CC BY
18РЕСТРУКТУРИЗАЦИИ ХРОМАТИНА И ИЗМЕНЕНИЕ УРОВНЯ
ОТНОСИТЕЛЬНОЙ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ IL8, IL-1ß и TNF НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ ПОД ВЛИЯНИЕМ ГМДП и ИФН-Y У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ГАЙМОРИТОМ В СИСТЕМЕ
IN VITRO
2 1 11 Нестерова И.В., Евглевский А.А., Чудилова Г.А.,
Ломтатидзе Л.В., Калашников А.Е.
1 Кубанский государственный медицинский университет,
г. Краснодар
Российский университет дружбы народов, г. Москва, Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, г. Москва
Аннотация. Методом полимеразной цепной реакции а сочетании с поляризационно - микроскопическим анализом хроматина НГ показано, что у здоровых людей и больных хроническим гайморитом при индукции НГ в системе in vitro, с помощью ГМДП и ИФНу происходит достоверное увеличение реструктуризации хроматина НГ, сопровождающееся увеличением экспрессии генов IL8, IL-1ß и TNF относительно неиндуцированного контроля. Корреляционная связь (КС) между уровнем экспрессии генов изученных цитокинов с уровнем реструктуризации хроматина НГ у здоровых людей всегда носит прямой характер, а ее уровень колеблется от умеренно до сильного. У больных хроническим гайморитом данный показатель отличается существенной вариабельностью, что связано с индивидуальными особенностями течения патологического процесса у обследованных пациентов. При этом у здоровых людей уровень относительной экспрессии генов изученных цитокинов существенно выше, чем у больных гайморитом.
Ключевые слова: хроматин, цитокины, нейтрофилы, хроматин-активация, ПЦР, интерлейкины, хронический гайморит.
По современным представленииям нейтрофильные гранулоциты (НГ) — уникальная мультипотентная популяция клеток иммунной системы, относящаяся к врожденному иммунитету, обладающая при этом другими очень важными функциональными возможностями, позволяющими активировать, регулировать адаптивный иммунитет и способствовать его полноценной реализации [8]. Существует устаревшее широко распространенное, но неправильное мнение о том, что — это короткоживущие конечно дифференцированные клетки с конденсированным ядром и, следовательно, не способные к экспрессии генов в ответ на индукцию. Однако рядом авторов показано, что НГ способны к транскрипционно-зависимому синтезу белка теплового шока [13], к экспрессии РНК-кодированных фагоцитарных рецепторов [16], к
модулированию синтеза РНК в ответ на воздействие глюкокортикоидов или лектина [12]. НГ могут повышать экспрессию генов, вовлекаемых в реализацию фагоцитарной функции, таких как гены, кодирующие gp91phox и р22phox — компоненты фагоцитарногоцитохрома В [21]. НГ не только могут отвечать на воздействие провоспалительных цитокинов (TNFa, G-CSF, IFNy) дифференцировкой — экспрессией рецепторов, присущих АПК, например, CD83 (17], но и могут становиться участниками формирования «цитокиновой сети» посредством секреции провоспалительных (IL-1a, IL-1ß, G-CSF, IFNy, TNFa и т. д.) и противовоспалительных (IL4, IL-10, IL-1Ra и т.д.) цитокинов, регулируя при этом экспрессию генов [20,21]. Стимуляция НГ бактериальным ЛПС индуцирует в НГ синтез как про-, так и противовоспалительных цитокинов [20].
