РЕКОМБИНАНТНЫЙ ГОНАДОТРОПИН ДЛЯ ИНДУКЦИИ СУПЕРОВУЛЯЦИИ У КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ (ОБЗОР) Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ И КЛЕТОЧНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ

УДК 636.2:612.433.62:57.089.38:591.39

РЕКОМБИНАНТНЫЙ ГОНАДОТРОПИН ДЛЯ ИНДУКЦИИ СУПЕРОВУЛЯЦИИ У КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ (обзор)

Бурсаков С.А., Ковальчук С.Н., Попов Д.В., Косовский Г.Ю.

Центр экспериментальной эмбриологии и репродуктивных биотехнологий, Москва, Российская Федерация

Важным звеном технологии трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота является гормональная стимуляция суперовуляции у коров-доноров, которая базируется на применении фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) для обеспечения роста и синхронного созревания множественных фолликул. Для получения биологически полноценных эмбрионов необходимо добиться выполнения всех необходимых условий, но к настоящему времени еще не сформирована унифицированная форма производства и применения ФСГ. Разнообразие методов получения рекомбинантного ФСГ для целей животноводства значительно увеличилось за последние 30 лет, однако до сих пор не удалось разработать общий стандарт, который бы соответствовал существующим требованиям для включения его на постоянной основе в протокол по индукции суперовуляции у коров и получению ожидаемого количества эмбрионов в расчете на одного животного-донора. Наибольший успех возможен при производстве рекомбинантного ФСГ (рФСГ), гомогенного по составу и близкого к своему натуральному аналогу, но обладающего новыми характеристиками для увеличения биологической эффективности и экономической рентабельности. Расходы на приобретение гонадотропинов имеют первостепенное значение, поскольку являются самой затратной частью при выполнении эм-бриотрансплантаций. Использование рФСГ может повысить экономическую эффективность эмбриотрансплантаций и прогнозируемость получения ооцитов, пригодных для оплодотворения. Кроме того, использование препарата нового поколения позволит уменьшить побочные эффекты при его интенсивном применении для отобранных высокопродуктивных коров-доноров. В обзоре приведены систематизированные данные по существующим экспрессион-ным системам для получения рФСГ и примеры молекулярного моделирования с использованием технологий белковой инженерии для создания высокоэффективных форм гормона с заданными свойствами.

Ключевые слова: крупный рогатый скот, рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон, гликозилирование, генно-инженерные методы, трансплантация эмбрионов

Проблемы биологии продуктивных животных, 2016, 3: 5-23

Введение

Одной из важнейших задач высокоэффективного и рентабельного животноводства является разработка системы воспроизводства высокоценного племенного материала с помощью трансплантации эмбрионов. Важным звеном в трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота является гормональная стимуляция суперовуляции у коров-доноров.

Метод индукции суперовуляции включает правильный подбор концентрации, вида и способа применения высокоэффективного гормонального препарата с пролонгированным эффектом действия, выбор отзывчивого на экзогенный гормон донора, аппликация препарата в рассчитанное время или синхронизация его применения с физиологическими характеристиками животного. Благодаря разработке схемы гормональной индукции суперовуляции, возмож-

но получать от одной коровы несколько десятков яйцеклеток, которые далее оплодотворяются искусственным путем.

Для индукции суперовуляции у крупного рогатого скота наибольшее значение имеет фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), отвечающий за формирование, развитие и правильное функционирование половых органов. ФСГ не имеет половой специфичности и влияет на все репродуктивные процессы. У женских особей он стимулирует созревание и рост фолликул, образование фолликулярной жидкости, способствует повышению концентрации эстрогенов в организме животных, регулирует созревание яйцеклеток.

Первоначально ФСГ для ветеринарного использования получали путем экстракции и очистки препаратов гормона из нативного материала (гипофиза). Поскольку сложно выделить и очистить в достаточном количестве ФСГ из гипофиза животных, в течение последних десятилетий предрпринимаются попытки получать в необходимом количестве безопасные и эффективные препараты ФСГ биосинтетическим путем (Hesser et al., 2011; Cahoreau et al., 2015; Szkudlinski, 2015). Накопленный к настоящему времени опыт свидетельствует о том, что достижение этой цели возможно с помощью молекулярно-биологических методов с использованием модельных организмов, способных синтезировать высокоэффективный рекомбинантный модифицированный (рФСГ) аналог ФСГ естественного происхождения с заданными свойствами, отличающийся высокой степенью чистоты, гомогенности и повышенной биологической активностью, в сравнении с наиболее хорошо очищенными препаратами ФСГ гипофиза. Последнее обстоятельство является несомненным преимуществом для его примененияДля индукции суперовуляции крупного рогатого скота наибольшее значение имеет фолликулостиму-лирующий гормон (ФСГ), отвечающий за формирование, развитие и правильное функционирование половых органов. ФСГ не имеет половой специфичности и влияет на все репродуктивные процессы. У женских особей стимулирует созревание и рост фолликул, образование фолликулярной жидкости и при совместном действии с лютеинизирующим гормоном способствует повышению концентрации эстрогенов в организме животных, регулирует созревание яйцеклеток.

