CC BY
129
Методические рекомендации
РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ВЫЯВЛЕНИЮ ПРИРОДНЫХ ОЧАГОВ ПИРОПЛАЗМОЗОВ ЖИВОТНЫХ
П.И. ХРИСТИАНОВСКИЙ доктор биологических наук И.В. БЫСТРОВ
Оренбургский государственный аграрный университет В.В. БЕЛИМЕНКО кандидат биологических наук
Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко
(Одобрены секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии 24 февраля 2008 г., протокол № 1)
Иксодовые клещи, питаясь кровью животных и человека, являются переносчиками возбудителей многих трансмиссивных инфекционных и инвазионных болезней. Иксодиды фауны России относятся к шести родам: Ixodes (прицепыш), Dermacentor (кожерез), Rhipicephalus (веероголов), Haemaphysa-lis (кровосос), Hyalomma (стеклоглаз), Boophilus (быколюб). Каждый род включает несколько видов [4].
Иксодовые клещи очень устойчивы к неблагоприятным факторам внешней среды. Они способны перезимовывать, переносить затопление мест их обитания в течение 12 сут. В голодном состоянии самки иксодовых клещей могут жить до 7 лет. Кроме того, они очень плодовиты. Самка клеща способна отложить до 5 тыс. яиц.
Чрезвычайно важной является способность клещей передавать возбудителей болезней следующим поколениям трансовариально. Вследствие этого участки местности, населенные инвазированными клещами, остаются опасными на десятилетия и представляют собой природные очаги болезней. Кроме того, клещи способны к миграциям, в результате чего они постепенно заселяют новые территории, формируя в них новые природные очаги заболеваний.
Пироплазмидозы - группа природноочаговых трансмиссивных болезней животных. В России пироплазмидозы распространены повсеместно и поражают многие виды домашних и диких животных. В местах широкого распространения пироплазмидозов развитие высокопродуктивного животноводства сопряжено со значительными трудностями. Высокопродуктивные племенные животные при заражении пироплазмидами в большинстве случаев погибают, а переболевшие резко снижают продуктивность [3, 5, 7].
Для успешной борьбы с трансмиссивными болезнями необходимо знать закономерности формирования природных очагов этих болезней и уметь выявлять эти очаги на местности. Это позволит разработать и применить эффективные мероприятия по их ликвидации, привязанные к конкретным услови-
109
ям. Кроме того, изучение этих очагов может служить достаточно эффективным способом профилактики трансмиссивных болезней, т. к. в этом случае происходит разрыв эпизоотологической цепи «паразит - переносчик - хозяин».
Целью данной работы является разработка методики выявления природных очагов пироплазмидозов животных для оценки эпизоотической ситуации по этим заболеваниям в отдельных регионах.
Методы сбора иксодовых клещей. Клещи могут находиться в естественных и гостальных биотопах. К первым относят пастбища, места водопоя и выгула животных, ко вторым - гнезда птиц, норы, логовища наземных позвоночных, помещения для домашних животных, различные хозяйственные постройки. Иксодовых клещей можно собирать как непосредственно на местности в их природных биотопах, так и с животных.
Для сбора клещей в природе используют следующие приспособления: волокушу, флажок, полотенце Первомайского, пропашник Померанцева и Сердюковой, экран Померанцева [3].
Особенности биологического цикла Piroplasma caballi. Известно, что для пироплазмидозов животных характерна природная очаговость особого типа, когда пироплазмы передаются из поколения в поколение клещей тран-совариально. Поэтому иксодовые клещи и их яйца являются основным резер-вентом пироплазм в природе [1, 2, 6]. Следовательно, биологический цикл пироплазм, в т. ч. их способность к трансовариальной передаче в клещах, существенно воздействует на эпизоотологию заболевания.
Жизненный цикл пироплазм состоит из двух частей: развитие в организме млекопитающего и развитие в организме переносчика - иксодового клеща. Наиболее демонстративным примером, в котором четко просматриваются все стадии развития пироплазм, является цикл развития P. caballi - возбудителя пироплазмоза лошадей.
В мазках крови животных отмечают различные одиночные формы возбудителя - трофозоиты: круглые (11,4 %), овальные (25,2 %), амебовидные (13,1 %), кольцевидные (19,3 %), грушевидные (12,3 %); а также парные грушевидные формы - мерозоиты (18,7 %). Интенсивность инвазии (ИИ) колеблется от 18 до 55 пораженных эритроцитов в 100 полях зрения. Следовательно, на этой стадии цикла развития пироплазм наблюдают размножение путем простого деления [6, 9, 10, 11].
