агаре (PRONADISA, Испания), с ручной постановкой чувствительности к антимикотикам (производство Научно-исследовательский центр фармакотерапии - НИЦФ), труднокультивируемых грибов на автоматическом бактериологическом анализаторе VITEK® 2 COMPACT и на автоматическом микробиологическом анализаторе BD Phoenix 100 с последующим подтверждением и чувствительностью к антимикотикам; Slidex pneumokit - сенсибилизированный латекс использовали для определения пневмококков (bioMerieux, Франция), оптохиновый тест, тест с желчью, определение каталаз-ной активности (Bio-Rad, США). Гемолитическую активность культур изучали на агаре с добавлением 5% эритроцитов барана.
Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета прикладных программ Statistica 10.0. В процессе анализа полученных данных и проверки их на нормальность распределения установлено, что данные имеют характер распределения, отличный от нормального, поэтому для их статистической обработки использовали непараметрические методы. Для сравнения двух независимых групп применяли непараметрический критерий Манна-Уитни. Критическое значение уровня статистической значимости при проверке нулевых гипотез принимали равным 0,05.
Результаты и обсуждение
В ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России амбулаторно обследовано 40 пациентов, мужчин и женщин, с частыми, не менее 5 раз в год, обострениями хронического воспаления ротоглотки (тонзиллиты/ фарингиты), в возрасте от 18 до 60 лет. В контрольную группу вошли 20 пациентов, условно здоровых, не переносивших острых воспалительных заболеваний ВДП в течение 3 мес перед обследованием.
Основные жалобы пациентов исследуемой группы: дискомфорт в горле в виде першения, саднения, неловкости и/или жжения, боли при глотании («пустой глоток»), «простреливание» в ухо, ощущение крупинок на языке (пробок из миндалин), покалывание при глотании и разговоре, нерезкие болевые ощущения
в области регионарных лимфатических узлов и общая симптоматика - слабость, недомогание, субфебрилитет. Все указанные жалобы беспокоили пациентов в период обострения, однако могли сохранятся и в ремиссии, но с меньшей интенсивностью.
При исследовании микробного пейзажа ротоглотки исследуемых выяснилось, что встречаемость патогенных возбудителей в целом, как в группе с хроническими воспалительными заболеваниями ВДП вне периода обострения, так и в группе условно здоровых лиц, значительно ниже, чем выявляемость условно-патогенной флоры.
Наиболее частым представителем патогенной бактериальной флоры оказался Staphylococcus aureus, который выявлялся в 30% случаев у лиц исследуемой группы, в группе сравнения этот возбудитель выявлялся достоверно реже - в 15% случаев.
Доля другой патогенной микрофлоры, характерной для острых воспалительных процессов ротоглотки, невысока: Streptococcus pneumoniae - 2,5% случаев, Pseudomonas aeruginosa - 2,5%, энтеробактерии (Proteus mirabilis, Serratia marcesceus, Klebsiella pneumoniae) -5,0%. В группе условно здоровых лиц патогенная микрофлора выявлена менее чем в 2% случаев. Грибковая флора (C. albicans) встречается в 3 раза чаще в исследуемой группе.
Наиболее часто в посевах из зева пациентов исследуемой группы обнаруживались представители р-гемолитических стрептококков группы В -Streptococcus milleri group (Str. anginosus, Str. Intermedius, Str. Constellatus, Str. agalactiae) и грамположительные а-гемолитические стрептококки - Strept. anginosus group, Strept. sanguinis group, Strept. viridans, тогда как в группе условно здоровых лиц чаще встречаются Strept. mitis group, Strept. sanguinis group. Таким образом, преобладающая микрофлора вне периода обострения как в исследуемой группе, так и в группе контроля представлена преимущественно условно-патогенной флорой, а патогенные микроорганизмы, характерные для острой фазы воспаления, встречаются крайне редко.
При изучении образцов смешанной слюны у пациентов исследуемой группы, установлена высокая частота обнаружения герпесвирусной инфекции - ДНК ВЭБ - 65% случаев, при этом в 55% случаев в сочетании с ДНК ВГЧ 6-го типа, и лишь в 10% случаев в виде моноинфекции. Выявление ДНК ВГЧ 6-го типа в виде моноинфекции наблюдалось в 30% случаев.