Цель настоящей работы — обзор современных данных по исследованиям и разработкам в области производства эффективных рекомбинантных аналогов ФСГ.

Молекулярная структура ФСГ и его посттрансляционная модификация

ФСГ — гетеродимерный гликопротеиновый гормон, продуцируемый и секретируемый в кровоток аденогипофизом. Белок входит в группу гонадотропных гормонов, включающую также лютеинезирующий гормон (ЛГ), плацентарный хорионический гонадотропин (ХГ), проявляющий ЛГ-подобную активность и тиреотропный гормон (ТТГ). ФСГ состоит из двух субъединиц, являющихся продуктами двух разных генов — а (14 кДа) и ß (17 кДа), некова-лентно связывающихся после трансляции. Сравнение аминокислотных последовательностей субъединиц ФСГ позвоночных животных показывает, что они высоко консервативны. а субъединица ФСГ млекопитающих является общей для всех гормонов этой группы, а ß-субъединица специфична для каждого гормона, она в основном определяет его связывание с рецепторами и биологическую активность (Pierce, Parsons, 1981).

Первичная аминокислотная последовательность каждой субъединицы включает сигнальную последовательность (рис. 1), которая впоследствии удаляется во время процессинга и секреции белка (Pierce, Parsons, 1981). Обогащенность аминокислотных последовательностей а- и ß-субъединиц остатками цистеина (10 и 12 остатков соответственно) играет важную роль во внутримолекулярных взаимодействиях для осуществления их правильного фолдинга и поддержания структуры. Несмотря на присутствие в а- и ß-субъединицах ФСГ соответственно 5 и 6 внутримолекулярных дисульфидных связей (рис. 1, 2) при отсутствии видимого гидрофобного ядра, каждая субъединица имеет исключительно высокое значение отношения поверхности к объему (Jiang et al., 2014).

Лимитирующей стадией в биосинтезе гонадотропина ФСГ является сборка а- и ß-субъединиц в эндоплазматическом ретикулуме в функциональный гетеродимер (Garcia-Campayo et al., 1997). Формирование гетеродимера за счет прочных гидрофобных связей является необходимым условием для проявления полной биологической активности. Однако даже при оптимальных условиях димеризации субъединиц, только около 25% субъединиц собираются надлежащим образом (Bedows, et al., 1992, Ruddon et al., 1996). Несмотря на то, что а- и ß-субъединицы существуют и функционируют, главным образом, как гетеродимеры, было показано на примере ХГЧ, что индивидуальные цепи а- и ß-субъединиц встречаются и отдельно друг от друга, и они были выделены (Cole et al., 2006; Iles et al., 2010).

Обе субъединицы синтезируются в одних и тех же клетках передней доли гипофиза, после чего подвергаются первичному N-гликозилированию по аспарагиновым остаткам в эндоплазматическом ретикулуме (для Bos taurus Asn56 и Asn82 в а-субъединице и Asn7 и Asn24 в ß- субъединице, рис. 1, 2). Далее гликозилированные а- и ß-субъединицы, связанные неко-валентными связями в форме димера, секретируются в межклеточное пространство. Следует отметить, что гликаны ФСГ являются существенными структурными компонентами, составляющими до 30% его суммарной массы (Fox et al., 2001; Dias et al., 2001). Несмотря на их значительную долю в структуре, следует учитывать, что связывание с рецептором представляет собой в значительной мере белок-белковое взаимодействие, и гликаны, по всей видимости, играют другую функцию. Примером этому может служить более сильный насыщающий эффект связывания с рецептором ФСГ, показанный на ß-субъединице с одним или двумя удаленными центрами N-гликозилирования в ФСГ человека (Davis, et al., 2014).

