CC BY
22
Раздел 02.00.10
Биоорганическая химия
УДК 547.992.2:551.312.2:543.544 DOI: 10.17122/bcj-2020-3-36-42
Н. П. Аввакумова (д.б.н., проф., зав. каф.), М. А. Кривопалова (к.х.н., доц.), М. Н. Качалкин (асс.), А. В. Жданова (к.фарм.н., доц.), М. Н. Глубокова (к.фарм.н., доц.), Е. Е. Катунина (к.б.н., доц.), С. В. Первушкин (д.фарм.н, проф.)
РЕЛЯТИВНЫЙ АНАЛИЗ ФУНКЦИОНАЛЬНО-ГРУППОВОГО СОСТАВА ГУМУСОВЫХ КИСЛОТ НИЗКОМИНЕРАЛИЗОВАННЫХ ИЛОВЫХ СУЛЬФИДНЫХ ГРЯЗЕЙ
Самарский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения РФ,
кафедра медицинской химии 443099 г. Самара, ул. Чапаевская, 89; e-mail: kaf_medhim@samsmu.ru
N. P. Avvakumova, M. A. Krivopalova, M. N. Kachalkin, A. V. Zhdanova, M. N. Glubokova, E. E.Katunina, S. V. Pervushkin
RELATIVE ANALYSIS OF FUNCTIONAL GROUP COMPOSITION OF LOW-MINERALIZED HUMIC ACIDS
SILT SULPHIDE MUD
Samara State Medical University 89, Chapaevskaya Str, 443099 Samara, Russia; e-mail: kaf_medhim@samsmu.ru
Работа посвящена определению количественных характеристик гумусовых кислот пелоидов, необходимых для разработки способов их стандартизации. В работе приведена методика извлечения препарата гумусовых кислот низкоминерализованных иловых сульфидных грязей со степенью минерализации 10.2±0.5 % мас. Количественные критерии для отнесения субстанции к гумусовым кислотам пелоидов получали путем статистической обработки результатов ИК-спек-троскопии 15 образцов препарата. Для идентификации компонентов гумусовых кислот раствор подвергали кислотному гидролизу путем термостатирования при температуре 85 оС в течение 56—60 ч с последующим извлечением продуктов гидролиза препарата хлороформом. Хроматографический анализ элюентов показал преобладание жирных кислот и их производных, общее содержание которых составляет 45.73%. Полученные результаты расширяют перечень дескрипторов молекулярно-группового состава и могут быть использованы в целях идентификации гумусовых кислот пелоидов.
Ключевые слова: гумусовые кислоты; количественные характеристики; компоненты гидро-лизата; низкоминерализованные иловые сульфидные грязи; пелоиды; ИК-спектроскопия; хроматография.
The work is meant to the define the quantitative characteristics of humic acids in peloids necessary for the development of methods for their standardization. The work presents an extraction method for receiving humic acids from low-mineralized silt sulphide mud with a degree of mineralization of 10.2 ± 0.5 % wt. Quantitative criteria for assigning a substance to humic acids of peloids were obtained by statistical processing of the results of IR spectroscopy of 15 samples of the substance. To identify the components of humic acids, the solution was subjected to acid hydrolysis by thermostating at a temperature of 85 0C for 56—60 hours, followed by extraction of the hydrolysis products of the preparation with chloroform. Chromatographic analysis of eluents showed the predominance of fatty acids and their derivatives, the total content of which is 45.73%. The obtained results expand the list of descriptors of molecular-group composition and can be used to identify humic acids in peloids.
Key words: chromatography; humic acids; hydrolyzate components; low-mineralized silt sulphide mud; peloids; quantitative characteristics; IR spectroscopy.