В группе сравнения герпесвирусы выявлялись значительно реже: ДНК ВЭБ в 20% случаев (в сочетании с ДНК ВГЧ 6-го типа в 15%, в виде моноинфекции в 5% случаев). ДНК ЦМВ не выявлялась в смешанной слюне пациентов исследуемой и контрольной групп. ДНК ВГЧ 6-го типа одинаково часто обнаруживалась как у пациентов с хронической рецидивирующей патологией ВДП, так и в группе условно здоровых лиц. Отсутствие вирусной репликации в слюне достоверно чаще встречалось в группе сравнения - в 40% случаев, по сравнению с 5% пациентов исследуемой группы (р < 0,05).
1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400
Box & Whisker Plot
Var 1 vs Var 2
□ Mean
□ Mean ±SE
X Mean ±1,96*SE
40 38 36 34 32 30 28 26 24 22 20 18 16 14
Box & Whisker Plot
Var 7 vs Var 8
Рис. 5. Титры а-дефензинов (HNP1-3) в смешанной слюне пациентов исследуемой и контрольной групп. Var1 - группа контроля, Var2 - исследуемая группа
Рис. 6. Титры кателицидина ЬЬ-37 в смешанной слюне пациентов исследуемой и контрольной групп. Уаг7 - группа контроля, Уаг8 - исследуемая группа
Var 1
Var 2
При количественной оценке выяснилось, что в исследуемой группе средняя концентрация вирусной нагрузки ВЭБ составила 4,55 ± 0,95 ^ копий на 105 клеток человека (кл. чел.), что достоверно выше концентрации вирусов в группе условно здоровых лиц. Для ВГЧ 6-го типа средняя концентрация вирусной нагрузки составила 3,37 ± 0,35 ^ копий на 105 кл. чел., что также выше средней концентрации этого патогена, чем в группе сравнения.
Таким образом, у часто болеющих взрослых микрофлора ротоглотки представлена сочетанием бактериальных и вирусных патогенов, которые в клинически значимых концентрациях определяются и вне периода обострения, что может способствовать снижению активности факторов местного иммунитета.
В реализации первой линии защиты в слизистых оболочках ротоглотки решающая роль принадлежит клеткам врожденного иммунитета, прежде всего воспалительным макрофагам - нейтрофилам. Нейтрофилы обладают высоким защитным потенциалом, осуществляемым главным образом в виде фагоцитоза. Помимо кислородзависимых факторов бактерицидности и ферментов, для эффективного функционирования ней-трофилов огромное значение имеют катионные белки (лизоцим, лактоферрин, серпроцидины, ВР1-протеины) и антимикробные пептиды (дефензины, кателицидин).
Исследование антимикробных пептидов слюны часто болеющих взрослых показало достоверно более низкие титры в группе исследования по сравнению с контрольной группой (р < 0,05). Так, в среднем по группе контроля для а-дефензинов (И№1-3) этот показатель составил 1500,88 ± 100,95 нг/мл, тогда как в исследуемой группе всего 801,50 ± 95,59 нг/мл (рис. 5).
Аналогичная тенденция прослеживается и в отношении кателицидина ЬЬ-37 - титры кателицидина в смешанной слюне пациентов в среднем по группе контроля составили 29,96 ± 4,52 нг/мл, а в исследуемой группе - 18,60 ± 1,69, р < 0,05 (рис. 6).
Снижение титров антимикробных пептидов в группе часто болеющих взрослых свидетельствует о функциональной недостаточности эффекторных клеток врожденного иммунитета. Это может быть обусловлено постоянным присутствием смешанной бактериально-вирусной флоры с тенденцией к активации либо бактериального, либо вирусного компонента, постоянным поддержанием хронического очага воспаления и в связи с этим отсутствием возможности восстановления факторов мукозального иммунитета, вне периода обострения.
Лактоферрин, катионный белок, является важной составляющей системы неспецифической антимикробной защиты слизистых оболочек. Содержание этого белка в слюне больных должно быть значительно выше по сравнению со здоровыми лицами. Однако в нашем исследовании в отношении лактоферрина различия по группам неочевидны, и даже прослеживается тенденция к более высокой его концентрации в слюне контрольной группы - в среднем 899,77 ± 62,80 нг/мл, тогда как в исследуемой группе - 857,34 ± 34,88 нг/мл (рис. 7).
Такой неадекватный ответ на воспаление свидетельствует об истощении факторов врожденного иммунитета, что приводит к снижению резистентности слизистых оболочек на воздействие патогенов. Как и в случае с антимикробными пептидами (дефензины, кателици-дин), к таким нарушениям проводит хронизация воспаления в ротоглотке, обусловленная персистирующей бактериально-вирусной флорой, что не дает возможности обновить и/или восстановить элементы муко-зальной иммунной защиты и, как следствие, приводит к частым обострениям хронического воспаления - порочный круг замыкается.
