CC BY
68
УДК 612.28
РЕСПИРАТОРНЫЕ ЭФФЕКТЫ ПРИ МИКРОИНЪЕКЦИЯХ ГАММА-АМИНОМАСЛЯНОЙ КИСЛОТЫ И БИ-КУКУЛЛИНА В ОБЛАСТЬ ВЕНТРАЛЬНОЙ РЕСПИРАТОРНОЙ ГРУППЫ У КРЫС
© 2007 О.А. Ведясова, А.М. Ковалев1
В острых опытах на крысах, наркотизированных уретаном, изучены изменения паттерна дыхания при микроинъекциях 10-3 М растворов ГАМК и бикукуллина в ростральный отдел вентральной респираторной группы (rVRG). Показано, что респираторные эффекты воздействия ГАМК и бикукуллина на продолжительность вдоха, выдоха и величину легочной вентиляции имеют противополжный характер. Обсуждается вопрос об участии ГАМКа-рецепторов области rVRG в опосредовании тормозного действия ГАМК на бульбарные механизмы, определяющие длительность фаз дыхательного цикла.
Введение
Интегративная деятельность дыхательного центра (ДЦ) опосредуется многочисленными нейроактивными веществами - регуляторами и модуляторами эндогенной природы, среди которых важная роль принадлежит нейротрансмиттерам. Согласно литературным данным, в генерации и регуляции дыхательного ритма участвуют более 13 нейротрансмиттеров [12, 13] среди которых особое значение имеют медиаторы тормозной природы, и в частности, гамма-аминомасляная кислота (ГАМК). Эффекты действия ГАМК и ее производных на функцию дыхания, исследованы достаточно подробно [1, 5, 6, 7, 21]. В частности, среди фактов, отражающих участие ГАМК в работе ДЦ, следует отметить уменьшение респираторной активности при микроподведении растворов данного медиатора к отдельным дыхательным нейронам, относящимся к категориям как ритмогенерирующих, так и паттернформирующих клеток ДЦ [5, 8]. Из ряда работ следует, что с участием ГАМК в клеточных ансамблях респираторной нейронной сети формируется возвратно-тормозной драйв [5, 20, 21]. Показано, что ГАМКергиче-ская модуляция нейрональной активности имеет место в тех респираторных нейросетях, которые отвечают за генерацию таких паттернов дыхания как эйпноэ,
1 Ведясова Ольга Александровна ([email protected]), Ковалев Александр Михай-ловаич, кафедра физиологии человека и животных Самарского государственного университета, 443011, Россия, г. Самара, ул. Акад. Павлова, 1.
кашель и чихание. Участие ГАМК в респираторном ритмогенезе подтверждается тем, что ее микроинъекция в комплекс пре-Бетцингера подавляет респираторный ритм, а введение блокаторов ГАМК-рецепторов, наоборот, вызывает увеличение частоты дыхания в сочетании с синхронным ослаблением моторного выхода из ДЦ [16, 20]. Следует также отметить, что сравнительный анализ результатов исследований на взрослых и новорожденных животных позволяет считать, что механизмы синхронизации респираторной активности на всех стадиях онтогенеза млекопитающих имеют общий ГАМКергический компонент [17].
Вместе с тем, нельзя не указать, что рецепторные механизмы реализации эффектов ГАМК на активность ДЦ, в том числе на деятельность его функционально различных нейронных скоплений, являются малоизученными и составляют одну из актуальных проблем нейрофизиологии дыхания. В частности, открытым остается вопрос о роли ГАМКергической системы в регуляции дыхания на уровне вентральной респираторной группы (VRG), которая привлекает к себе внимание в связи с наличием в ее пределах клеточных популяций, отвечающих за формирование ритма и паттерна дыхания. Эти процессы обеспечивают выявленные в составе VRG четыре класса респираторных нейронов, в том числе преинспира-торные, постинспираторные, а также инспираторные и экспираторные клетки с возрастающим паттерном активности [18, 19]. VRG, как наиболее крупный кластер центрального механизма регуляции дыхания, принято делить на две части -ростральную (rVRG) и каудальную (иногда выделяют третью - промежуточную область), которые различаются по анатомическим и функциональным признакам [2, 8, 11].
Целью нашей работы было изучение особенностей и механизмов включения ГАМКергической медиации у крыс в управление паттерном дыхания на уровне rVRG путем анализа респираторных эффектов при микроинъекциях в указанную область ДЦ растворов ГАМК и специфического антагониста ГАМКА-рецепторов бикукуллина.
