CC BY
31
Вісник Дніпропетровського університету. Біологія. Екологія. - 2009. - Вип. 17, т. 1. - С. 106-110. Visnyk of Dnipropetrovsk University. Biology. Ecology. - 2009. - Vol. 17, N 1. - P. 106-110.
УДК 579.61: 616-053.2
К. В. Коцаренко, А. І. Вінніков, Л. П. Голодок, В. Є. Кудрявцева, С. Ю. Єгорова
Дніпропетровський національний університет ім. Олеся Гончара
ДОСЛІДЖЕННЯ ВПЛИВУ АУТОЦИТОКІНІВ НА СТАН МІКРОФЛОРИ ТОВСТОЇ КИШКИ У ХВОРИХ ГАСТРОЕНТЕРОЛОГІЧНОГО ПРОФІЛЮ
Вивчено вплив препаратів аутоцитокінів на зміну біологічних властивостей мікроорганізмів, виділених від хворих на неспецифічний виразковий коліт. Установлено стимулювальну дію препаратів аутоцитокінів на ріст представників нормальної мікрофлори товстої кишки та пригнічуваль-ний ефект відносно умовно-патогенних мікроорганізмів. З’ясовано, що аутоцитокіни не виявляють достовірного впливу на зміну антибіотикочутливості мікроорганізмів.
K. V. Kotsarenko, A. I. Vinnikov, L. P. Golodok, V. E. Kudryavceva, S. Y. Egorova
Oles’ Gonchar Dnipropetrovsk National University
RESEARCH OF THE AUTOCYTOKININS INFLUENCE ON THE LARGE INTESTINE’S MICROFLORA IN GASTROENTEROLOGICAL PATIENTS
The autocytokinins’ influence on the change of biological characteristics of the microorganisms secured from patients with non-specific ulcerous colitis has been studied. It has been found that autocytokinin samples have a stimulating influence on the growth of large intestine’s normal microflora and inhibiting effect to opportunistic pathogenic microorganisms. Autocytokinins are proved to have no significant influence on the antibiotic sensitivity of microorganisms.
Вступ
В усьому світі значно збільшилась кількість випадків заворювань шлунково-кишкового тракту, у тому числі це стосується неспецифічного виразкового коліту. У патогенетичній картині такого захворювання спостерігаються зміни цілого ряду метаболічних властивостей організму. Одні з головних змін стосуються імунної системи та складу мікрофлори. До складу імунної системи входять різні органи, а також клітини, що вільно циркулють у крові [13]. Але особлива роль у ході імунної відповіді належить цитокінам — медіаторам імунної відповіді, які відіграють важливу роль у регуляції розмноження та диференціювання імунокомпетентних клітин [14].
Цитокіни залучені у розвиток і завершеність запальних реакцій, тобто мають виражені імунорегуляторні властивості. Тому багато дослідників розглядають їх як перспективні лікарські препарати. Встановлена кореляція між активністю патологічного процесу та збільшенням в ураженій ділянці слизової оболонки товстої кишки концентрації таких прозапальних цитокінів як ІЛ-1, ІЛ-2, ІЛ-6, ІЛ-8, ІЛ-10, ФНО-а [15; 16]. Фармакологічна блокада прозапальних цитокінів сприяє зменшенню запальної реакції в кишці. Ці спостереження послужили підставою для розвитку нового напрямку терапії захворювань із використанням цитокінів [5; 9]. При неспецифічному виразковому ко-
© К. В. Коцаренко, А. І. Вінніков, Л. П. Голодок, В. Є. Кудрявцева, С. Ю. Єгорова, 2009 106
літі (НВК) знайшли застосування імунотропні препарати з різними механізмами дії -від імунодепресантів до імуностимуляторів. Проте відсутність чітких уявлень про етіологію та патогенез порушень при НВК призводить до недостатньої ефективності методів імунотерапії [3; б].