При исследовании мазков из различных органов клещей в слюнных железах обнаруживают шизонты различной степени зрелости, диаметром 4-18 мкм с 12-25 ядрышками. У самок обнаруживают одиночные булавовидные формы (спорозоиты) размером 8-10 х 2-3 мкм, с хорошо выраженным ядром и 1-2 крупными вакуолями. В целом ИИ слюнных желез пироплазмами весьма значительная (от 1-2 до 10-12 экз. в 1 поле зрения).
В среднем отделе кишечника наблюдают шизонты и одиночные булавовидные формы (кинеты) в значительно меньшем количестве, чем в слюнных железах [6, 10].
Через 10-12 сут после прохождения гонотрофического цикла все самки приступают к яйцекладке. Яйца откладываются порциями в течение 12-14 сут. Зараженными оказываются все яйца, причем зараженность яиц пироплазмами в первые трое суток кладки выше, чем в последующие [9-14].
Развитие личинок в яйцах длится 18-25 сут. В первые 12-36 ч инкубации в мазках при увеличении х 900 обнаруживают очень мелкие круглые клетки паразита диаметром 0,6-1 мкм. В дальнейшем (до 6-14 сут) находят средние и крупные одиночные пироплазмы, причем наблюдают значительный полиморфизм (табл. 1). Обнаружено и описано 11 видов одиночных форм, среди которых преобладают веретеновидные и булавовидные (74,0 и 9,8 % соответственно от общего количества паразитов; размеры их 10-12 х 2-4 мкм).
Таблица 1
Полиморфизм Р. еаЪаШ в яйцах иксодид в зависимости
Дни инкубации Формы развития P. caballi, %
веретеновидная булаво видная грушевидная круглая пальцевидная пиявкообразная звездчатая треугольная полулунная инфузория жгутиковые шизонты
2 73,7 4,6 3,5 5,6 1,5 4,5 0,5 0,5 5,1 0,5
3 72,5 4,1 5,7 1,6 4,8 0,8 0,8 6,5 3,2 0,5
5 70,0 16,3 1,3 0,5 1,6 2,0 6,3 1,3 0,7
6 70,5 11,3 1,3 2,1 1,8 2,1 9,0 0,6 0,8
7 74,9 18,1 1,2 5,0 0,8
8 65,4 19,2 13,0 1,5 0,9
10 73,0 7,9 3,2 6,9 4,8 1,0
12 86,0 13,2 0,8
13 72,2 21,8 5,2 0,8
14 99,5 0,5
16 + + +
17 + +
18 +
Примечание . + единичные экземпляры.
Количество одиночных форм составляет 3-97 экз. в 100 полях зрения. Отмечено 2 пика инвазии яиц одиночными формами пироплазм - большой, приходящийся на 3-5-е сутки инкубации, и малый, приходящийся на 10-е сутки инкубации. Следует отметить, что малый пик интенсивности наблюдался не во всех кладках яиц. В процессе инкубирования в яйцах обнаруживают шизонты в виде плотных гранулированных шаров размерами 12-15 мкм
111
с числом ядер до 200. Количество их подвержено определенной периодичности - единичные шизонты появляются с первых суток инкубации, максимум обнаруживается на 6-14-е сутки, затем их количество вновь уменьшается. Зафиксирован также процесс распада шизонтов.
С 10-12-х суток инкубации одиночные формы пироплазм становятся мелкими (2-4 х 0,5-1 мкм). В последние 3-8 сут инкубации в исследуемом материале не обнаруживают ни одиночные формы пироплазм, ни шизонты. В это время в яичной массе уже хорошо просматриваются органы будущей личинки клеща. По-видимому, в этот период пироплазмы уже находятся в органах личинки и не прокрашиваются по методике Романовского-Гимза.
В пределах 1-5-х суток инкубации наблюдают жгутиковые формы паразита. В дальнейшем их в мазках не обнаруживают. Наличие этих форм позволяет предположить существование полового процесса у пироплазм на этой стадии развития.
Следовательно, в процессе шизогонии осуществляется переход пироплазм от крупных форм к мелким, что позволяет им проникать в клетки личинки клеща. В результате осуществляется циркуляция паразита в клещах и поддерживается стойкое неблагополучие территории по пироплазмозу.
Обнаружение пироплазм в организме иксодовых клещей. Выявление пироплазм в организме голодных клещей, собранных с местности, сопряжено со значительными трудностями. Более результативно обнаружение пироплазм в организме напитавшихся клещей. Однако, можно использовать и голодных клещей, но их предварительно кормят в течение 3-4 сут на кроликах [3]. В организме иксодид наибольшее количество паразитов обнаруживают в слюнных железах. Однако, пироплазмы также могут быть обнаружены в гемолимфе, субкутикулярном слое, кишечнике и яичниках. В слюнных железах пироплазмы начинают появляться на 4-е сутки питания клеща [2-8]. Следовательно, для обнаружения возбудителей нужно снять напитавшегося клеща с животного, отпрепарировать органы, сделать из них мазок на предметном стекле и окрасить его по Романовскому. Для достоверности результатов исследований рекомендуется вскрыть не менее 10-15 клещей.