Секреторный ]£А - важнейший эффекторный фактор мукозальных лимфоидных тканей - отражает состояние адаптивного иммунитета слизистых оболочек. При исследовании титров б^А в смешанной слюне выяснилось, что у большинства пациентов группы исследова-
800,00 600,00 400,00 200,00 0,00.
899,77 нг/мл
Лактоферрин
2,50 2,000 1,50 1,00 0,50 0,00
0,86* г/л
JL
Секреторный IgA
2,28* г/л
1,30 г/л
1,42 г/л
Контрольная группа Исследуемая группа
46% исследуемой 24% исследуемой 30% исследуемой Контрольная группа группы группы группы
Рис. 7. Концентрация лактоферрина в смешанной слюне пациентов исследуемой и контрольной групп
Рис. 8. Титры в смешанной слюне пациентов исследуемой и контрольной групп
ния (70%) уровень sIgA ниже, чем в группе контроля, и колеблется в пределах от 0,86 ± 0,05 до 1,30 ± 0,03 г/л, тогда как в группе контроля - 1,42 ± 0,07 г/л. Только у 30% пациентов исследуемой группы уровень sIgA достоверно выше, чем в контрольной группе, - 2,28 ± 0,09 г/л, и говорит о достаточной активности этого звена муко-зального иммунитета (рис. 8).
Низкие титры sIgA у часто болеющих взрослых свидетельствуют об истощении гуморального звена вследствие недостаточности клеточных факторов местного иммунитета, в частности В-лимфоцитов - плазмоциты, продуцентов sIgA и Т-лимфоцитов - ThZ-клеток. Выявленные нарушения, несомненно, вносят свой вклад в общую несостоятельность иммунитета слизистых оболочек.
Таким образом, у часто болеющих лиц наблюдается многоступенчатая недостаточность защитных факторов на уровне как врожденного (антимикробные пептиды, катионные белки), так и адаптивного (sIgA, В- и ТЬ-лимфоциты) звеньев мукозального иммунитета.
Выводы
1. У часто болеющих взрослых микробный пейзаж вне периода обострения представлен сочетан-ной бактериально-вирусной микрофлорой: условно-патогенными, очень редко, патогенными бактериями (в основном Staphylococcus aureus) и представителями герпес-группы (преимущественно, ВЭБ, ВГЧ 6), что может играть роль в хронизации воспаления в ротоглотке,
способствовать снижению местного иммунитета и приводить к частым обострениям патологии ВДП.
2. Наиболее часто в смешанной слюне исследуемой группы по сравнению с другими герпесвирусами и с группой условно здоровых лиц встречается ДНК ВЭБ, что может указывать на его роль в поддержании воспаления и/или усугублении агрессивного действия бактериальной микрофлоры. ДНК ВГЧ 6-го типа одинаково часто выявляется в обеих группах, поэтому его значение в хронизации воспаления ротоглотки до конца не выяснено.
3. В смешанной слюне часто болеющих взрослых отмечаются низкие уровни факторов мукозального иммунитета по сравнению с условно здоровыми лицами: антимикробных пептидов (а-дефензинов, кателици-дина), лактоферрина и секреторного ^А, - что свидетельствует об иммунологической несостоятельности механизмов иммунной защиты, ассоциированной, по всей видимости, с персистирующей бактериально-вирусной флорой.
4. Лечение пациентов с часто рецидивирующими воспалительными заболеваниями ВДП должно предусматривать комплексный подход: воздействие на этиологическое звено процесса (бактериально-вирусное) и коррекцию мукозального иммунитета слизистых оболочек. Такая стратегия позволит разорвать порочный круг хронического воспаления, обеспечит адекватный иммунный ответ на местном уровне и снизит частоту рецидивов воспаления в ротоглотке.
■ Литература
1. Ярилин А.А. Иммунология : учебник. М. : ГЭОТАР-Медиа, 2010.
2. Fabian K.T., Hermann P., Beck A., Fejerdy P. et al. Salivary defense proteins: their network and role in innate and acquired oral immunity. Int. J. Mol. Sci. 2012; 13: 4295-320.
3. Khurshid Z., Naseem M., Sheikh Z., Najeeb S. et al. Oral antimicrobial peptides: types and role in the oral cavity. Saudi Pharm. J. 2016; 24: 515-24.