Поряд із цим останнім часом почали з’являтися відомості, що деякі мікроорганізми можуть використовувати певні цитокіни як ростові чинники [і0]. Це може призвести не до швидкого одужання, а навпаки, до прогресу хвороби мікробної етіології. Рядом дослідників вивчено дію препаратів синтетичних цитокінів на патогенні бактерії in vitro і in vivo. Вплив препаратів цитокінів на патогенні бактерії in vitro може давати різні результати: це стимуляція росту, бактерицидна дія, зміна біологічних властивостей [4; і2]. Виходячи з цих даних, залишається відкритим питання: як будуть поводитися мікроорганізми під дією природних цитокінів (аутоцитокінів), які виділені в нативному стані з людського організму, особливо, якщо це стосується лікування НВК. Тому мета цієї роботи - виявити вплив препаратів аутоцитокінів на мікрофлору товстої кишки та оцінити можливість їх використання при лікуванні неспецифічного виразкового коліту.
Матеріл і методи досліджень
Дослідження проведені на базі лабораторії імунології та мікробіології Інституту гастроентерології АМН України, а також на кафедрі мікробіології та вірусології Дніпропетровського національного університету ім. Олеся Гончара.
Об’єкт дослідження — аутоцитокіни, виділені від хворих на НВК (n = 3), та штами мікроорганізмів Escherichia coli з нормальною ферментативною активністю (НФА), E. coli з гемолітичною активністю (HLy+), Staphylococcus aureus, Proteus spp. Аутоцитокіни отримували з і0 мл венозної гепаринізованої крові методом градієнтного центрифугування (фікол — верографін). Стандартизували за вмістом білка методом Лоурі [S]. Концентрація аутоцитокінів становила у середньому 50—і00 мкг/мл [7].
Готували розведення аутоцитокінів від і : і до і : 25б у м’ясопептонному бульйоні (МПБ), окремо готували мікробну суспензію дослідних штамів за стандартом мут-ності — іхі09 колонієтвірних одиниць/мл (КУО/мл) у 3 мл 0,S5 % фізіологічного розчину. У кожну пробірку з розведеннями зразків і в контрольну пробірку (з фізіологічним розчином) вносили по 0,2 мл інокуляту. Інкубували ІS—24 години при +37 °С у термостаті. Відсутність помітного росту у пробірці з найменшою концентрацією відповідає мінімальній інгібувальній концентрації (МІК) препарату [і0]. Для визначення мінімальної бактерицидної концентрації (МБК) препарату робили висіви з пробірок із відсутністю помітного росту по 0,і мл на чашки Петрі з м’ясопептонним агаром (МПА). Чашки інкубували 24 години при +37 °С. МБК препарату відповідала пробірці, висів з якої не давав росту чи на агарі виросло не більше і0 колоній, що свідчило про загибель 99,9 % клітин популяції [іі].
Для визначення зміни антибіотикочутливості використовували метод дифузії в агар із використанням індикаторних дисків: бензилпеніцилін, оксацилін, еритроміцин, кліндаміцин, гентаміцин, ванкоміцин, ампіцилін, норфлоксацин, хлорамфенікол, тетрациклін, цефтриаксон (фірма НДСФ, Санкт-Петербург, Російська Федерація). До і мл препарату цитокінів і контрольної проби (і мл 0,S5 % фізіологічного розчину) додавали 0,2 мл суспензії досліджуваного штаму, що містила і09 КУО/мл мікробних клітин із добових агарових культур мікроорганізмів, робили висів на МПА. Результати дослідження інтерпретували залежно від діаметра зони (мм) затримки росту штамів мікроорганізмів навколо диска. Для оцінки впливу аутоцитокінів на ростові характеристики
мікроорганізмів використовували кількісний метод дослідження, заснований на визначенні кількості мікробних клітин у і мл рідини - метод сективних посівів. Робили перерахунок кількості колоній, що виросли, на кількість колонієтвірних одиниць у і мл рідини згідно з таблицею [2].
Результати та їх обговорення
За даними дослідників [і0], цитокіни здійснюють бактеріостатичну та бактерицидну дію на штами патогенних мікроорганізмів. У наших експериментах визначено відсутність такого впливу у випадку застосування аутоцитокінів при культивуванні штамів умовно-патогенних мікроорганізмів і представників кишкової нормофлори. Дослідження МІК та МБК препаратів аутоцитокінів на дослідні штами показали відсутність бактерицидної та бактеріостатичної дії препарату аутоцитокінів: у пробірках помітний ріст, а на газоні у місці додавання аутоцитокінів не було зони лізису або затримки росту.