Методика исследований
Были поставлены острые эксперименты на 14 беспородных крысах, массой 200 - 250 г, наркотизированных уретаном (1,5 мг/кг массы, внутрибрюшинно). После наркотизации крысам делалась операция трахеотомии, после чего их переворачивали спиной кверху, фиксировали голову в стереотаксическом приборе СЭЖ-3 в положении вентрального сгибания и проводили трепанацию затылочной кости с целью осуществления доступа к дорсальной поверхности продолговатого мозга.
Растворы ГАМК (y-aminobutyric acid, ICN Pharmaceuticals, Inc.) и бикукуллина (bicuculline, ICN Pharmaceuticals, Inc.) для микроинъекций готовились ex tempore в концентрации 10-3 М. Концентрация веществ достигалась методом разведения 1 мг ГАМК или 3 мг бикукуллина в 10 мл искусственной спинномозговой жидкости.
Инъекции растворов в rVRG проводились в объеме 0,2 мкл через стеклянную микропипетку, укрепленную на игле микрошприца, по координатам стереотак-сического атласа [15]: 1,0 мм ростральнее obex; 2,0 мм латеральнее срединного шва; 2,5 мм вглубь от поверхности продолговатого мозга.
Респираторные эффекты, вызываемые введением ГАМК и бикукуллина, оценивали по изменениям паттерна внешнего дыхания, который регистрировали методом спирографии. Для этого в трахею животного вводили канюлю и соединяли ее с миниатюрным спирографом, сигналы от которого через специальные преобразующие устройство поступали для регистрации на компьютер. Спирограммы записывались в специальной программе «Rats» в определенной последовательности: в исходном состоянии (до микроинъекции) и через 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30 минут после микроинъекции растворов ГАМК и бикукуллина в rVRG.
На спирограммах измеряли основные временные и амплитудные параметры паттерна дыхания: длительность инспирации и экспирации (с), общую продолжительность дыхательного цикла (с) и дыхательный объем (мл). На основе этих показателей рассчитывали частоту дыхания (мин-1) и легочную вентиляцию (минутный объем дыхания, мл/мин).
Статистическую обработку результатов исследования проводили методом прямых разностей с использованием парного t-теста в программах Ехсеї 7.0 и SigmaStat.
Результаты исследований
В ходе исследования установлено, что локальные инъекции ГАМК и бикукул-лина в концентрации 10-3 М в rVRG крыс вызвали у животных респираторные эффекты, которые выражались изменением всех анализируемых параметров спирограммы, что свидетельствует об участии ГАМКергической системы в центральных механизмах регуляции дыхания на уровне изучаемой области ДЦ. Оценивая наблюдаемые реакции, прежде всего следует отметить, что активация ГАМК-рецепторов в области rVRG экзогенным медиатором проявлялась различной выраженностью и направленностью изменений временных и амплитудных параметров паттерна внешнего дыхания. В частности, продолжительность фаз дыхательного цикла в указанных экспериментальных условиях имела тенденцию к незначительному уменьшению.
Как видно из рис. 1, микроинъекции ГАМК вызывали укорочение фазы вдоха с максимальным проявлением эффекта на 5-й минуте экспозиции. Данная реакция сочеталась с постепенным уменьшением во времени длительности выдоха, которая достигала наименьших значений на 30-й минуте после введения вещества в ДЦ. Интегральным результатом укорочения фаз дыхания явилась динамика частоты дыхания, которая после микроинъекции ГАМК в rVRG отличалась тенденцией к возрастанию значений параметра с первой минуты экспозиции.
Длительность вдоха
Длительность выдоха
1 5 10 15 20 25 30
%
мин
% Частота дыхания
15 т т т
10 л. * Ї і і
5 Iі! п мин
-5
-10
-15 1 5 10 15 20 25 30
Минутный объем дыхания
20
15
10
5
0
-5 -10 15
р п
%
5
10
15
20
25
30
Рис. 1. Изменения (в процентах от исходного уровня) частотно-временных параметров паттерна внешнего дыхания в разные сроки после микроинъекции 10-3 М раствора ГАМК в гУЯв крыс. * - р<0,05
В интервале с 15-й по 30-ю минуты воздействия нейроактивного агента изменения частоты дыхания приобретали достоверный характер и на момент максимальных отклонений от исходного уровня достигали 9,8 % (р<0,05).
Перестройки частотно-временных параметров паттерна дыхания, отмеченные в условиях активации ГАМК-рецепторов на уровне гУЯО, сопровождались опре-
деленными изменениями объемных характеристик регистрируемых спирограмм (рис. 1). Анализ полученных записей позволяет констатировать, что микроинъекция ГАМК в гУЯО, в целом, приводила к увеличению значений дыхательного объема у животных, однако, данная реакция развивалась постепенно и могла иметь во времени двухфазную динамику.
