CC BY
45
Информация об авторах: Ливанова Наталья Николаевна - ст.н.с., к.б.н., 630090 г. Новосибирск, проспект Лаврентьева, 8, тел. (383) 363-51-57, e-mail: nata-livanova@yandex.ru; Боргояков Вячеслав Юрьевич - аспирант;
Ливанов Станислав Генрихович - ст.н.с., к.б.н.; Тикунова Нина Викторовна - зав.лабораторией, доцент, д.б.н.;
Фоменко Наталия Владимировна - ст.н.с., к.б.н.
© МОРОЗОВА В.В., ФОМЕНКО Н.В., СТРОНИН О.В., МАТВЕЕВ А.Л., ТИКУНОВА Н.В. - 2012 УДК 577.27
РЕПЕРТУАР ГЕННЫХ СЕГМЕНТОВ, КОДИРУЮЩИХ ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫЕ АНТИТЕЛА ЧЕЛОВЕКА, НАПРАВЛЕННЫЕ К АНТИГЕНАМ BORRELIA GAR INI I
Вера Витальевна Морозова1, Наталья Владимировна Фоменко1,2, Олег Владимирович Стронин3,
Андрей Леонидович Матвеев1, Нина Викторовна Тикунова1 ('Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск, директор - акад. РАН В.В. Власов; 2ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск, генеральный директор - М.Д. Хусаинов, 3Филиал ФГПУ НПО «Микроген» МЗ РФ НПО «Вирион», Томск, директор - В.П. Морозов)
Резюме. В работе исследовали репертуары генных сегментов, кодирующих одноцепочечные антитела человека, направленные к антигенам Borreliagarinii. Антитела отбирали из комбинаторных библиотек, полученных на основе мРНк лимфоцитов периферической крови здоровых доноров (N-библиотека) и больных рассеянным склерозом (MS-библиотека). Среди специфичных к антигенам B. garinii антител, отобранных из MS-библиотеки, выявлены антитела, содержащие сегменты VH4-39, появляющиеся при рассеянном склерозе, и VH6, экспрессия которого в норме показана только для эмбриональных стадий развития организма. Генные сегменты, кодирующие больше трети антител, отобранных из MS-библиотеки, имели низкий процент гомологии генам зародышевой линии, в то время как гены антител, отобранных из N-библиотеки, высокогомологичны генам зародышевой линии. Методом тИФА показано, что популяции антител, аффинно обогащенных на антигены B. garinii, эффективно связывались с основным белком миелина. Возможно, белки боррелий могут вызывать аутоиммунную реакцию организма, направленную против структур нервной системы, за счет механизмов молекулярной мимикрии.
Ключевые слова: Borrelia garinii, нейроборрелиоз, комбинаторная библиотека антител, рассеянный склероз.
REPERTOIRE OF GENE SEGMENTS ENCODING HUMAN SINGLE-CHAIN ANTIBODIES SELECTED AGAINST BORRELIA GARINII ANTIGENS
V.V Morozova1, N.V. Fomenko1,2, A.L.Matveev1,O.V.Stronin3, N.V.Tikunova1 ('Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine SB RAS, 2Joint Stock Company “Vector-Best’,
3Federal State Unitary Company “Microgen Scientific Industrial Company for Immunobiological Medicines”)
Summary. Repertoires of gene segments, coding single-chain human antibodies against Borrelia garinii antigens, were explored. Antibodies were selected from combinatorial libraries of single-chain antibodies (scFv), produced using mRNA from PBLs of healthy donors (N-library) and patients with multiple sclerosis (MS-library). Among gene segments from MS-library, encoding B.garinii-specific antibodies, VH4-39, incident for MS, and VH6, normally expressing in embryo, were identified. More than a third of gene segments encoding B. garinii-specific antibodies from autoimmune library possessed low homology with germ line genes, at the same time gene segments from nanve library were highly homologous to germ line genes. Populations of antibodies, enriched against B.garinii antigens, effectively bound myelin basic protein in ELISA. Probably, borrelia proteins may cause in organism autoimmune reaction against nervous system, using molecular mimicry mechanism.