Для выполнения этой работы необходимы следующие инструменты: остроконечные глазные ножницы, пинцеты с максимально узкими браншами, препаровальные иглы, булавки, залитая парафином чашка Петри с углублением посередине, чистые обезжиренные предметные стекла, стеклянные палочки, шпатели.
Предварительно клеща обмывают дистиллированной водой или проводят через 96%-ный спирт, обсушивают фильтровальной бумагой, затем зажимают головной конец его тела (спинкой кверху) между последними фалангами большого и указательного пальцев руки и приступают к вскрытию, одновременно готовят микроскопические препараты.
Сначала по методу Абрамова [1] делают мазки из гемолимфы клеща. Для этого отрезают маленькими остроконечными ножницами одну или две конечности у основания и выступившую на культе каплю гемолимфы наносят на обезжиренное предметное стекло, распределяют ее по нему тонким равномерным слоем, высушивают, фиксируют метанолом или смесью Никифорова, а затем красят. В гемолимфе присутствуют преимущественно пироплазмы булавовидной формы [8]. Затем ножницами отсекают задний край
брюшка. В образовавшееся небольшое отверстие вводят ветвь ножниц и разрезают ими хитиновый покров вдоль правого и левого боков, доводя разрез до основания хоботка. После этого переносят клеща в физиологический раствор, налитый в чашку Петри, дно которой заполнено растопленным парафином, прикалывают его булавками и приступают к удалению спинного хитинового покрова и препарированию слюнных желез и яичника клеща. Манипуляции желательно производить под контролем лупы (например, МБС-4). Тонким пинцетом захватывают задний край спинного хитина, осторожно оттягивают его вверх, освобождая при этом внутреннюю поверхность от прикрепленных к ней пучков мышц, а затем отсекают его у основания хоботка и удаляют. Одновременно ветвью пинцета делают соскоб субкутикулярного слоя спинного хитина и наносят тонким слоем на предметное стекло. Затем захватывают пинцетом ветви кишечника, имеющего вид темных, извитых, различной толщины трубок. Освобождают его при помощи препаровальных игл от трахеи и жирового тела, отводят в сторону и обнажают слюнные железы, расположенные по бокам в передней части тела, и находящийся в задней половине тела яичник, имеющий форму толстого тяжа, густо покрытого яйцевыми фолликулами. Слюнные железы и яичник переносят пинцетом на отдельные предметные стекла, раздавливают препаровальной иглой или шпателем до однородной массы и распределяют тонким слоем, высушивают в течение 1-2 ч при комнатной температуре, фиксируют и красят рабочим раствором краски Романовского-Гимза в течение 30-40 мин. Затем краску осторожно смывают водой, а мазок высушивают.
Микроскопию мазков проводят в иммерсионной системе при увеличении х 630. Необходимо просматривать не менее 200 полей зрения. В мазках удается обнаружить одиночные округлые (2-2,5 мкм), грушевидные (2,5-3,5 мкм), булавовидные (8-10 мкм) формы. Цитоплазма имеет серо-голубой цвет, ядро - красный (при удачном окрашивании). Обнаруживают также шизонты - многоядерные клетки, одна из стадий развития пироплазм. Они имеют вид шаров, состоящих из множества красных ядер. Кроме краски Романовского, возможна окраска по Нохту и Папенгейму.
Пироплазмы следует отличать в препарате от различных по величине и форме ядер и оболочек разрушенных клеток слюнных желез, окрашивающихся в лилово-красный или красный цвет, и от капелек секрета желтовато-розового или темно-серого цвета.
Обнаружение пироплазм в яйцах клещей. Особенность биологии иксо-дид состоит в том, что во время питания кровью самцы копулируют с самками. Самки питаются до 4-6 сут, после чего покидают организм хозяина и откладывают яйца в различные складки и трещины почвы. Яйцекладка длится до месяца, после чего самка погибает. Во внешней среде в яйцах развиваются личинки. Процесс развития личинки в яйце (инкубирование) длится 18-25 сут.
Известно, что пироплазмы, попавшие с кровью в организм самки клеща, проникают в яичник самки и в формирующиеся яйца. В отложенном яйце пироплазмы переходят в личинку, из нее в нимфу и далее в имаго (трансова-риальная передача). Этот процесс повторяется в течение многих поколений, даже при питании клещей на неспецифических хозяевах.