В то же время показана взаимосвязь между изменением структуры хроматина и генной регуляцией в иммунной системе [22]. Показано, что изменения структуры хроматина являются регуляторным механизмом, управляющим транскрипцией генов цитокинов [19]. Существуют доказательства в модификации гистонов и ремоделирования хроматина при бактериальной инфекции [15]. Вместе с тем, Zhang X. еt а1. [23] изучили изменения генной экспрессии и структуры хроматина в активированных НГ. НГ стимулировали опсонизированной Е. coli и хемоаттрактантом—пептидом формилметлейфен. Результаты показали изменения уровня транскриптов 148 транскрипционных факторов и хроматин-ремодулирующих генов и 95 регуляторов белкового синтеза. Было показано также, что сочетанная транскрипционная регуляция, включающая изменения структуры хроматина, может играть определенную роль в быстрых изменениях генной экспрессии, которые возникают в НГ [23]. В то же время глобальные изменения в генной экспрессии НГ, возникающие во время рецептор-медиированного фагоцитоза, могут влиять на судьбу клеток, позитивно или негативно регулируя процессы апоптоза, а, следовательно, влиять на интенсивность и исход бактериального воспаления [18]. Показано, что основную роль в изменении топологического состояния ДНК играют ферменты-топоизомеразы. Исследования топоизомераз выявили большое разнообразие этих ферментов в про- и эукариотических клетках. Была установлена биологическая функция ферментов разных типов, а также аналогии и различии в их структурах и механизмах действия. Анализ топоизомераз с помощью различных методов (включая стационарную и быструю кинетику, сайт-направленный мутагенез и т.д.) позволил установить роль отдельных аминокислот как непосредственно в катализе реакций, так и в кооперативных взаимодействиях между различными доменами [25].
Существующие в настоящее время современные методы исследования экспрессии генов и изменений структурной упорядоченности хроматина являются достаточно сложными, требуют дорогостоящего оборудования и, к сожалению, малодоступны для применения в клинике. В то же время существует метод поляризационной микроскопии, использующий оптический анизотропный эффект для изучения топологических свойств
ядерного хроматина. Он позволяет эффективно выявлять структурные характеристики ядерного материала на разных этапах функционирования клетки [3,5,8]. Величина выявляемой анизотропии ядра отражает структурно-молекулярную упорядоченность хроматина, основного носителя генетической информации в клетке. Снижение уровня анизотропии может интерпретироваться как показатель деспирализации хроматина, сопровождающейся ослаблением химических связей комплекса ДНК-гистон в ядрах клеток. Подобные явления указывают на биологическую активацию хроматина что является предпосылкой для появления матричной активности ДНК с последующей экспрессией нескольких сотен генов и дальнейшим белковым синтезом.
Мы полагаем, что выяснение связи между структурой и функцией хроматина НГ, его способностью к реструктуризации при иммуно-инфекционных заболеваниях, при которых пациенты страдают иммунодефицитом с инфекционным синдромом, таким как хронический гайморит, с упорно рецидивирующим течением и частотой рецидивов 4-6 раза в год, нуждающихся в антибактериальной терапии, является весьма актуальной задачей [1].
При этом следует подчеркнуть, что уточнение изменений активности хроматина нейтрофильных гранулоцитов в сопоставлении с уровнем экспрессии генов цитокинов при хроническом гайморите ранее не проводилось.
Цель исследования: уточнение связи между способностью хроматина НГ к ремоделированию ассоциированному с уровнем экспрессии генов IL8, IL1b и TNF под влиянием глюкозаминилмурамилдипептид (ГМДП) и ИФНу у здоровых лиц и больных хроническим гайморитом в системе in vitro и создание универсального интегрального теста, позволяющего косвенно оценить уровень экспрессии генов провоспалительных цитокинов по уровню реструктуризации хроматина НГ в системе in vitro в условиях использования различных индукторов реструктуризации.