Чутливість мікроорганізмів до антибіотиків вивчали методом дифузії в агар із використанням дисків. Вимірювали зони затримки росту (мм) у контрольних і дослідних пробах [і]. За контроль приймали пригнічення росту штамів S. aureus під дією антибіотиків, ефективних проти грампозитивних мікроорганізмів, без додавання аутоци-токінів. Для досліду використовували аутоцитокіни (табл. і). Наведені результати показали, що достовірних відмінностей чутливості у контрольних і дослідних штамів не встановлено.
Таблиця 1
Показники чутливості S. aureus до антибіотиків за зонами затримки росту (мм), n = 3
Антибіотики Контроль Дослід
Пеніцилін 2б і 3,2 24 і 23
Оксацилін і8 і 2,і і8 і і,9
Еритроміцин і0 і і,5 8 і і,3
Кліндаміцин 24 і 2,7 24 і 2,9
Гентаміцин і8 і 2,і і8 і 2,4
Ванкоміцин і4 і і,9 і4 і і,8
Крім того, визначали чутливість представників грамнегативних умовно-патогенних бактерій: представників роду Proteus та роду Escherichia. Для них використовували інший спектр антибіотиків, ефективних проти даних бактерій. За контроль приймали чутливість мікроорганізмів без додавання аутоцитокінів, у досліді використовували аутоцитокіни (табл. 2).
Для грамнегативних бактерій також не встановлено достовірних відмінностей чутливості до антибіотиків. У той же час можна відзначити тенденцію до підвищення резистентності: так, у S. aureus відмічена така тенденція стосовно пеніциліну та еритроміцину; для Proteus spp. - ампіциліну та цефтриаксону; для E. coli НФА — ампіциліну, хлорамфеніколу, тетрацикліну, цефтриаксону. Тому є сенс припустити, що залишається можливість використання антибіотиків на фоні лікування аутоцитокінами.
Для вивчення ростових характеристик досліджених штамів проводили пре-інкубацію суспензії штамів мікроорганізмів та препарату аутоцитокінів протягом б0 та і20 хв. при +37 °С, робили висів методом секторних посівів та підраховували середнє значення трьох експериментів (табл. 3).
Як видно з таблиці 3, аутоцитокіни по-різному впливають на різні штами мікроорганізмів. Для S. aureus, Proteus spp., E. coli Hly+ спостерігали пригнічення росту відносно контролю (і година преінкубації мікроорганізмів із препаратом аутоцитокінів).
Але через 2 години преінкубації кількість колоній збільшилась. Це свідчить про часовий поріг, дія аутоцитокінів із часом нівелюється. Для Е. соїі НФА через 2 години преінкубації спостерігали стимуляцію росту. Таким чином, установлено факт стимуляції росту мікроорганізмів - представників кишкової нормофлори під дією аутоцитокінів.
Таблиця 2
Чутливість Proteus spp., E. coli Hly+, E. coli НФА до антибіотиків за зонами затримки росту (мм), n = 3
Антибіотики Proteus spp. E. coli Hly+ E. coli НФА
контроль дослід контроль дослід контроль дослід
Ампіцилін 16 і 1,9 15 і 1,7 16 і 2,1 16 і 1,5 15 і 1,8 14 і 1,6
Хлорамфенікол 20 і 2,6 20 і 2,4 20 і 2,5 20 і 2,7 24 і 3,0 22 і 3,0
Тетрациклін 16 і 1,8 16 і 1,9 16 і 1,8 16 і 1,9 16 і 1,9 15 і 1,8
Цефтриаксон 18 і 2,2 17 і 2,0 24 і 2,8 24 і 2,9 26 і 3,1 24 і 3,4
Норфлоксацин 20 і 2,5 20 і 2,6 20 і 2,6 20 і 2,8 20 і 2,5 20 і 2,9
Таблиця З
Вплив аутоцитокінів на чисельність мікроорганізмів, lg КУО/мл, n = З
Штами мікроорганізмів Час інкубації, години Контроль Дослід
S. aureus 1 8,0 6,7
2 7,4 7,4
Proteus spp. 1 6,7 6,0
2 6,7 6,7
E. coli Hly+ 1 6,7 6,4
2 7,5 7,4
E. coli НФА 1 6,5 6,5
2 7,0 7,5
Висновки
У ході дослідження дії препаратів аутоцитокінів установлено відсутність бактерицидної та бактеріостатичної дії на переважну більшість представників індигенної мікрофлори товстої кишки. Відмічено, що аутоцитокіни не виявляють достовірного впливу на зміну антибіотикочутливості мікроорганізмів, що робить можливим використання препаратів аутоцитокінів при антибіотикотерапії. Установлену стимулювальну дію препаратів аутоцитокінів на ріст тестової культури E. coli НФА - представника нормальної мікрофлори. У той же час препарати пригнічують розвиток умовно-патогенних мікроорганізмів E. coli HLy+, S. aureus, Proteus spp. Це дає змогу використовувати препарати аутоцитокінів для стимуляції індигенної мікрофлори кишечника, при цьому пригнічуючи розвиток неспецифічного виразкового коліту.