Key words: Borrelia garinii, neuroborreliosis, combinatorial antibody library, multiple sclerosis.
Иксодовый клещевый боррелиоз (ИКБ) - полиси-стемное заболевание, при котором возможно поражение опорно-двигательного аппарата, нервной и сердечнососудистой систем, а также кожи [6]. Наиболее тяжелое проявление ИКБ - нейроборрелиоз, характеризующийся поражением как центральной, так и периферической нервной системы [7]. На территории России широко распространены Borrelia garinii и Borrelia afzelii, относящиеся к комплексу B. burgdorferi sensu lato [14]. Анализ клиники при ИКБ в различных регионах России указывает на преобладание неврологической симптоматики. Принято считать, что с неврологическими проявлениями ИКБ ассоциирован вид B. garinii [5].
Поздние поражения нервной системы при ИКБ, проявляющиеся через месяцы и годы после начала заболевания, зачастую после длительного латентного периода, включают в себя признаки поражения всех отделов нервной системы. Выделяют разные варианты его течения: прогрессирующий энцефаломиелит, хроническую радикулополиневропатию, хронический лимфоцитарный менингит, церебральный васкулит, энцефалопатию и др. [1,4]. Хроническое течение ИКБ в России изучено мало, что связано с отсутствием общепринятых критериев диагностики и доступных методов идентификации инфекции. Прогрессирующий энцефаломиелит
при ИКБ нередко имитирует рассеянный склероз (РС) [3,12]. Частота выявления энцефаломиелита при ИКБ невысока и составляет в среднем 4-5% от всех случаев нейроборрелиоза [1]. Чаще всего наблюдается медленное развитие поражения нервной системы с постепенным углублением патологического процесса, имитирующее другие нозологические формы, в частности РС и рассеянный энцефаломиелит. Известно, что у больных с хроническим нейроборрелиозом в ряде случаев в спинномозговой жидкости (СМЖ) могут определяться антитела к основному белку миелина [11]. Сходство симптоматики РС и поражений нервной системы при ИКБ затрудняют диагностику и идентификацию заболевания.
Одним из современных инструментов для исследования иммунного ответа человеческого организма на различные антигены является метод фагового дисплея антител. Этот метод подразумевает создание и использование комбинаторных библиотек Fab-фрагментов или одноцепочечных антител (оцАТ), экспонированных на поверхности нитчатых бактериофагов. Полагают, что популяция антител в такой библиотеке отражает репертуар антител в организме человека. Ранее на основе мРНК лимфоцитов периферической крови здоровых доноров и больных РС были сконструированы, соот-
ветственно, наивная (N-) и аутоиммунная (MS-) библиотеки оцАТ человека [2,10]. Задачей данной работы было изучение популяций антител, отобранных из N- и MS-библиотек по связыванию с антигенами B. garinii, с целью поиска факторов, влияющих на возникновение патологических изменений нервной системы при ИКБ.
Материалы и методы
В качестве антигена использовали инактивированную культуру B. garinii штамм BgVir-1, сконцентрированную до титра 1011 кл/мл. Для наработки бактериофагов использовали штамм Escherichia coli TG1 F' [traD36 proAB+ lacIq lacZAM15]supE thi-1 A(lac-proAB) A(mcrB-hsdSM)5, (rK-mK-).
Таq-полимераза производства Сибэнзим (Новосибирск, Россия), набор для секвенирования ДНК производства Applied Biosystems (США), конъюгат антител козы против IgG кролика с щелочной фосфатазой производства Sigma (США), ФСБ-Т - фосфатно-солевой буферный раствор, содержащий 0,1% Tween 20.
Выделение субклеточных фракций B. garinii штамм BgVir-1 проводили по методу Котарски с модификациями [9]. Количество белков в препаратах определяли по методу Лоури. Чистоту полученных фракций оценивали с использованием SDS-гель-электрофореза по Лемли.