Дата поступления 10.07.20
В настоящее время гуминовые вещества привлекают пристальное внимание мирового научного сообщества. Детально изучены гуминовые и фульвовые кислоты почв, природных вод, торфов, для которых установлено не только большое количество физико-химических параметров, но и положительные эффекты воздействия на живые системы 1-5. В последние годы возрос научный интерес к гумино-вым веществам лечебных грязей (пелоидов), среди которых наиболее изучены сапропели 6 и высокоминерализованные иловые сульфидные грязи 7. Однако, анализу низкоминерализованных иловых сульфидных грязей, для которых, как и для сапропелевых, характерно высокое содержание гуминовых веществ, но, в отличие от последних, сформированных в восстановительных условиях, посвящено как в отечественной, так и в зарубежной литературе небольшое количество публикаций.
Особый интерес для исследования представляет суммарная композиция гуминовых, гиматомелановых и фульвовых кислот — гумусовые кислоты (ГСК), включающая все кинетически подвижные компоненты гуминовых веществ. Специфические органические вещества пелоидов характеризуются высоким хела-тирующим потенциалом, определяющим их роль как сталкера экотоксикантов 8. Уникальная способность связывать значительное количество субстратов позволяет рассматривать гу-миновые пелоидопрепараты как средства природного происхождения для вывода из организма липопротеидов высокой плотности и, следовательно, использовать их для профилактики сердечно-сосудистых заболеваний 9' 10. Особенности строения ГСК определяют неспецифическую фармакологическую активность как нативных пелоидов, так и преформирован-ных пелоидопрепаратов. В работах 11-13 описано адаптогенное, регенеративное, антитоксическое, иммунотропное действие гуминовых кислот различного происхождения.
Вероятностный характер организации макромолекул ГСК, их гетерогенность, гетеро-функциональность и полимолекулярность создают существенные препятствия для применения гуминовых пелоидопрепаратов в медицин-14 15
ской практике .
В связи с этим актуальной является разработка способов стандартизации гумусовых пе-лоидопрепаратов, что позволит вывести на отечественный фармацевтический рынок высокоэффективные препараты природного происхождения.
Целью работы является определение количественных характеристик гумусовых кислот пелоидов по данным их спектрального и хроматографического анализа.
Материалы и методы исследования
Объектом исследования явилась группа гумусовых кислот пелоидов, полученная из низкоминерализованных иловых сульфидных грязей озера Молочка (Самарская область) по следующей методике: образец нативной грязи трижды обрабатывали 2.0 M раствором HCl, осадок отмывали водой до отрицательной реакции на хлорид-ионы, растворяли в 0.5 M растворе NaOH и после фильтрования пропускали через катионит КУ-2. Полученный раствор высушивали при комнатной температуре и сухое вещество, зольность которого составляла 15±2.5 % мас., растворяли в минимальном объеме 0.01M раствора NaOH. После отделения не растворившейся части образца раствор повторно пропускали через катионит КУ-2 и высушивали, после чего зольность препарата составляла 10.2±0.5 % мас. Воздушно-сухой образец растворяли в минимальном объеме 0.002М раствора NOH и доводили водой до получения 1.0%-ного раствора ГСК.
ИК-спектры твердых образцов были получены на ИК-Фурье спектрофотометре Spektrum 100 фирмы Perkin Elmer. Образцы готовили прессованием таблеток с KBr. УФ-спектры растворов субстанции получены с использованием прибора СФ-56 в диапазоне 200800 нм с толщиной кюветы 10 мм.
Для определения природы компонентов ГСК раствор с концентрацией 1.0% мас. подвергали кислотному гидролизу. В круглодон-ную колбу с обратным холодильником помещали 10—15 мл 1.0%-ного раствора ГСК, добавляли 5.0 мл 2M раствора HCl и термостати-ровали при 85 0С в течение 56—60 ч. Осадок отделяли фильтрованием и полученный раствор троекратно обрабатывали 3—5 мл хлороформа. Полученные элюенты объединяли и высушивали на воздухе при комнатной температуре, после чего растворяли в 100 мл гекса-на. Для анализа полученного образца использовали метод газовой хроматографии с масс-селективным детектированием (ГХ-МС). ГХ-МС проводили на хроматографе Agilent Technologies 5975 с масс-селективным детектором MSD 7890. Хроматографическое разделение компонентов пробы проводили на кварцевой капиллярной колонке (HP-5MS 30 м х 250
мм x 0.25 мм) в течение 40 мин. В качестве газа носителя использовали гелий с постоянной скоростью потока 1.0 мл/мин; объем пробы — 1 мкл; ввод пробы осуществлялся без деления потока. Температурная программа колонки: 50 °С — 5 мин, нагрев до 110 °С со скоростью 5 °С/мин, нагрев до 240 оС — 10 оС/мин, изотерма при 240 оС 10 мин. Масс-детектирование осуществляли в режиме электронного удара — 70 эВ в диапазоне масс с 50—400 m/z.