Как правило, на 1-й минуте экспозиции отмечалось небольшое уменьшение глубины вдоха, которое, начиная с 5-й минуты наблюдений, сменялось ее постепенным нарастанием. Максимальное отклонение анализируемого параметра от исходной величины составляло 8,9 % и было приурочено к окончанию экспозиции. По срокам это совпадало с наибольшей степенью изменений временных параметров спирограмм. Поскольку увеличение объема дыхания происходило на фоне снижения длительности вдоха, то данный эффект можно рассматривать как изовентиляторную перестройку паттерна дыхания компенсаторноприспособительного характера.
Рост частоты и объема дыхания в ответ на активацию ГАМК-рецепторов гУЯО обусловил достаточно выраженное увеличение такого интегрального показателя спирограммы как легочная вентиляция, о чем можно судить по значениям минутного объема дыхания. Характерно, что в динамике изменений этого параметра прослеживались те же закономерности, что и в изменениях дыхательного объема (рис. 1). Вместе с тем, следует отметить, что увеличение минутного объема дыхания на всех сроках экспозиции имело заметно большую степень выраженности и достоверности (15-20 %; р<0,05), чем увеличение глубины вдоха.
Для выявления мембранных механизмов реализации респираторных эффектов ГАМК на дыхание была поставлена серия экспериментов с локальной блокадой ГАМКа-рецепторов области вентральной респираторной группы антагонистом ГАМК бикукуллином. Эксперименты показали, что применяемый специфический блокатор ГАМКа-рецепторов вызывал выраженные респираторные реакции, которые имели направленность, противоположную эффектам самого медиатора. Так, в отличие от ГАМК бикукуллин приводил к увеличению продолжительности инспирации и экспирации (рис. 2).
При этом удлинение инспираторной фазы достоверно проявлялось только в течение первых десяти минут экспозиции (максимум отклонений совпадал с 10-й минутой и составлял 27,6 %; р<0,05), а в последующие сроки имело статистически несущественный характер. Длительность экспираторной фазы менялась в том же направлении, причем выраженность эффекта в данном случае не превышала 21,4 % (р<0,05).
Дыхательный объем
1 S 10 1S 20 2S 30
0 -S -10 -1S
-20 — -2S -30
-40
%
Минутный объем дыхания
0 -S -10 -1S
-20 -h--2S -30 -3S
10 1S 20 2S 30
-40
%
1S
Частота дыхания
%
Рис. 2. Изменения (в процентах от исходного уровня) частотно-временных и объемных параметров паттерна внешнего дыхания в разные сроки после микроинъекции 10-3 М раствора бикукуллина в rVRG крыс. * - р<0^
Характер изменений фаз внешнего дыхания у крыс после микроинъекции би-кукуллина в ДЦ обусловил соответствующую тенденцию в динамике респираторного ритма. В частности, в первые двадцать минут экспозиции отмечалось урежение частоты дыхания с наибольшей выраженностью на 10-й минуте (17,2 %; p<0,0S), а затем параметр начинал изменяться в противоположную сторону. Весьма показательным результатом действия бикукуллина на дыхание яви-
лось существенное уменьшение объема дыхания, свидетельствующее о снижении глубины вдоха в пределах 18,0 - 28,7 % на протяжении всего периода регистрации (рис. 2).
Соответственно характеру сдвигов частоты и глубины дыхания происходило снижение такого интегрального показателя деятельности ДЦ, как минутный объем дыхания. Наиболее существенные отклонения значений минутной вентиляции легких (на 31,6 %; р<0,05) совпадали с начальными сроками воздействия блока-тора ГАМКа-рецепторов на гУЯО (рис. 2).
Обсуждение результатов
Респираторные реакции, наблюдаемые при микроинъекциях ГАМК и бикукуллина в гУЯО крыс, позволяют говорить о том, что ГАМКергическая система у млекопитающих животных на уровне изучаемого ядра ДЦ вовлечена в механизмы, обеспечивающие контроль за частотно-временными и объемными показателями внешнего дыхания. Характерно, что ГАМК при микроинъекциях в гУЯО вызывала широкий спектр изменений ритмики и глубины дыхания, что возможно обусловлено неоднозначностью ее действия на функционально различные нейроны ДЦ в силу наличия у них разных классов ГАМК-рецепторов. Например, есть основания считать, что данный медиатор через ГАМКА-рецепторы влияет на ранние инспираторные и экспираторные, а через ГАМКВ-рецепторы - на поздние инспираторные и экспираторные нейроны [3].