Аффинное обогащение проводили, как описано [2]. В ходе раунда аффинного обогащения в различные лунки иммунологического планшета сорбировали антигены мембранной и цитоплазматической фракций в концентрации 50 мкг/мл для первого раунда обогащения и 25 мкг/мл для второго и третьего. Степень обогащения популяций оцАТ, специфичными к антигенам B. garinii, оценивали методом непрямого твердофазного ИФА (тИФА).
Для отбора оцАТ, специфичных к антигенам B. garinii, тестировали отдельные клоны из популяций, полученных в результате аффинного обогащения. Супернатанты, полученные при культивировании каждого клона и содержащие бактериофаги с экспонированными на поверхности оцАТ, исследовали в твердофазном ИФА по их связыванию с антигенами B. garinii, сорбированными в лунки иммунологического планшета в концентрации 200 нг/лунка. В качестве отрицательного контроля использовали связывание бактериофага M13K07, не несущего на поверхности антитела с антигенами B. garinii. Критерием отбора служило превышение сигнала оптической плотности в тестируемом клоне в 5 и более раз над сигналом, который наблюдается в отрицательном контроле.
Последовательности генов, кодирующих отобранные антитела, определяли с использованием праймеров 5’-CAGGAAACAGCTATGAC,
5’-CTATGCGGGCCCATTCA и набора BigDye' Terminator v3.1 Cycling Sequencing Kit (Applied Biosystems). Последовательности анализировали с использованием программ SeqMan Lasergene и MEGA v. 4.1. Выведенные аминокислотные последовательности анализировали и сравнивали с имеющимися в базе данных NCBI IgBLAST.
Результаты и обсуждение
В качестве антигенов использовали цитоплазматическую и мембранную фракции B. garinii, штамм В§Уіг-1 (подгруппа ЫТ29), изолированный от таежных клещей, отловленных на территории Томской области. Одной из основных проблем, возникающих при работе с мультивалентными антигенами, такими как бактериальные и вирусные белковые экстракты, является проблема идентификации белков, с которыми связываются полу-
Рис. 1. Выделение субклеточных фракций B. garinii: 1 - цитоплазматическая фракция (концентрированная), 2 - исходная цитоплазматическая фракция, 3 -мембранная фракция, 4 - белковый маркер молекулярных масс (Fermentas, Литва).
ченные антитела. Поэтому в нашей работе применили предварительное разделение субклеточных фракций B. garinii (рис. 1), Оценка концентраций полученных белковых фракций по методу Лоури показала, что цитоплазматическая фракция содержала 0,18 мг/мл белков, а мембранная фракция - 2,75 мг/мл белков.
N-библиотеку и MS-библиотеку независимо обогащали клонами, продуцирующими антитела, специфически направленные к мембранной и цитоплазматической фракциям B. garinii. Процедура аффинного обогащения библиотеки путем повторяющихся раундов связывания антител с антигеном позволяет отбирать бактериофаги, экспонирующие антитела с предопределенными свойствами. В результате получили четыре популяции, обогащенные специфическими антителами: mm - популяция антител, отобранных из MS-библиотеки по связыванию с мембранной фракцией B. garinii; mc - популяция антител, отобранных из MS-библиотеки по связыванию с цитоплазматической фракцией; nm - популяция ан-
тс тт пс пт
Рис. 2. Связывание обогащенных популяций из Ы- и М8-комбинаторных библиотек антител с цитоплазматическими и мембранными антигенами B. garinii в тИФА.