Запись и первичную обработку хроматог-раммы проводили с помощью программного обеспечения «ChemStation E. 02.02.1431». После проведения хроматографирования масс-спектры, соответствующие вершинам хрома-тографических пиков, сравнивали по стандартной методике с масс-спектрами библиотек NIST 08 и Wiley 10th Edition 2013 г. Масс-спектр исследуемого образца считали идентифицированным при совпадении с библиотечным масс-спектром (RIref) при значении коэффициента подобия, превышающем 90% и совпадением с известным индексом удерживания Ковача (±0.5%). Относительное содержание компонентов (%) в исследуемой фракции рассчитывали на основании площади хроматогра-фических пиков без учета корректирующих коэффициентов (метод нормализации).
Для получения статистически оправданных характеристик препарата по известной методике были выделены 15 образцов ГСК,
для которых рассчитывали отношение интен-сивностей полос поглощения (Avt/v2, где v и v2 — частоты пиков в см-1) характеристических пиков с воспроизводимыми частотами поглощения при 1709±1, 1614±3, 3423±5 и 1247±7 см-1. Результаты спектральных исследований обработаны Soft Statistica.
Результаты и обсуждение
ИК- спектры всех полученных образцов имели схожий вид. На рис. 1 приведен спектр поглощения ГСК пелоидов, который характеризуется профилем, типичным для этого класса соединений. В области 3600—3400 см-1 широкая частично структурированная полоса, вызванная валентными колебаниями гидро-ксильных групп, имеет на плече в интервале 2800—3000 см-1 серию полос, отвечающих колебаниям метильных и метиленовых групп.
Налагающиеся полосы малого разрешения с максимумами 766 см-1 и 1400 см-1 также доказывают наличие в молекуле алифатических фрагментов. Максимум высокой интенсивности с частотой 1709 см-1 детерминирован валентными колебаниями свободных карбоксильных групп, присутствие которых проявляется также в форме мало разрешаемых пиков в области 1400 см-1. Интенсивный максимум с частотой 1614 см-1 обусловлен колебаниями связанной карбонильной группы в карбокси-
69,0
cm-1
Рис. 1. ИК-спектр гумусовых кислот пелоидов
лат-ионе и, вероятно, кратными связями в ароматических фрагментах молекулярной структуры. Следует отметить, что полоса поглощения с частотой 1614 см-1 на 7% интенсивнее, чем пик с частотой 1709 см-1, хотя в спектрах гуминовых кислот пелоидов интенсивность пиков прямо противоположная и доминирующим по интенсивности является пик свободных карбоксильных групп с частотой положения 1710 см-1 (11).
Интервал частот 1300—1000 см-1 спектра ГСК характеризуется многопрофильной широкой полосой поглощения, соответствующей колебаниям связей углерод-кислород фрагментов спиртовой и алкоксильной природы. Полосы низкой интенсивности в диапазоне 900—700 см-1 с частотами 766 и 618 см-1, представляет собой результат деформационных колебаний СН2-групп.
Электронные спектры выделенных образцов ГСК типично выглядят как пологая кривая с постепенным уменьшением оптической плотности по мере увеличения длины волны (рис. 2). В коротковолновой области спектра на кривой присутствует плечо в области 250—270 нм, которое, по-видимому, отражает сопряжение в системе оксополиеновых структур. Отношение оптических плотностей при 400 и 600 нм находится в интервале 2.4—2.6, что соответствует значению коэффициента цветности веществ гуминовой природы.