Материалы и методы
В группу исследования вошли 10 пациентов обоего пола в возрасте от 38 до 60 лет с хроническим гайморитом в фазе обострения воспалительного процесса, находящихся на лечении в Краснодарском краевом центре оториноларингологии до начала стационарного лечения. Контрольную группу, сопоставимую по полу и возрасту, составили 7 условно здоровых добровольцев. Кровь в объеме 4-5 мл забирали путем пункции локтевой вены утром, натощак, в вакуэты с ЭДТА (концентрация 2,7%), затем наслаивали ее на фиколл-верографиновый градиент плотности (1,077) и выдерживали 40 минут в холодильнике (40С). Снимали плазму со взвешенными лейкоцитами и наслаивали на градиент двойной плотности (1,093:1,077) в соотношении 1: 1. Центрифугировали 15-20 минут при 1500 об/мин. На границе между двумя градиентами пастеровской пипеткой отбирали кольцо НГ. Клетки отмывали средой 199 дважды с последующим центрифугированием по 5 минут при 1500 об/мин для удаления надосадочной жидкости. Полученные клетки
ресуспендировали и подсчитывали в камере Горяева доводя суспензию до 1 млн НГ/мл. Часть полученной суспензии подвергали преинкубации с ГМДП и ИФНу. При этом исследовался уровень экспрессии генов IL8,IL-1ß и TNF, а также особенности реструктуризации хроматина ядер НГ. Для преинкубации в системе in vitro был использован ИФНу (ООО Иммунофарм, Россия), в конечной концентрации 1 мкг/мл. (Время преинкубации составило 1 час при Т-37,оС.) а также ГМДП (чистый продукт ГМДП синтезирован в ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова и представлен ЗАО «Пептек» (г.Москва)) в конечной концентрации 1 мкг/мл (Время преинкубации составило 1 час при Т-37,оС). Дополнительным контролем служили НГ выделенной взвеси (как больных хроническим гайморитом, так и здоровых лиц) не подвергавшиеся индукции в системе in vitro. Экспрессию генов IL8 и IL-1ß НГ относительно неиндуцированного контроля определяли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени. Выделение РНК из НГ осуществляли стандартным методом с использованием коммерческого набора TRI REAGENTTM(Sigma) для выделения РНК в соответствии с прилагаемой инструкцией. Для получения кДНК в качестве матрицы применяли образцы полученной РНК с проведением реакции обратной транскрипции, используя коммерческий набор RevertAid™ по инструкции производителя. ПЦР в режиме реального времени осуществляли с использованием комерческого набора AmpliTag Gold 360 Master Mix для проведения ПЦР согласно инструкции производителя. При этом использовали коммерческие зонды для исследования экспрессии генов цитокинов IL8, IL1B, TNF и ACTB (ß-акти - референтный ген) (TagMan Gene Expression Assay, s00174103_m1; TagMan Gene Expression Assay, Hs01555410_m1; TaqMan® Gene Expression Assay, Hs01113624_g1;TagMan Gene Expression Assay, Hs01060665_g1). Общий объем амплификационной смеси составлял 20 мкл. Все реактивы фирмы Applied Biosystems (USA). Последовательность праймеров для определения экспрессии генов цитокинов представлена в таблице 1.
Таблица 1
Последовательность праймеров генов цитокинов IL8, IL1B,
ACTB (ß-актин)
Ген Последовательность праймера
IL8 GTGTGAAGGTGCAGTTTTGCCAAGG
IL-1ß CAGATGAAGTGCTCCTTCCAGGACC
TNF TTCCTGCATCCTGTCTGGAA
ACTB (ß-актин) CGACAGGATGCATGCAGAAGGAGA
Подготовленный материал переносили в прибор для проведения ПЦР в режиме реального времени (Rotor-Gene 6000 series) где проводилась амплификация в автоматическом режиме по заданной программе. Расчет относительной экспрессии генов IL8, IL-ip. осуществляли по общепринятой методике [20].