Типичным эффектом воздействия ГАМК на дыхание в наших экспериментах оказалось уменьшение длительности фаз дыхательного цикла. На наш взгляд, наблюдаемое укорочение вдоха и выдоха является результатом тормозного действия ГАМК на механизмы, регулирующие продолжительность разрядов нейронных элементов, ответственных за временную структуру инспирации и экспирации. Допустимо считать, что наблюдаемые при микроинъекциях ГАМК реакции обусловлены преждевременным прекращением инспирации и экспирации по механизму пресинаптического торможения возбуждающих афферентных входов, поступающих к экспираторным и инспираторным нейронам ростральной части амбигуального ядра и параамбигуальной области, являющихся анатомическими коррелятами гУЯО, от других структур ДЦ.
Следует заметить, что источниками предполагаемых афферентных проекций, причем как возбуждающих, так тормозных, к гУЯО могут быть нейроны ядра со-литарного тракта [14], разные виды инспираторных нейронов комплекса пре-Бетцингера [19], а также поздние экспираторные нейроны с возрастающим типом активности, локализованные в комплексе Бетцингера [9, 10]. При этом нельзя исключать возможности того, что описанные тормозные эффекты опосредуются участием нейроактивных аминокислот-медиаторов, в том числе ГАМК. Возможно, что инъецируемая в ДЦ, экзогенная ГАМК, пройдя через цепь метаболических превращений, включается в работу тормозных синапсов, в результате чего формируется экспериментальная модель преждевременного выключения меха-
низмов, обеспечивающих оптимальную (для наличного функционального состояния организма) продолжительность фаз дыхательного цикла. В результате этих процессов на выходе из респираторной нейронной сети происходит учащение ритмики дыхания.
Из литературы известно, что ГАМК действует на две основные группы молекулярных рецепторов - ионотропные рецепторы типа ГАМКа/ГАМКс и метабо-тропные рецепторы типа ГАМКВ [4]. Поэтому при оценке механизмов, лежащих в основе действия ГАМК на функцию дыхания, представляют интерес изменения его паттерна, вызываемые введением в гУЯД раствора бикукуллина, способного специфически блокировать ГАМКА-сайты на мембранах нервных клеток. Тот факт, что реакции ДЦ на микроинъекции бикукуллина носили характер, прямо противоположный реакциям, вызываемым экзогенной ГАМК, дает основание сделать заключение о том, что влияния эндогенного медиатора на паттерн дыхания реализуются, по крайней мере, частично через ГАМКа-рецепторы области
гуяо.
Заключение
Таким образом, из полученных данных следует, что регуляция дыхания структурами гУЯД осуществляется с участием ГАМКергической медиации, а один из возможных способов реализации влияний ГАМК на дыхание может заключаться в ее тормозном действии через ГАМКа-рецепторы на бульбарные механизмы, определяющие продолжительность фаз дыхательного цикла.
Литература
[1] Ведясова, О.А. Системный компартментно-кластерный анализ механизмов устойчивости дыхательной ритмики млекопитающих / О.А. Ведясова, В.М. Еськов, О.Е. Филатова. - Самара: ООО «Офорт», 2005. - 215 с.
[2] Инюшкин, А.Н. Сравнительная характеристика реакций паттерна дыхания на микроинъекции каиновой кислоты в различные отделы двойного ядра /
A.Н. Инюшкин, Ю.В. Иванова, Е.И. Теньгаев // Росс. физиол. журн. им И.М.Сеченова. - 2002. - Т. 88. - № 7. - С. 914-924.
[3] Сафонов, В. А. Автоматия или ритмообразование в дыхательном центре /
B.А. Сафонов, М.А. Лебедева // Физиология человека. - 2003. - Т. 29. -№ 1. - С. 108-121.
[4] Семьянов, А.В. ГАМКергическое торможение в ЦНС: типы ГАМК-рецепторов и механизмы тонического ГАМК-опосредованного тормозного действия / А.В. Семьянов // Нейрофизиология. - 2002. - Т. 34. - № 1. - С. 82-92.
[5] Тараканов, И.А. Действие ГАМК-положительных веществ на хеморефлек-торную регуляцию дыхания / И. А. Тараканов, В.А. Сафонов, Л.Н. Тихомирова // Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 1999. - Т. 128. - № 9. - С. 274-278.
[6] Федорченко, И.Д. Амигдалофугальная модуляция инспираторно-тормозящего рефлекса Геринга-Брейера / И. Д. Федорченко, Н.А Меркулова., А.Н. Инюшкин // Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 2002. - № 4. - С. 371373.