Бібліографічні посилання
1. Авдєєва Л. В. Методичні підходи до визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків II Лабораторна діагностика. - 2005. - № 3. - С. 95.
2. Бактеріологія і вірусологія: Нормативне виробничо-практичне видання I Під ред. Т. В. Ма-рухно. - К. : Медінформ, 2007. - С. 625.
3. Береза Н. М. Способ лечения неспецифического язвенного колита I Н. М. Береза, Т. П. Шам-шонкова - Пат. № 23831А, Украина, МКИ А61 К38Ю0. Бюл. № 4. - 1998.
4. Влияние препаратов цитокинов на устойчивость бактерий к антибиотикам in vitro I С. С. Афанасьев, А. В. Алёшкин, А. А. Воробьев и др. II Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2005. - № 3. - С. 99.
5. Ковальчук Л. В. Комплекс естественных иммунопептидов в лечении раневого процесса I Л. В. Ковальчук, М. В. Хорева, Т. П. Ванюшко I Материалы I съезда иммунологов в России. -Новосибирск, 1992. - С. 220.
6. Ковальчук Л. В. Иммуноцитокины и локальная иммунокоррекция I Л. В. Ковальчук, Л. В. Ганковская II Иммунология. - 1995. - № 1. - С. 98.
7. Ковальчук Л. В. Бактерицидное действие комплекса природних цитокинов на Streptococcus pyogenes in vitro I Л. В. Ковальчук, Л. В. Ганковская, Т. А. Шведова и др. II Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2006. - № 3. - С. 114.
8. Практикум по биохимии I Под ред. С. Е. Северина, Г. А. Соловьевой - М. : Изд-во МГУ, 1989. - С. 81.
9. Применение аутоцитокинов в лечении отдаленных метастазов рака поджелудочной железы I А. Раухфаус, А. Маль, В. Насиф, А. Клер II Клінічна хірургія. - 1996. - № 8. - С. 120.
10. Рисованная Е. И. Новые представления о взаимодействии цитокинов, как медиаторов иммунного ответа, и микроорганизмов I Е. И. Рисованная, И. Е. Соколова I Современные научные достижения - 2007. Матер. II Междунар. научно-практ. конф. - Т. 5. Биологические науки. - Д. : Наука и образование, 2007. - С. 105.
11. Романова Ю. М. Некультивируемое состояние у патогенных бактерий: известные и возможные факторы индукции обратимого процесса II Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1998. - № 3. - С. 91.
12. Романова Ю. М. Цитокины - возможные активаторы роста патогенных бактерий I Ю. М. Романова, А. Л. Гинцбург II Вестник Российской АМН. - 2000. - № 1. - С. 90.
13. Соколова J. Є. Основи імунології I І. Є. Соколова, А. І. Вінніков, Т. М. Політико. - Д : Вид-во ДНУ, 2007. - С. 559.
14. Goodnbourn S. Interferons: cell signaling, immune modulation, antiviral response and virus countermeasures I S. Goodnbourn, L. Didcock I J. Gen. Virol. - 2000. - Vol. 81. - P. 86.
15. Kwak J. Cytokines secreted by lymphokine-activated killer cells induce endogenous nitric oxide synthesis and apoptosis in DLD-1 colon cancer cells I J. Kwak, M. Han, K.Choi I Cell. Immunol. -2000. - N 2. - P. 99.
16. Sen G. C. Viruses and interferon II Annu. Rev. Microbiol. - 2001. - Vol. 55. - P. 255.
Надтшла до редколегії 29.03.2009