4. Silva P.M., Gonjalves S., Santos N.C. Defensins: antifungal lessons from eukaryotes. Front. Microbiol. 2014; 5: 97.
5. Вавилова Т.П., Деркачева Н.И., Островская И.Г. Антимикробные пептиды - многофункциональная защита тканей полости рта. Рос. стоматология. 2015; 3: 3-12.
6. Мамчур В.И., Левых А.Э. Дефензины - эндогенные пептиды с антиинфекционными и противоопухолевыми свойствами. Таврический мед.-биол. вестн. 2012; 15 (2): 315-21.
7. Kamekura R., Imai R., Takano K., Yamashita K. et al. Expression and localization of human defensins in palatine tonsils. Adv. Otorhinolaryngol. 2016; 77: 112-8.
8. Будихина А.С., Пинегин Б.В. Дефензины - мультфункцио-нальные катионные пептиды человека. Иммунология, аллергология, инфектология. 2008; 2: 31-40.
9. Wang G. Human antimicrobial peptides and proteins. Pharmaceuticals. 2014; 7: 545-94.
10. Smet K., Contreras R. Human antimicrobial peptides: defensins, cathelicidins and histatins. Biotechnol. Lett. 2005; 27: 1337-47.
11. Dale B.A., Fredericks L.P. Antimicrobial peptides in the oral environment: expression and function in health and disease. Curr. Issues Mol. Biol. 2005; 7 (2): 119-33.
■ References
1. Yarilin A.A. Immunology: A textbook. Moscow: GEOTAR-Media, 2010. (in Russian)
2. Fabian K.T., Hermann P., Beck A., Fejerdy P. et al. Salivary defense proteins: their network and role in innate and acquired oral immunity. Int. J. Mol. Sci. 2012; 13: 4295-320.
3. Khurshid Z., Naseem M., Sheikh Z., Najeeb S. et al. Oral antimicrobial peptides: types and role in the oral cavity. Saudi Pharm. J. 2016; 24: 515-24.
4. Silva P.M., Gonjalves S., Santos N.C. Defensins: antifungal lessons from eukaryotes. Front Microbiol. 2014; 5: 97.
5. Vavilova T.P., Derkacheva N.I., Ostrovskaya I.G. Antimicrobial peptides - multifunctional protection of oral tissues. Rossiyskaya stomatologiya. 2015; (3): 3-12. (in Russian)
6. Mamchur V.I., Leviev A.E. Defensins are endogenous peptides with anti-infectious and antitumor properties. Tavricheskiy mediko-biologicheskiy vestnik. 2012; 15 (2): 315-21. (in Russian)
7. Kamekura R., Imai R., Takano K., Yamashita K., Jitsukawa S. et al. Expression and localization of human defensins in palatine tonsils. Adv. Otorhinolaryngol. 2016; 77: 112-8.
12. Fabian T.K., Hermann P., Beck A., Fejerdy P. Salivary defense proteins: their network and role in innate and acquired oral immunity. Int. J. Mol. Sci. 2012; 13: 4295-320.
13. Berlutti F., Pantanella F., Natalizi T. et al. Antiviral properties of lactoferrin - a natural immunity molecule. Molecules. 2011; 16: 6992-7018.
14. Turula H., Wobus C.E. The role of the polymeric immunoglobulin receptor and secretory immunoglobulins during mucosal infection and immunity. Viruses. 2018; 10 (5): 237.
8. Budigina A.S., Pinegin B.V. Defensins are multifunctional human cationic peptides. Immunologiya, allergologiya, infektologiya. 2008; (2): 31-40. (in Russian)
9. Wang G. Human antimicrobial peptides and proteins. Pharmaceuticals. 2014; 7: 545-94.
10. Smet K., Contreras R. Human antimicrobial peptides: defensins, cathelicidins and histatins. Biotechnol. Lett. 2005; 27: 1337-47.
11. Dale B.A., Fredericks L.P. Antimicrobial peptides in the oral environment: expression and function in health and disease. Curr. Issues Mol. Biol. 2005; 7 (2): 119-33.
12. Fabian T.K., Hermann P., Beck A., Fejerdy P. Salivary defense proteins: their network and role in innate and acquired oral immunity. Int. J. Mol. Sci. 2012; 13: 4295-320.
13. Berlutti F., Pantanella F., Natalizi T. et al. Antiviral properties of lactoferrin - a natural immunity molecule. Molecules. 2011; 16: 6992-7018.
14. Turula H., Wobus C.E. The role of the polymeric immunoglobulin receptor and secretory immunoglobulins during mucosal infection and immunity. Viruses. 2018; 10 (5): 237.