Таблица 1
Характеристика генных сегментов, кодирующих вариабельные домены одноцепочечных антител человека, направленных к антигенам В. garinii
оцАТ Генные сегменты Уровень гомологии генам зародышевой линии, % Генные сегменты Уровень гомологии генам зародышевой линии, %
УН 0Н _1Н JL
оцАТ, отобранные из МБ-библиотеки по связыванию с цитоплазматическими антигенами
тсЕ1' УН1-8*01 04-4*01 JHб*03 94.7 КУ1-5*03 KJ2*01 98.9
тсБП УН1-3*01 Рб-13*01 JH4*02 97.4 ЬУ8-б1*01 1 17*01 98.3
тсЕ8 УН3-11*05 02-21*02 JHб*02 87.5
тсА1 УН3-23*04 92.9 _Уб-57*01 □3*01 99
тсА42 УН3-23*04 01-2б*01 JHб*03 92,8 КУ1-17*01 KJ5*01 9б.4
тсН52 УН3-23*04 01-2б*01 JHб*03 92.8 _У1-44*01 □3*01 98,7
тсН92 УН3-23*04 01-2б*01 JHб*03 92.8 1_У10-54*01 1 17*01 95.8
тсВ12 УН3-23*04 03-10*02 JHб*03 92.4 КУ3-15*01 KJ2*04 97.8
тсА3 УН3-48*02 03-3*01 JHб*03 99.7
тсВ23* УН3-48*03 03-22*01 85.8 ЬУ3-19*01 1 17*01 100
тсВІО3 УН3-48*03 03-22*01 85.8 КУ3-Ы_5*01 Ю5*01 95.5
тсР13 УН3-48*03 03-22*01 85.8
тсР5 УН3-48*03 04-17*01 JHб*02 9б.8 ЬУ3-1*01 LJ3*01 98.9
тсв1 УН3-48*03 04-17*01 JHб*02 9б.7
тсЕ11 УН3-72*01 04-4*01 JHб*03 98.3 ЬУ3-19*01 □3*01 99.7
тсВ74 УН4-39*01 03-3*02 JH4*03 90.7
тсЕ74 УН4-39*01 03-3*02 JH4*03 90.5 ЬУ3-19*01 1 17*01 91.9
тсА10 УН4-Ь*02 01-2б*01 JH4*02 85.0 ЬУ8-б1*01 1 13*02 92.1
оцАТ, отобранные из МБ-библиотеки по связыванию с антигенами мембранной фракции
ттЮб1 УН1-8*01 04-4*01 JHб*03 94.б ЬУ3-19*01 □3*01 9б.2
тт01 УН3-9*01 01-7*01 JH2*01 90.5 _Уб-57*01 LJ3*01 92
ттС2 УН3-23*04 07-27*01 JH2*01 93.8 КУ2-30*01 KJ5*01 98.3
тт011 УН3-23*04 03-22*01 JH4*03 93.4 _У7-4б*01 1 17*01 92.9
ттЕ82 УН3-23*04 01-2б*01 JHб*03 94.5 КУ2-30*01 Ю5*01 97.7
ттв4 УН3-23*04 03-1б*01 JH5*01 92.б ЬУ8-б1*01 1 13*02 9б.9
ттА113 УН3-48*03 03-22*01 85.8 КУ10-39*01 КЛ*01 93.4
ттВ54 УН4-39*01 03-3*02 JH4*03 90.5 1_Уб-57*01 1 13*02 97.3
ттН2 УНб-1*01 05-24*01 JH4*03 98 КУ4-1*01 Ю5*01 95.5
оцАТ, отобранные из Ы-библиотеки по связыванию с цитоплазматическими антигенами
птН5 УН1-8*01 02-21*02 JHб*02 86.7 КУ3-11*01 KJ2*01 9б.8
пт07 УН1-4б*02 05-24*01 JH4*02 90.1 КУ20-28*01 КЛ*01 9б.2
птС10 УН3-7*03 03-9*01 JH4*02 95.4 КУ1-9*01 KJ5*01 9б
птВ1 УН3-11*01 03-1б*01 JH5*02 93.9 КУ1-17*01 Ю4*01 97.9
птР4 УН3-11*01 07-27*01 JH4*02 94.4 КУ10-39*01 KJ4*01 92.3
птА4 УН3-21*01 04-17*01 JH3*02 91.9 КУ3-11*01 KJ3*01 9б.2
пт05 УН3-9*01 05-5*01 JHб*04 97.9 КУ2-30*01 КЛ*01 9б.3
птЕ8 УН3-23*04 01-20*01 JH2*01 93.2 КУ10-39*01 КЛ*01 92.0
оцАТ, отобранные из Ы-библиотеки по связыванию с антигенами мембранной < и и ц к а р
псВ9 УН1-2*04 05-12*01 JHб*02 99.б КУ3-15*01 Ю3*01 9б.4
псВ12 УН3-9*01 01-7*01 JHб*02 92.8 КУ3-20*01 KJ4*01 95.0
псА2 УН3-11*01 02-8*01 JH5*01 99.б ЬУ3-19*01 LJ3*01 100
псС8 УН3-13*01 0б-19*01 JH2*01 92,5 КУ1-5*03 KJ3*01 90,8
псй5 УН3-21*04 0б-13*01 JH5*02 92.5 КУ10-39*01 KJ2*01 93
псВ8 УН3-23*04 01-2б*01 JH4*03 99.б КУ10-39*01 Ю4*01 95.0
псйЗ УН3-23*04 04-4*01 JH4*02 88.6 У10-39*01 KJ4*01 95.0