Оценка реструктуризации хроматина ядер НГ по уровню оптической анизотропии (ОА) хроматина ядер НГ проводилась с использованием модифицированного метода Нестеровой и соавт. [3]. При этом учитывали, что при окраске ядер клеток толуидиновым синим при рН-5.0, обработанных после солянокислого гидролиза солянокислым гидроксиламином, возникает эффект двулучепреломления тем более сильный, чем более упорядоченной является структура ДНК в изучаемых ядрах. Механизм реакции состоит в том, что толуидиновый синий взаимодействует как с фосфатными группами ДНК, так и с открывшимися после гидролиза альдегидными группами, пространственная ориентация которых различна и меняется в процессе функционирования хроматина. Как правило, чем более упорядоченной по своей структуре является ДНК, тем более конденсированным является соответствующий ей хроматин и тем менее он активен в процессах экспрессии генов и тем выше уровень возникающий при окраске толуидиновым синим оптической анизотропии. Таким образом, количественный учет степени оптической анизотропии ядер позволяет судить об уровне реструктуризации хроматина и, следовательно, о его активности. Мазки клеток крови, подсушивали на воздухе, фиксировали смесью этанол/ацетон в соотношении 1:1, подвергали гидролизу в 5 N HCl при 200 С и обработке солянокислым гидроксиламином, при температуре 370С в течение 3 часов. Обработанные таким образом мазки, окрашивали 0,05% раствором толуидинового синего при рН-5.0, приготовленного на 0,001 М цитратном буфере. Время окраски составляло 20 минут. Окрашенные препараты быстро отмывали цитратным буфером, высушивали на воздухе и исследовали под поляризационным микроскопом "МП-8" при скрещенном анализаторе и поляризаторе. Для учета интенсивности анизотропного эффекта в ядрах НГ использовали модификацию полуколичественного метода Астальди и Верга, адаптированного для изучения ядер. Все ядра были разделены по уровню оптической анизотропии на 5 групп, каждой из которых была присвоена определенная величина (степень «0» означала полное отсутствие анизотропии, что соответствовало наибольшей степени активации хроматина ядра; степень «4» означала, что анизотропно все ядро, что соответствовало отсутствию активности хроматина; степени анизотропии от «1» до «3» соответствовали промежуточным значениям анизотропии ядра) [2, 3]. Таким образом уровень ОА является величиной обратной по отношению к реструктуризации (Р) хроматина (Р= 1/ОА). Одновременно рассчитывался индекс реструктуризации хроматина (ИРХ) равный отношению уровня реструктуризации после индукции (и) к его спонтанному значению (сп) значению (ИРХ= Ри/Рсп), который позволяет оценить дополнительный уровень реструктуризации хроматина НГ, возникший в результате индукции. Результаты исследования были подвергнуты статистической обработке с использованием методов вариационной статистики. Методом корреляционного анализа с использованием компьютерной программы Biostat 4.0. проанализирована корреляционная связь (КС) уровня Р и уровня
относительной экспрессии генов IL8, IL-1ß и TNF. Результаты исследования представлены на рисунках 1, 2 и 3.