Таблица 1
Значения отношений относительных интенсивностей полос ИК спектров ГСК
Рис. 2. Электронный спектр гумусовых кислот
Результаты полученных значений отношений относительных интенсивностей полос А1615/1710, А3420/1615, А3420/1710 и А1240/1615 приведены в табл. 1, а в табл. 2 указаны значения отношений после статистической обработки данных 15 спектров ГСК.
№ образца ГСК А1615/1710 А342 0/1615 А34 20/1710 А1240/1615
1 1.03 0.96 0.93 0.85
2 1.11 0.91 0.96 0.88
3 1.02 0.93 1.05 0.96
4 1.08 0.89 0.97 0.91
5 1.06 0.90 0.99 0.90
6 1.13 0.94 1.03 0.95
7 1.11 0.87 0.98 0.92
8 1.05 0.92 1.01 0.86
9 1.06 0.88 0.94 0.87
10 1.04 0.89 0.96 0.91
11 1.08 0.93 0.99 0.89
12 1.05 0.97 1.02 0.86
13 1.06 0.90 1.04 0.92
14 1.12 0.96 1.00 0.93
15 1.05 0.95 0.98 0.89
Таблица 2
Отношение оптических плотностей полос ИК-спектров ГСК после статистической обработки
А А1615/1710 А3420/1615 А34 20/1710 А1240/1615
ГСК 1.07 ±0.03 0.92±0.03 0.99±0.04 0.90±0.03
Полученные результаты указывают на существенные отличия между значениями отношений оптических плотностей выбранных полос (табл. 2).
Интерпретация результатов ИК-спектро-скопии коррелирует с составом элюента гидро-лизата субстанции ГСК в хлороформе. Хрома-тограмма продуктов кислотного гидролиза приведена на рис. 3, а в табл. 4 приведен качественный состав смеси с относительным содержанием компонентов.
Анализ методом ГХ/МС хлороформного извлечения гидролизата позволил выявить 30 идентифицированых компонентов. Основными составляющими экстракта являются глицерин, молочная кислота и стеариновая кислоты. Полученные данные свидетельствуют о наличии в гидролизате значительного количества таких насыщенных и ненасыщенных жирных кислот, как миристиновая, азелаиновая, пальмитиновая, транс-9-октадеценовая, цис-11-ок-тадеценовая. Кроме жирных спиртов (гексаде-канол, октадеканол, 2-октилдодеканол) и стероидных спиртов (^-ситостерол) в гидролизате обнаружена парафиновая фракция (от тетра-декана до гептакозана). Установлено также наличие углеводорода тритерпенового ряда группы каротиноидов — сквалана, а также жи-роподобных витаминов типа тетрадецилмирис-тата и гексадецилпальмитата.