псН2 УН3-23*04 0б-19*01 JH4*02 92.1 КУ1-17*01 KJ4*01 94.7
псА12 УН3-30*04 03-3*02 JH4*02 94.8 КУ10-39*01 KJ4*02 99.3
псС1 УН3-48*03 05-5*01 JH4*02 9б.7 !вКУ1-5*03 КЛ*01 88
псН10 УН3-49*04 04-17*01 JH5*02 97.3 КУ10-39*01 КЛ*01 95.1
пс02 УН3-бб*01 03-10*01 JH4*02 95.8 КУ3-20*01 KJ2*03 9б.7
псВ10 УН3-74*02 05-12*01 JH4*03 95.3 КУ3-М5*01 KJ4*01 9б.9
Примечание-, жирным курсивом отмечены антитела, соответствующие которым генные сегменты и/или гипервариабельные районы, обладают уровнем гомологии с генами зародышевых линий меньше 90%; * - было выявлено 4 идентичных данному клону с одинаковыми УН и VL доменами; УН домены АТ, отмеченные верхним индексом (^ 1 3 4), встречаются в популяциях МБ-библиотеки неоднократно.
тител, отобранных из Ы-библиотеки по связыванию с мембранной фракцией; пс - популяция антител, отобранных из Ы-библиотеки по связыванию с цитоплазматической фракцией. Обогащение полученных популяций антителами, специфическими к антигенам В. garinii подтверждали методом непрямого тИФА (рис. 2).
Из каждой обогащенной популяции протестировали по 180 клонов на способность продуцировать оцАТ, специфичные к антигенам В. garinii.
В результате к антигенам цитоплазматической фракции был отобран 21 положительный клон из МБ-библиотеки и 13 клонов из Ы-библиотеки, к белкам мембранной фракции - 10 клонов из М8-библиотеки и 8 - из Ы-библиотеки.
Для идентификации уникальных антител, отобранных по связыванию с цитоплазматическими и мембранными антигенам В. garinii, определяли нуклеотидные последовательности их генов. При анализе соответствующих им аминокислотных последовательностей была установлена принадлежность вариабельных доменов тяжелых и легких цепей соответствующим семействам, и степень их сходства с генами зародышевой линии (табл.
1, рис. 3).
Филогенетический анализ генных сегментов показал, что среди УИ-сегментов антител, отобранных из обеих библиотек, доминируют УИЗ-сегменты (табл.
1). Только в популяции антител, отобранных из М8-библиотеки, были обнаружены сегменты УИ4-39, характерные для антител, образующихся при РС [13], и сегменты УИ6-семейства, экспрессия которого в норме обнаружена лишь на эмбриональных стадиях развития организма человека [16]. Для DH-сегментов, формирующих антитела, отобранные из Ы-библиотеки, было отмечено равномерное распределение по семействам, что характерно для организма в норме [15]. В то же время для DH-сегментов, формирующих антитела, отобранные из М8-библиотеки, доля DH3-семейства составила более 50%. Среди Щ-сегментов, присутствующих в антителах, отобранных из МБ-библиотеки, доминировал Щ6 сегмент, что так-
же отличается от распределения Щ-сегментов антител, отобранных из Ы-библиотеки. Можно предположить, что спектр генных сегментов, привлекаемых иммунной системой для образования антител, направленных к антигенам В. garinii, отличается в норме и при аутоиммунной патологии.