Обсуждение полученных результатов
У клинически здоровых лиц контрольной группы морфологически зрелые НГ периферической крови не подвергавшиеся индуцирующему влиянию обнаруживают уровень реструктуризации хроматина в 0,43+0,02 усл.ед. при коэффициенте вариации (CV) равном 12,7%, аналогичный показатель для выделенной взвеси НГ был на 16% выше и составил 0,50+0,03 при CV=12%, однако это различие не было статистически значимо (P>0,05). Использование в качестве индуктора ГМДП привело к увеличению уровня реструктуризации хроматина НГ взвеси на 14% и составило в среднем 0,57+0,02 при CV=9% (P<0,01), а ИРХ был равен 1,14. При этом экспрессия гена IL8 относительно неиндуцированного контроля составила 1,16+0,03 (рис. 1, 2, 3). Уровень корреляционной связи (КС) между уровнем экспрессии гена IL8 и уровнем реструктуризации хроматина НГ был умеренно прямым (R=+0,54). Экспрессия гена IL-1ß относительно не индуцированного контроля равнялась 3,24+0,5, при этом также наблюдалась умеренная прямая корреляционная связь с уровнем реструктуризации хроматина НГ (R=+0,38). Экспрессия гена TNF относительно неиндуцированного контроля составила 1,44+0,09 (рис. 1, 2, 3). Также была обнаружена сильная прямая корреляционная связь (КС) между уровнем экспрессии гена TNF и уровнем реструктуризации хроматина НГ (R=+0,76). Полученные данные свидетельствуют, что у клинически здоровых лиц при индукции НГ с помощью ГМДП происходит достоверное увеличение реструктуризации хроматина НГ, которое сопровождается повышением экспрессии генов IL8, IL-1ß и TNF относительно неиндуцированного контроля. При использовании в качестве индуктора ИФНу уровень реструктуризации хроматина НГ взвеси составило в среднем 0,77+0,05 усл. ед. при CV=13% (P<0,001), а ИРХ был равен 1,54. При этом экспрессия гена IL8 относительно неиндуцированного контроля составила 1,62+0,43 (рис. 1, 2, 3). Корреляционная связь (КС) между уровнем экспрессии гена IL8 и уровнем реструктуризации хроматина НГ была сильной прямой (R=+0,89). Экспрессия гена IL-1ß относительно не индуцированного контроля равнялась 3,8 +1,01, при этом также наблюдалась сильная прямая корреляционная связь с уровнем реструктуризации хроматина НГ (R=+0,94).
Экспрессия гена TNF относительно неиндуцированного контроля составила 1,02+0,17 (рис. 1, 2). Корреляционная связь (КС) между уровнем экспрессии гена TNF и уровнем реструктуризации хроматина НГ была сильной прямой (R=+0,94). Полученные данные свидетельствуют о том, что у клинически здоровых лиц при индукции НГ с помощью ИФНу, также, как и при индукции НГ с помощью ГМДП, происходит достоверное увеличение реструктуризации хроматина НГ, которое сопровождается повышением экспрессии генов IL8 ,IL1B и TNF относительно неиндуцированного
контроля, что выражается в сильной прямой корреляционной связи между двумя этими показателями.
У больных хроническим гайморитом морфологически зрелые НГ периферической крови не подвергавшиеся индуцирующему влиянию обнаруживают уровень реструктуризации хроматина в 0,53+0,01 усл. ед. при коэффициенте вариации (СУ) равном 5%, аналогичный показатель для выделенной взвеси НГ был на 9% выше и составил 0,58+0,02 при СУ=6%, и это различие было статистически значимо (Р<0,05). Использование в качестве индуктора ГМДП привело к увеличению уровня реструктуризации хроматина НГ взвеси на 12% и составило в среднем 0,65+0,03 при СУ=10% (Р<0,01), а ИРХ был равен 1,12. При этом экспрессия гена ГЬ8 относительно неиндуцированного контроля составила 0,25+0,05 (рис. 1, 2, 3). Уровень корреляционной связи (КС) между уровнем экспрессии гена ГЬ8 и уровнем реструктуризации хроматина НГ был умеренно прямым ^=+0,53). Экспрессия гена ГЬ-1р относительно не индуцированного контроля равнялась 0,84+0,19, при этом наблюдалось практически полное отсутствие корреляционной связи с уровнем реструктуризации хроматина НГ.
Экспрессия гена TNF относительно неиндуцированного контроля составила всего 0,03+0,005 (рис. 1, 2, 3). Уровень корреляционной связи (КС) между уровнем экспрессии гена Т№ и уровнем реструктуризации хроматина НГ был слабым прямым ^=+0,17). Полученные данные свидетельствуют о том, что у больных хроническим гайморитом при индукции НГ с помощью ГМДП происходит достоверное увеличение реструктуризации хроматина НГ, которое сопровождается повышением экспрессии гена ГЬ8 относительно неиндуцированного контроля. Экспрессия гена ГЬ-1р также незначительно увеличивается. Относительная экспрессия гена Т№ весьма незначительна и носит "следовой" характер при наличии слабой положительной КС. Следует отметить, что у больных хроническим гайморитом, увеличение уровня экспрессии генов ГЬ8, ГЬ-1р и Т№ относительно неиндуцированного контроля существенно ниже, чем у здоровых лиц (на 78,4%, 74% и 98% соответственно).