Рис. 3. Хроматограмма хлороформного экстракта продуктов гидролиза ГСК
Таблица 4
Список компонентов хлороформного элюента гидролизата ГСК пелоидов
№ Компонент Время удерживания, мин Относительное содержание, %
1 О-молочная кислота 5.96 6.58
2 Каприловая кислота 6.09 3.19
3 Этилбутаноат 6.38 2.74
4 Мочевина 8.96 1.55
5 Глицерин 9.58 13.14
6 Пел аргоновая кислота 10.88 4.34
7 2-этокси фенол 11.04 1.52
8 Фталевая кислота 16.06 2.23
9 Тетрадекан 16.90 1.51
10 Ванилиновая кислота 17.00 0.34
11 Аз ел аи новая кислота 17.38 1.02
12 Бутилфталат 17.79 2.84
13 Миристиновая кислота 17.99 3.14
14 Бис(2-метилпропил) фталат 18.33 3.34
15 Пентадекановая кислота 19.23 5.51
16 Гексадеканол 19.39 5.27
17 Пальмитоолеиновая кислота 20.12 1.04
18 Пальмитиновая кислота 20.41 2.73
19 Октадеканол 21.66 2.62
20 2-октилдодеканол 21.97 4.34
21 транс-9-Октадеце новая кислота 22.36 4.65
22 цис-11-Октадеценовая кислота 22.42 4.65
23 Стеариновая кислота 22.63 6.74
24 Дегидроабиетиновая кислота 24.31 2.49
25 1-монопальмитин 26.19 2.37
26 Сквалан 28.31 2.30
27 Тетрадецилмиристат 29.46 2.50
28 Гексадецилпальмитат 33.50 2.07
29 ?-ситостерол 33.59 1.48
30 Сте ари лп ал ьмитат 36.74 1.78
Относительное содержание насыщенных жирных кислот составляет 26.67%, ненасыщенных — 10.34%, эфиров жирных кислот -8.72%. Общее содержание жирных кислот и их производных составляло 45.73%. В гидролиза-те представлены такие соединения ароматического характера, как ванилиновая кислота, фта-левая кислота и ее производные, общее содержание которых достигает 10.27%. Доля фракции жирных спиртов в составе элюента достигает 12.23%. Наличие в составе гидроли-зата мочевины в количестве 1.55% мас. можно рассматривать как результат деструкции N-со-держащих гетероциклов.
Литература
1. Бузлама A.B., Чернов Ю.Н. Анализ фармакологических свойств, механизмов действия и перспектив применения гуминовых веществ в медицине // Экспериментальная и клиническая фармакология.— 2010.— Т.73, №9.— С.43-48.
2. Попов А.И., Зеленков В.Н., Теплякова Т.В. Биологическая активность и биохимия гумино-вых веществ. Часть 2. Медико-биологический аспект (обзор литературы) // Вестник РАЕН.— 2016.- Т.16, №5.- С.9-15.
3. Савченко И. А., Корнеева И.Н., Лукша Е.А., Пасечник К.К. Биологическая активность гуми-новых веществ: перспективы и проблемы их применения в медицине // Журнал МедиАль.-2019.- №1.- С.54-60.
4. Макаренко Н.В., Зайцева Е.Н., Дубищев А.В., Андриянов Д.А. Исследование острой токсичности и диуретической активности металлопро-изводных гуминовых, фульвовых и гумусовых кислот// Известия Самарского научного центра Российской академии наук.- 2015.- Т. 17, №5(3).- С.925-929.
5. Черепанов И. С., Крюкова П. С. Продукты карбонизации в системе D-глюкоза-л-аминобензой-ная кислота: синтез и характеристика // Баш. хим. ж.- 2019.- Т.26, №2.- С.40-44.
6. Осницкий Е.М., Сартаков М.П., Комиссаров И.Д. Исследование гуминовых кислот торфов и сапропелей Обь-Иртышского междуречья // Аг-роЭкоИнфо.- 2020.- №1. http://agroecoinfo. narod. ru/journal/STATYI/2020/1/ st_103. pdf.
7. Войнова В.И., Брынцева И. А., Самотруева М.А., Цибизова А.А. Перспективы применения сульфидно-иловой грязи Астраханской области в качестве противовоспалительного средства // Международный журнал экспериментального образования.- 2015.- №12(ч. 4).- С.535-537.
8. Корельская Т.А., Румянцева Т.И. Строение гумусовых кислот как функция выполнения ими экоп-ротекторной роли в отношении тяжелых металлов // Journal of Siberian Federal University. Chemistry 1.- 2014.- №7.- С.139-150.
9. Рубаненко О.А., Кириченко Н.А., Фатенков О.В. Коррекция нарушений липидного обмена и системы гемостаза у пациентов высокого рис-
Результаты исследования подтвердили общепринятую модель строения веществ гумино-вой природы, как супрамолекулярного ансамбля, состоящего из конденсированной структуры ароматического типа, боковые заместители которого имеют углеводородную природу преимущественно кислотного и гидроксильного типа. Полученные спектральные данные являются конституционными характеристиками гумусовых кислот сульфидных низкоминерализованных пелоидов. Рассчитанные значения относительных интенсивностей полос ИК-спектров субстанции дополняют перечень дискриптеров мо-лекулярно-группового уровня и могут быть использованы в целях идентификации препарата.