7] Филатова, О.Е., Еськов В.М. Биофизический мониторинг в исследованиях действия ГАМК и ее производных на нейросетевые системы продолговатого мозга / О.Е. Филатова, В.М. Еськов. - Пущино, 1997. - 151 с.
8] Bianchi, A.L. Central control of breathing in mammals: neuronal circuitry, membrane properties, and neurotransmitters / A.L. Bianchi, M. Denavit-Saubie, J. Champagnat // Physiol Rev. - 1995. - Vol. 75. - No 1. - P. 1-45.
9] Dean, J.B. Cell-cell coupling in CO2/H+-excited neurons in brainstem slices / J.B. Dean, E.A. Kinkade, R.W. Putnam // Respir. Physiol. - 2001. - Vol. 129. -P. 83-100.
10] Ezure, K. Decrementing expiratory neurons of the Botzinger complex. II. Direct inhibitory synaptic linkage with ventral respiratory group neurons / K. Ezure, M. Manabe // Exp. Brain Res. - 1988. - Vol. 72. - P. 159-166.
11] Feldman, J.L. Breathing: rhythmicity, plasticity, chemosensitivity / J.L. Feldman, G.S. Mitchell, E.E. Nattie // Annu. Rev. Neurosci. - 2003. - Vol. 26. -P.239-266.
12] Haxhiu, M.A. Monoaminergic neurons, chemosensation and arousal / M.A. Haxhiu, F. Tolentino-Silva, G. Pete, P. Kc, S.O. Mack // Respir. Physiol. - 2001. - Vol. 129. - P. 191-209.
13] Hilaire, G. Maturation of the mammalian respiratory system / G.Hilaire, B. Duron // Physiol. Rev. - 1999. - Vol. 79. - No 2. - P. 325-360.
14] Johnson, S.M. Electrophysiological properties of neurons within the nucleus am-biguus of adult guinea pigs / M.S. Johnson, P.A. Getting // J. Neurophysiol. -1991. - Vol. 66. - P. 744-761.
15] Paxinos, G. The rat brain in stereotaxic coordinates / G.Paxinos, Watson C. -Ed. 3. - San Diego: Academic, 1998.
16] Respiratory rhythm generation in mammals: synaptic and membrane properties / J.M. Ramirez [et. al.] // Respir. Physiol. - 1997. - Vol. 110. - P. 71-85.
17] Respiratory rhythm generation: converging concept from in vitro and in vivo approaches? / J.-M. Ramirez [et. al.] // Respir. Physiol. & Neurobiol. -2002. -V. 131. - P. 43-56.
18] Rybak, I.A. Modeling neural mechanisms for genesis of respiratory rhythm and pattern. III. Comparison of model perfomances during afferent nerve stimulation / I.A. Rybak, J.F.R. Paton, J.S. Schwaber // J. Neurophysiol. - 1997. -V. 77. - P. 2027-2039.
19] The medullary respiratory network in the rat / S.W. Schwarzacher [et. al.] // J. Physiol. (Lond.) - 1991. - Vol. 435. - P. 631-644.
20] Shao, X.M. Respiratory rhythm generation and synaptic inhibition of expiratory neurons in pre-Botzinger complex: differential roles of glycinergic and GABAergic neural transmission / X.M. Shao, J.L. Feldman // J. Neurophysiol. -1997. - Vol. 77. - P. 1853-1860.
[21] Zuperku, E.J. Gain modulation of respiratory neurons / E.J. Zuperku, D.R. McCrimmon // Respir. Physiol. & Neurobiol. - 2002. - Vol. 131. - P. 121133.
Статья поступила в редакцию 25/IX/2006; в окончательном варианте - 26/XII/2006.
RESPIRATORY EFFECTS CAUSED BY MICROINJECTIONS OF r-AMINOBUTYRIC ACID AND BICUCULLINE INTO VENTRAL RESPIRATORY GROUP REGION IN RATS
2
© 2007 O.A. Vedyasova, A.M. Kovalev
Respiratory pattern alteration caused by GAB A (10-3 М) and bicu-culline (10-3 М) microinjections into rostral region of ventral respiratory group (rVRG) in anesthetized rats has been determinated. GABA and bi-cuculline has opposite influences on inspiratory and expiratory phases duration and lung ventilation value. Participation GABA^receptor of rVRG region in providing with GABA brake action on bulbar mechanisms define duration of respiratory cycle phases is discussed.
Paper received 25/IX/2006. Paper accepted 26/XII/2006.
2
Vedyasova Olga Alexandrovna ([email protected]), Kovalev Alexander Mikhaylovich, Dept. of Human and Animals Physiology, Samara State University, Samara, 443011, Russia.