о,«
О, 7 О, 6 О. 5 0,-4 0,3 О, 2 0,1
г!.|П
□ Реструктуризация хроматина
■ Реструктуризации
грузке 11*1» Ну
Больные
А Б
Рисунок 1. Абсолютный уровень реструктуризации хроматина (Р) НГ лиц контрольной группы и больных хроническим гайморитом в условиях индукции (Индукторы - А-ГМДП; Б-ИФНу).
А Б
Рисунок 2. Индекс реструктуризации хроматина (ИРХ= Ри(рестрктуризаци после
индукции/Рсп (реструктуризация спонтанная)) НГ Лиц КОНтрОЛЬНОй ГруППЫ и бОЛЬНЫХ
хроническим гайморитом в условиях индукции. (Индукторы - А-ГМДП; Б-ИФНу; З- здоровые; Б-больные: - различие достоверно)
При использовании в качестве индуктора ИФНу уровень реструктуризации хроматина НГ взвеси увеличился на 32,8% и составил в среднем 0,77+0,05 при СУ=13% (Р<0,001), а ИРХ был равен 1,33. При этом экспрессия гена ГЬ8 относительно неиндуцированного контроля составила 0,22+0,07 (Рис.1,2,3), при полном отсутствии КС с уровнем реструктуризации хромата НГ. Экспрессия гена ГИр относительно не индуцированного контроля равнялась 1,1 +0,41. КС с уровнем реструктуризации хроматина также практически отсутствовала ^=+0,03). Экспрессия гена Т№ относительно неиндуцированного контроля составила 0,04+0,01 (Рис.1,2,3) при сильной прямой КС с уровнем реструктуризации хроматина НГ ^=+0,85).
т-0-
!ИЬ ТЫР
□Здоровые ИБольные I
осительная экспрессия генов НННЬ
—
■
е И8 И1Ь ТОР | ПЗдоровые ИБольные |
А Б
Рисунок 3. Индукция экспрессии генов цитокинов относительно неиндуцированного контроля. (А - в качестве индуктора использовался ГМДП; Б- в качестве индуктора использовался ИФНу; - различие достоверно)
Полученные данные свидетельствуют, что у больных хроническим гайморитом при индукции НГ с помощью ИФу происходит достоверное увеличение реструктуризации хроматина НГ, которое сопровождается повышением экспрессии гена ГЬ8 относительно неиндуцированного
контроля. Экспрессия гена IL-1P также незначительно увеличивается, а для гена TNF имеет "следовой" характер. Следует отметить что у больных хроническим гайморитом, увеличение уровня экспрессии генов IL8 , IL-ip и TNF относительно неиндуцированного контроля существенно ниже, чем у здоровых лиц (на 86,4%, 71,1% и 96,1% соответственно). При этом корреляционная связь (КС) между уровнем экспрессии генов IL8, IL-ip и уровнем реструктуризации хроматина НГ в обоих случаях практически отсутствует.