References
1. Buzlama A.V., Chernov Yu.N. Analiz farmakologicheskikh svoistv, mekhanizmov deistviya i perspektiv primeneniya guminovykh veshhestv v meditsine [Analysis of pharmacological properties, mechanisms of action and prospects for the use of humic substances in medicine]. Eksperimental'naya i klinicheskaya farmakologiya [Experimental and Clinical Pharmacology], 2010,vol.73, no.9, pp.43-48.
2. Popov A.I., Zelenkov V.N., Teplyakova T.V. Biologicheskaya aktivnost' i biokhimiya guminovykh veshhestv. Chast' 2. Mediko-biologicheskiy aspekt (obzor literatury) [Biological activity and biochemistry of humic substances. Part 2. Biomedical aspect (literature review)]. Vestnik RAEN [Bulletin of the Russian Academy of Natural Sciences], 2016, vol.16, no.5, pp.9-15.
3. Savchenko I.A., Korneeva I.N., Luksha E.A., Pasechnik K.K. Biologicheskaya aktivnost' guminovykh veshhestv: perspektivy i problemy ikh primeneniya v meditsine [Biological activity of humic substances: prospects and problems of their application in medicine]. Zhurnal MediAl', 2019, no. 1, pp.54-60.
4. Makarenko N.V., Zaitseva E.N., Dubishhev A.V., Andriyanov D.A. Issledovanie ostroy toksichnosti i diureticheskoy aktivnosti metalloproizvodnykh guminovykh, ful'vovykh i gumusovykh kislot [Study of acute toxicity and diuretic activity of metal derivatives of humic, fulvic and humic acids]. Izvestiya Samarskogo nauchnogo centra Rossiyskoy akademii nauk [Bulletin of the Samara Scientific Center of the Russian Academy of Sciences], 2015, vol.17, no.5(3), pp.925-929.
5. Cherepanov I. S., Krjukova P. S. Produkty karbonizatsii v sisteme D-gljukoza-m-aminobenzoinaya kislota: sintez i kharakteristika [Carbonization products in the D-glucose-m-aminobenzoic acid system: synthesis and characteristics]. Bashkirskii khimicheskii zhurnal [Bashkir Chemical Journal], 2019, vol.26, no.2, pp.40-44.
6. Osnitskiy E.M., Sartakov M.P., Komissarov I.D. Issledovanie guminovykh kislot torfov i sapropeley Ob'-Irtyshskogo mezhdurech'ya
ка смерти от сердечно-сосудистых заболеваний // Наука и инновации в медицине.— 2016.— №1.- С.41-45.
10. Shikalgar T. S., Naikwade N. S. Evaluation of cardioprotective activity of fulvic acid against isoproterenol induced oxidative damage in rat myocardium // International Research Journal of Pharmacy.- 2018.- V.9, №1.- Pp.71-80. doi: 10.7897/2230-8407.09111.
11. Поволоцкая Ю.С. Адаптогенные свойства гуми-новых препаратов // Международный журнал гуманитарных и естественных наук.- 2019.-№3-1.- С.128-130.
12. Якименко О.С., Терехова В.А. Гуминовые препараты и оценка их биологической активности для целей сертификации / Почвоведение.-2011.- №11.- С.1334-1343.
13. Аввакумова Н.П. Биохимические аспекты терапевтической эффективности гумусовых кислот лечебных грязей.- Самара: ГП «Перспектива», 2002.- С.124.
14. Лиштван И.И., Капуцкий Ф.Н., Абрамец А.М., Янута Ю.Г., Монич Г.С., Алейникова В.Н., Глухова Н.С. Фракционирование гуминовых кислот как метод получения стандартизованных гуминовых материалов // Вестник БГУ. Серия 2: Химия. Биология. География.- 2012.- №2.-С.7-11.