Воспроизвести процесс яйцекладки и инкубирования яиц in vitro несложно. Для этого с животных нужно снять напившуюся самку клеща (а именно самки при питании кровью увеличиваются многократно) и поместить
ее в чашку Петри на фильтровальную бумагу, закрыв крышкой. Чашку держать при температуре 20-22 оС, бумагу через 48 ч увлажнять водой.
Обычно через 10-12 сут после прохождения гонотрофического цикла самки приступают к яйцекладке. Она происходит порциями и длится 12-14 сут. Нашими исследованиями выявлено, что яйца первых 3-5 сут кладки наиболее богаты пироплазмами. Именно из них нужно готовить мазки.
Особенность развития пироплазм в яйцах такова, что в первые 12-36 ча инкубации яиц пироплазм очень трудно обнаружить, т. к. в этот период они имеют очень мелкие размеры (0,6-1,0 мкм). Начиная с 3-4-х суток инкубации, в зараженных яйцах обнаруживают различные формы пироплазм, больше всего веретеновидные и булавовидные размером 10-12 мкм. При окрашивании по Романовскому-Гимза цитоплазма клеток возбудителя приобретает голубоватый или серый цвет (иногда бесцветная), ядро - красный. В этот период обнаруживают и шизонты в виде шаров из красных ядер размером 1215 мкм. Иногда удается зафиксировать процесс распада шизонтов.
Техника приготовления мазков из яиц клещей. Методика предложена А.А. Цапруном [13] и состоит в следующем. На кончике скальпеля небольшую часть яичной массы переносят из чашки Петри на предметное стекло, добавляют каплю физраствора, растирают стеклянной палочкой и высушивают на воздухе. Затем мазок фиксируют этиловым спиртом до высыхания и окрашивают рабочим раствором краски Романовского-Гимза в течение 30-40 мин. После смывания краски водой и высушивания мазок микроскопируют в иммерсионной системе при увеличении х 630 [13,14].
Обнаружение одиночных форм пироплазм и шизонтов свидетельствует о циркуляции возбудителя в клещах данной местности и является признаком ее неблагополучия по пироплазмозу.
Заключение. Методика позволяет с достаточной степенью достоверности выявлять очаги пироплазмидозов животных на всех этапах жизненного цикла паразитов (как в клещах-переносчиках и их яйцах, так и у теплокровных животных). Эта методика может служить одним из объективных критериев оценки благополучия местности по пироплазмидозам при эпизоотологиче-ских обследованиях.
На основании этой оценки составляются текущие и перспективные планы профилактических мероприятий по пироплазмидозам животных.
Литература
1. Абрамов И.В. // Тр. ВИЭВ. - 1957. - Т. 21. - С. 241-245.
2. Абрамов И.В, Дьяконов Л.П. // Бюл. ВИЭВ. - 1974. - Т. 18. - С. 10-14.
3. Агринский Н.И. Насекомые и клещи, вредящие сельскохозяйственным животным. - М.: Сельхозиздат, 1962. - 288 с.
4. Ганиев И.М., Аливердиев А.А. Атлас иксодоидных клещей. - М.: Колос, 1968. - 80 с.
5. Дьяконов Л.П. // Тр. ВИЭВ. - 1970. - Т. 38. - С. 27-35.
6. КарташевМ.В. // Тр. ВИЭВ. - 1957. - Т. 21. - С. 210-220.
7. Крылов М.В. Пироплазмиды (фауна, систематика, эволюция). - Л.: Наука, 1981. - 229 с.
8. Марков А.А., Абрамов И.В. // Tp. ВИЭВ. - 1970. - Т. 38. - С. 5-14.
9. Христиановский П.И., Быстрое И.В. // Вестн. ветеринарии. - 2002. -№ 24. - С. 27-28.
10. Христиановский П.И., Быстрое И.В. // Вестн. ветеринарии: Науч. труды Академии ветеринарной медицины. - Оренбург, 2002. - С. 229-236.
11. Христиановский П.И. // Тр. Всерос. ин-та гельминтол. - 2005. - Т. 41. - С. 377-385.
12. Христиановский П.И. Клинико-биологические аспекты и эпизоото-логическая характеристика пироплазмоза животных различных видов на Южном Урале: Дис. ... докт. биол. наук. - Оренбург, 2005. - 230 с.
13. Цапрун А.А. О формах развития Piroplasma caballi в клеще Derma-centor: Дис. ... канд. вет. наук. - М., 1940. - 110 с.
14. Цапрун А.А. // Тр. ВИЭВ. - 1957. - Т. 21. - С. 221-240.