Таким образом, у здоровых людей и больных хроническим гайморитом при индукции НГ в системе in vitro, с помощью ГМДП и ИФНу происходит достоверное увеличение реструктуризации хроматина НГ, сопровождающееся увеличением экспрессии генов IL8 , IL-ip и TNF относительно неиндуцированного контроля. Корреляционная связь (КС) между уровнем экспрессии генов изученных цитокинов с уровнем реструктуризации хроматина НГ у здоровых людей всегда носит прямой характер, а ее уровень колеблется от умеренно до сильного. У больных хроническим гайморитом данный показатель отличается существенной вариабильностью, что связано с индивидуальными особенностями течения патологического процесса у обследованных пациентов. При этом у здоровых людей уровень относительной экспрессии генов изученных цитокинов существенно выше, чем у больных гайморитом. Этот феномен, по-видимому, связан с тем, что индукция экспрессии этих генов НГ в системе in vitro происходила на фоне уже ранее существующей их индукции in vivo на фоне имеющегося патологического инфекционно воспалительного процесса. Возможно, что нарушение экспрессии генов некоторых провоспалительных цитокинов у больных хроническим гайморитом в период обострения, которая должна быть гораздо выше (адекватный ответ) в остром периоде бактериальной инфекции, обуславливает хронизацию воспалительного бактериального процесса.
В целом, проведенное исследование свидетельствует, что уровень реструктуризации хроматина НГ в сочетании с ИРХ тесно ассоциирован с относительной экспрессией изученных провоспалительных цитокинов и может являться косвенным показателем уровня этой экспрессии.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Гофман В.Р. Состояние иммунной системы при острых и хронических заболеваниях ЛОР-органов /В.Р. Гофман, В.С. Смирнов / В кн.: Иммуно-дефицитные состояния; под ред. В.С. Смирнова, И.С. Фрейдлин. -СПб.: Фолиант, 2000. - С. 163 - 187.
2. Нестерова И.В. Комплексное трехуровневое исследование системы нейтрофильных гранулоцитов с возможной диагностикой ИДС при различной патологии/ Колесникова Н. В.Чудилова Г.А // Метод. рекомендации. — Краснодар, 1996.
3. Нестерова И.В., Особенности активационного потенциала ядер нейтрофильных гранулоцитов в норме и патологии./ Евглевский А.А., Фомичева Е.В. // Цитокины и воспаление - 2004. - 3(2) -С. 52-55.
4. Нестерова И.В.. Фенотипические и функциональные характеристики нейтрофильных гранулоцитов при осложненном остром деструктивном панкреатите. / Швыдченко И.Н., Роменская В.А. // Рос. Аллергол. журн. — 2008. — № 1, прил. 1. — С. 203— 204.
5. Нестерова И.В. Особенности спонтанной и индуцированной реструктуризации хроматина и функционирования кислородзависимых цитотоксических механизмов нейтрофильных гранулоцитов при колоректальном раке /Евглевский А. А.; Фомичева Е.В.; Колесникова Н.В.; Ковалева С.В.; Чудилова Г.А.; Ломтатидзе Л.В.; Коков Е.А.; Кокова Л.Н. // Российский иммунологический журнал. - 2011. - Т. 5, № 3/4. - С. 254-261. - С. 260-261.
6. Нестерова И.В. Особенности ремоделирования фенотипа и функциональных возможностей нейтрофильных гранулоцитов пациентов с колоректальным раком под влиянием G-CSF в системе in vitro /Ковалева С.В.; Чудилова Г.А.; Ломтатидзе Л.В.; Евглевский А.А.; Колесникова Н.В.; Фомичева Е.В.; Коков Е.А. // Иммунология. - 2012. - Т. 33, № 6. - С. 306-311. -C. 310-311.
7. Нестерова И.В. Двойственная роль нейтрофильных гранулоцитов в реализации противоопухолевой защиты. / Нестерова И.В., Ковалева С.В., Чудилова Г.А., Ломтатидзе Л.В., Евглевский А.А.// Иммунология.-2012.- №5.-С.281-287.
8. Нестерова И. В. Нейтрофильные гранулоциты — ключевые клетки иммунной системы. /И.В Нестерова., И.Н. Швыдченко, В.А., Роменская, и др. // Аллергология и иммунология. — 2008. — Т. 9, № 4. — С. 432-435.