15. Панкратова К.Г., Щелоков В.И., Сазонов Ю.Г. Обзор современных методов исследования гу-миновых кислот // Плодородие.- 2005.- №4 (25).- С.19-24.
[Study of humic acids of peat and sapropel of the Ob-Irtysh interfluve]. AgroJeko-Info, 2020, no.1. http://agroecoinfo.narod.ru/journal/STATYI/ 2020/1/st_103.pdf.
7. Voinova V.I., Bryntseva I.A., Samotrueva M.A., Tsibizova A.A. Perspektivy primeneniya sul'fidno-ilovoy gryazi Astrakhanskoy oblasti v kachestve protivovospalitel'nogo sredstva [Prospects for the use of sulfide-silt mud of the Astrakhan region as an anti-inflammatory agent] Mezhdunarodnyy zhurnal eksperimental'nogo obrazovaniya [International Journal of Experimental Education], 2015, no.12(part 4), pp.535-537.
8. Korel'skaya T.A., Rumyantseva T.I. Stroyeniye gumusovykh kislot kak funktsiya vypolneniya imi ekoprotektornoy roli v otnoshenii tyazhelykh metallov [The structure of humic acids as a function of their ecoprotective role in relation to heavy metals]. Journal of Siberian Federal University. Chemistry 1, 2014, no.7, pp.139-150.
9. Rubanenko O.A., Kirichenko N.A., Fatenkov O.V. Korrektsiya narusheniy lipidnogo obmena i sistemy gemostaza u patsiyentov vysokogo riska smerti ot serdechno-sosudistykh zabolevaniy [Correction of lipid metabolism and hemostasis system disorders in patients with high risk of death from cardiovascular diseases]. Nauka i innovatsii v meditsine [Science and innovations in medicine], 2016, no.1, pp.41-45.
10. Shikalgar T. S., Naikwade N. S. [Evaluation of cardioprotective activity of fulvic acid against isoproterenol induced oxidative damage in rat myocardium]. International Research Journal of Pharmacy, 2018, vol.9, no.1, pp.71-80. doi: 10.7897/2230-8407.09111.
11. Povolockaya Yu.S. Adaptogennyye svoystva guminovykh preparatov [Adaptogenic properties of humic preparations]. Mezhdunarodnyy zhurnal gumanitarnykh i yestestvennykh nauk [ International Journal of Humanities and Natural Sciences], 2019, no.3-1, pp.128-130.
12. Yakimenko O.S., Terekhova V.A. Guminovyye preparaty i otsenka ikh biologicheskoy aktivnosti dlya tseley sertifikatsii [Humic preparations and assessment of their biological activity for certification purposes]. Pochvovedeniye [Soil Science], 2011, no.11, pp.1334-1343.
13. Avvakumova N.P. Biokhimicheskiye aspekty terapevticheskoy effektivnosti gumusovykh kislot lechebnykh gryazey [Biochemical aspects of the therapeutic efficacy of humic acids in therapeutic mud]. Samara, Perspektiva Publ., 2002, p.124.
14. Lishtvan I.I., Kaputskiy F.N., Abramets A.M., Yanuta Yu.G., Monich G.S., Aleynikova V.N., Glukhova N.S. Fraktsionirovaniye guminovykh kislot kak metod polucheniya standartizovannykh guminovykh materialov [Fractionation of humic acids as a method of obtaining standardized humic materials]. Vestnik BGU. Seriya 2: Khimiya. Biologiya. Geografiya [Bulletin of BSU. Series 2: Chemistry. Biology. Geography], 2012, no.2, pp.7-11.
15. Pankratova K.G., Shchelokov V.I., Sazonov Yu.G. Obzor sovremennykh metodov issledovaniya guminovykh kislot [Review of modern research methods of humic acids]. Plodorodiye [Fertility], 2005, no.4 (25), pp.19-24.