Почти все УИ-домены, отобранные из Ы-библиотеки, обладали более чем 90%-ным сходством с генами зародышевой линии, поэтому можно предположить, что мы имеем дело с низкоаффинными антителами класса ]£М. В то же время, значительное количество антител (~ 40%), отобранных из МБ-библиотеки, имели низкий уровень гомологии с генами зародышевых линий,
генные сегменты, кодирующие антитела, отобранные из К-библиотеки генные сегменты, кодирующие антитела, отобранные из МБ-библиотеки. Рис. 3. Различия в представленности генных сегментов (в % от общего количества) в популяциях антител, отобранных против антигенов В. garinii.
причем наименьшим процентом гомологии (60-85%) обладали гипервариабельные районы УИ-доменов. Вероятно, эти антитела прошли процесс аффинного созревания. Поскольку эти антитела были получены при аффинном обогащении МБ-библиотеки против антигенов В. garinii, можно предположить, что белки боррелий способны связывать специфические аутоантитела, которые могут образовываться в ходе развития РС.
Еще одной особенностью антител, отобранных из МБ-библиотеки против цитоплазматических и мембранных антигенов В. garinii, являлось наличие идентичных антител в шш- и тс-популяциях (табл. 1). Для антител, отобранных из Ы-библиотеки, такого не наблюдалось. По-видимому, часть антител, отобранных из МБ-библиотеки, кросс-реактивны, то есть способны связывать эпитопы и мембранных, и цитоплазматических антигенов В. garinii.
Полученные популяции антител, аффин-но обогащенных на антигены В. garinii, были проверены на связывание в тИФА с основным белком миелина (ОБМ), являющимся одной из основных мишеней аутоиммунной реакции при РС. В результате было показано, что все четыре обогащенные популяции оцАТ эффективно связывают ОБМ (рис. 4). Данный факт может свидетельствовать о наличии сходных эпитопов у ОБМ и белков
В. garinii, и, как следствие, белки боррелий могут вызывать аутоиммунную реакцию организма, направленную против структур нервной системы, за счет механизмов молекулярной мимикрии.
Исходя из полученных результатов, можно заключить, что в случае попадания антигенов боррелий в организм условно здорового человека гуморальный ответ определяется в первую очередь «наивными» антителами, кодируемыми генами, высокогомологичными генам зародышевых линий и не подвергшимися соматическому гипермутагенезу. При взаимодействии с антигенами боррелий гуморальной системы, сформированной в ходе развития РС, к иммунному ответу привлекаются, в том числе и аутоиммунные антитела, появившиеся при этой патологии. Можно предположить, что, по крайней мере, некоторые молекулярные механизмы, участвующие как в развитии РС, так и в ряде случаев ИКБ, имеют сходную природу. Дополнительным доказательством такого предположения может служить обнаружение способности антител, специфически направленных к антигенам боррелий, к кросс-реактивному связыванию белков, присутствующих в клетках
нервной системы [8].
Рис. 4. Связывание популяций антител, аффинно обогащенных против антигенов В. garinii, с основным белком миелина в тИФА.
Работа выполнена при частичной поддержке гранта РФФИ 11-04-01066-а и проекта № 5.25 Программы фундаментальных исследований РАН «Фундаментальные науки - медицине» Российской академии наук.
ЛИТЕРАТУРА
1. Баранова Н.С., Спирин Н.Н., Шипова Е.Г., Степанов И.О. Поражение нервной системы на отдаленных стадиях Лайм-боррелиоза // Журнал неврологии и психиатрии. -2010. - №2. - С.90-96.
2. Батанова Т.А., Улитин А.Б., Морозова В.В. и др. Создание и характеризация наивной комбинаторной библиотеки одноцепочечных антител человека // Молекулярная генетика, вирусология и микробиология. - 2006. - №3. - С.35-41.