9. Ashby J Chromatin remodelling beyond transcription: the IN080 and SWR1 complexes/ Ashby J Morrison & Xuetong Shen // Nature Reviews Molecular Cell Biology 10, 373-384 (June 2009)
10. Brinkmann V. Neutrophil extracellular traps: Is immunity the second function of chromatin/ Brinkmann V., Zychlinsky A. // JCB 2012, vol. 198, no. 5, p773-78).
11. Bird L. Tumor immunology: Neutrophil plasticity / Bird L. // Nature Reviews Immunology. - 2009.- N 9. - Р. 672-673.
12. Granelli-Pfporno A. RNA and protein synthesis in human peripheral bipod polymorphonuclear leukocytes./ A . Granelli-Pfporno, 3.D., E. Vassalli Reich // J. Exp. Med. — 1979. —Vol. 149,1*1.- P. 284-289.
13. Eid N.S. Heat-shock protein synthesis by humаm polymorphonuclear cells./ Kravrilli K.E., Lanks K.W.// J.Exp.Med. -1987, -165(5) - P. 1448-1452.
14. Fridlender Z. G. Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-b: ''N1'' versus ''N2'' TAN / Fridlender Z. G., Jing S., Samuel K. et al // Cancer Cell. - 2009.- V. 16. - P. 183-194.
15. Hamon V.F. Histone modifications and chromatin remodeling during bacterial infections./ V.F. Hamon, P. Cossart //Cell Host Microbe 2008, 4(2), 100109.
16. Jack R.M. Selective synthesis of m RNA and proteins by human peripheral blood neutrophils./ R.M. Jack, D.T. Fearon // J.Immunol.- 1988, -140(12), P.4286-4293.
17. Iking-Konert C., Dp-regulation of the dendritic cell marker CD83 on polymorphonuclear neutrophils (PMN): divergent expression in acute bacterial infections and chronic inflammatory disease/ C. Iking-Konert, C.Wagner, B.Denefleh // Ctin. Exp. Immunol. — 2002. — V6L 130, H! 3. — P. 501-508.
18. Kobayashi S.D. Global changes in gene expression by human polymorphonuclear leukocytes, during receptor-mediated phagocytosis: cell fate is regulated at the level of gene expression. / S.D. Kobayashi, Voyich J.M., C.L Buhl //Proc.Natl.Acad.Sci, USA- 2002, 99(10), P. 6901-6906.
19. Li B., The role of chromatin during transcription./ B. Li, M. Carey, O.L. Workman // Cell 2007,-128(4), P.707-719.
20. Melani C. Interleukin-6 expression in human neutrophil and eosinophil peripheral blood granulocytes/ C. Melani, G.F. Hattfa, A.Silvani // Btood. —1993. —Vol. 81, — P. 2744-2749.
21. Newburger P.E. In vitro regulation of human phagocyte cytocnrome b heavy and light chain gene expression by bacterial lipopotysaccharide and recombinant human cytokines/ P.E Newburger, Q. Dai, C.Whitney //3. Biol. Chem. -1991, -Vol. 266, 24. —P. 16171-16177.
22. Smale S.T.Chromatin structure and gene regulation in the immune system. / S.T. Smale, A.G. Fisher //Annu.Rev.Immunol. - 2002, 20, - C/427-462.
23. Zhang X. Gene expession in mature neutrophils: early responses to inflammatory stimuli./ X.Zhang, Y. Kluger, Y Nakayama et. al / J.Leukoc.Biol 2004, 75(2), 358
24. Livak K.J. Analysis jf relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta DeltaC(T))Method/Livak K.J.,Schmittgen T.D./ Livak K.J. , Schmittgen T.D. //Methods 2001 Dec; 25(4): - P.402-408.
25. Wang J.C. Cellular roles of ONA topoisomereases: a molecular perspective // Nat.Rev. Mot Cell Biol. — 2002. — Vol. 3, Nz 6. — P. 430-440.