3. Вельгин С.О., Протас И.И., Понамарев В.В. и др. Клинический полиморфизм нейроборрелиоза в поздней стадии заболевания // Журнал неврологии и психиатрии. - 2006.
- №3. - С.48-51.
4. Деконенко Е.П., Уманский К.Г., ВирисИ.Е. Основные синдромы неврологических нарушений при Лайм-борреллиозе // Тер. арх. - 1995. - №1. - С.52-56.
5. Лесняк О.М., Истомина О.Ю., Рипкема Ш. и др.
Клинические проявления Лайм-боррелиоза на Среднем Урале и их ассоциации с геновидами Borrelia burgdorferi // Тер. арх. - 1997. - №5. - С.9-12.
6. Лобзин Ю.В., Усков А.Н., Козлов С.С. Лайм-боррелиоз (Иксодовые клещевые боррелиозы). - СПб.: Фолиант, 2000.
7. Ackermann R., Gollmer E., Kupper B. Progressive Borrelien-Enzephalomyelitis: Chronische Manifestation der Erythema Chronicum Migrans Krankheit am Nervensystem // Dtsch Med Wochenschr. - 1985. - №110. - С.1039-1042.
8. Birner P, Gatterbauer B., Drobna D., Bernheimer H. Molecular Mimicry in Infectious Encephalitis and Neuritis: Binding of Antibodies Against Infectious Agents on Western Blots of Human Nervous Tissue // Journal of Infection. - 2000 -Vol. 41 - P.32-38.
9. Bledsoe H.A., Carroll J.A., Whelchel T.R., et al. Isolation and Partial Characterization of Borrelia burgdorferi Inner and Outer Membranes by Using Isopycnic Centrifugation // Journal of Bacteriology. - 1994. - Vol. 176. - P.7447-7455.
10. Gabibov A.G., Belogurov A.A., Lomakin Y.A., et al. Combinatorial antibody library from multiple sclerosis patients reveals antibodies that cross-react with myelin basic protein and EBV antigen // FASEB J. - 2011. - Vol. 25 - P.4211-4221.
11. Heller J., Holzer G., Schimrigk K. Immunological differentiation between neuroborreliosis and multiple sclerosis // J. Neurol. - 1990. - Vol. 237 - P.465-470.
12. Logigian E.L., Kaplan R.E, Steere A.C. Chronic neurologic manifestations of Lyme disease // N. Engl. J. Med. - 1990. - Vol. 323 - P. 1438-1444.
13. Owens G.P., Winges K.M., Ritchie A.M. VH4 gene segments
dominate the intrathecal humoral immune response in multiple sclerosis // J. Immunol. - 2007 - Vol. 179 - P.6343-6351.
14. Postic D., Korenberg E., Gorelova N., et al. Borrelia burgdorferi sensu lato in Russia and neighbouring countries: high incidence of mixed isolates // Res. Microbiol. - 1997. - Vol. 148.
- P.691-702.
15. Tiller T., Tsuiji M., Yurasov S. Autoreactivity in human IgG+ memory B cells // Immunity. - 2007 - Vol. 26 - P.205-213.
16. Tonnelle C., Cuisinier A.M., Gauthier L. Fetal versus adult PreB or B cells: the human VH repertoire // Ann. N Y Acad. Sci.
- 1995 - Vol. 764 - P.231-241.
Информация об авторах: Морозова Вера Витальевна — к.б.н., старший научный сотрудник, 630090, г. Новосибирск, Академика Лаврентьева проспект, 8, тел. (383)-363-51-57, e-mail: morozova@niboch.nsc.ru; Фоменко Наталья Владимировна
- к.б.н., научный сотрудник; Стронин Олег Владимирович, к.м.н., начальник отделения; Матвеев Андрей Леонидович -аспирант; Тикунова Нина Викторовна - д.б.н., заведующая лабораторией.
© ТЮЛЬКО Ж.С., ЯКИМЕНКО В.В. - 2012 УДК 578.2'21
ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНОМОВ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА, СВЯЗАННАЯ С ИХ СТРУКТУРОЙ
Жанна Сергеевна Тюлько1, Валерий Викторович Якименко2 (‘Омская государственная медицинская академия, ректор - д.м.н., проф. А.И. Новиков; кафедра физики, математики, медицинской информатики, зав. - к.ф-м.н. Ю.Б. Никитин; 2Омский НИИ природно-очаговых инфекций, директор - д.м.н., проф. Н.В. Рудаков, лаборатория арбовирусных инфекций,
зав. - д.б.н. В.В. Якименко)
Резюме. Для обнаружения корреляций при возникновении нуклеотидных замен в первичных последовательностях генома вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) был использован метод выявления связанных изменений в символьных последовательностях, основанный на подсчете взаимной информации. По результатам анализа обнаружены статистически значимые корреляции при возникновении нуклеотидных замен (как синонимичных, так и несинонимичных) на удаленных друг от друга участках генома. Сравнение известных описаний структурных элементов нуклеотидной последовательности ВКЭ с полученной схемой корреляций нуклеотидных замен показало, что наблюдаемые корреляции выявлены для однонитевых участков стеблей шпилечных структур вирусной РНК, взаимодействующих друг с другом при образовании третичной структуры. Предложенный метод позволяет определять участки вирусной РНК, имеющие значение при формировании третичной структуры молекулы.
Ключевые слова: вирус клещевого энцефалита, связанные нуклеотидные замены, третичная структура РНК.
THE NUCLEOTIDE SEQUENCES VARIABILITY OF GENOMES OF TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS ASSOCIATED WITH THEIR STRUCTURE
J.S. Tjulko1, V.V. Yakimenko2 (‘Omsk State Medical Academy; 2Omsk Institute of Natural Foci Infections of Russian Federal Service for Consumer Rights and Welfare Controls)
Summary. For detection of correlations in nucleotide substitution occurrence in TBE-virus genome nucleotide sequences, the method of revealing of the connected changes in the symbolical sequences, based on calculation of the relative information was used. By the results of the analysis, statistically significant correlations have been found out in nucleotide substitution occurrence (both synonymous, and not synonymous) on the sites of genome, removed from each other. Comparison of known descriptions of nucleotide sequence of structural elements with the received circuit of correlations has shown, that the found out correlations are revealed for unpaired nucleotides in stalks of RNA hairpins. Such hairpins cooperate with each other in formation of tertiary RNA-structure. The presented method allows to define RNA sites, which are important in formation of tertiary structure of a molecule.
Key words: tick-borne encephalitis virus, connected nucleotide substitution, tertiary RNA-structure.
В рамках современных представлений о генетической вариабельности вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) выделяют не менее трех основных генотипов (геновидов) вируса, два из которых имеют крайне широкое географическое распространение в северной Евразии [2]. Высокий уровень экологической пластичности широко распространенных геновидов ВКЭ предполагает существование достаточно вариабельных биологических свойств штаммов ВКЭ, что регистрируется при изучении структуры природных очагов клещевого энцефалита (КЭ). Данное сообщение ориентировано на выявление подходов к определению детерминированности биологических свойств вирусов, а именно - поиску механизмов изменений биологических свойств, связанных непосредственно с изменениями первичной структуры генома вируса, и (или) - опосредованно - с
изменениями пространственной структуры молекулы.
Применение подобных подходов становится возможным в связи с увеличением количества нуклеотидных последовательностей ВКЭ, размещаемых в банках данных и накоплением информации о мутациях в вирусном геноме и структурных особенностях организации вирусных РНК.
Нуклеокапсид вирусной частицы флавивирусов, включает в себя капсидный белок С и геномную +РНК. Он окружен липидной мембраной, содержащей М (мембранный) и Е (оболочечный) белки. Геномная РНК фла-вивирусов кодирует три структурных (С, М и Е) и семь неструктурных белков (N¿1, Ы82А, Ы82В, N83, Ы84А, Ы84В, N85), которые последовательно считываются в единой рамке считывания и нужны для успешного размножения вируса в клетках хозяина, хотя на сегод-