а-субъединица

MDYYRKYAAVILTILSLFLQILHSFPDGEFTMQGCPECKLKENKY FSKPDAAIYQC MGCCFS RAYPT PARS KKTMLVPKNIT SEATCCVAKAFTKATVMGNVRVENHTECHC STCYYHKS

Г

-f

п

1

nenT^qXioCX2CXi7CX2CCXigNX6CCXi7NX3CXCX2CX5

ß-субъединица

MKSVQFCFLFCCWRAICCRSCELTNITITVEKEECGFCISINTTWCAGYCYTRDLVY RDPARPNIQKTCTFKELVY ETVKVPGCAHHADSLYTY PVAT ECHCSKCDSDSTDCTV RGLGPSYCSFREIKE

I-il I H

nen^X2CX3NXgCX2CX3NX3CX3CXisCXi4CXi5CXCX2CX6CXgCX

Рис. 1. Аминокислотная последовательность а- и ß-субъединиц ФСГ Bos taurus. Подчеркнуты сигнальные пептиды, отделяемые во время посттрансляционного процессинга, а также остатки аспарагина (а-субъединица -Asn56 и Asn82 и ß-субъединица -Asn7 и Asn24), принимающие участие в гликозилировании. Над каждым сиквенсом показаны внутрисубъединичные дисуль-фидные связи.

Олигосахариды, добавленные посттрансляционно, определяют значительное количество функциональных свойств гормона. Гликозилирование играет большую роль в а/ß сборке субъединиц и облегчении надлежащего фолдинга белка, образования третичной и четвертичной структуры белка. Кроме того, включение гликанов в различной конфигурации обеспечивает суммарный отрицательный заряд белка (Green, Baenziger 1988; Ulloa-Aguirre, Timossi, 1998), увеличивает растворимость и стабильность белка и облегчает формирование дисуль-фидных связей (Rose et al., 2000), а также защищает ядро структуры белка от протеаз в крово-

ß-субъединица

токе млекопитающих, что пролонгирует его нахождение в организме (Morell et al., 1971; Sinclair, Elliott 2005), уменьшая скорость его биодеградации (Ulloa-Aguirre et al., 1995; D'Antonio et al., 1999; Perlman et al., 2003) и, в конечном итоге, отражается на биологической активности (Shental-Bechor, Levy 2009). Предполагается, что эти структуры влияют на аффинность ФСГ к рецептору и эффективность внутриклеточной передачи сигнала (Ulloa-Aguirre et al., 1999).

Вторичные модификации углеводных цепей включают образование разветвленных структур на основе сиаловых кислот, причем различные формы и степень сиалирования обусловливают наличие ряда гликоформ, создавая микрогетерогенность гормона (Fares, 1992). Видоспецифические различия в типах и количествах сиалированных олигосахаридов типично для ФСГ, а их распределение значительно различается, указывая на то, что их синтез регулируем (Baenziger, Green, 1988).

Характерной особенностью ФСГ является большое разнообразие изоформ, отличающихся друг от друга по структуре посттрансляционно присоединенных к ним олигосахаридов (Ulloa-Aguirre et al., 2003). Следствием таких модификаций во время биосинтеза может служить возникновение порядка ~20 изоформ ФСГ, продуцируемых в условиях in vivo, в зависимости от фазы эстрального цикла, а также от возраста и количества родов у животного (Stanton et al., 1993; D'Antonio et al., 1999; Gibreel, Bhattacharya, 2010). Хотя физиологическая важность гетерогенности ФСГ еще не до конца выяснена, присутствие большого разнообразия изоформ объяснимо, возможно, их неодинаковыми эффекторными функциями и скоростями биодеградации (Ulloa-Aguirre, 1999).

Структурные отличия между изофор-мами ФСГ касаются распределения гликанов по отдельным сайтам гликозилирования, гетерогенности разветвленных углеводных структур (комбинации би-, три- и тетра-разветвленных гликанов), разного количества терминальных остатков сиаловой кислоты (Dalpathado et al., 2006). Сиалированные оли-госахариды присутствующие в ФСГ, структурно гетерогенны и в Bos taurus их относительное процентное распределение имеет соотношение 32:12:55:1 для нейтральных, суль-фатированных, сиалированных и сульфатиро-ванно-сиалированных аспарагин-связанных олигосахаридов соответственно (Baenziger, Green, 1988). Важность сиаловых кислот хорошо видна на примере структурной гетерогенности ФСГ человека, обусловленной примерно на 95% отрицательно заряженными терминальными остатками сиаловых кислот (Baenziger, Green, 1988; Stockel, Renwick, 1992). Другие модификации включают фуко-зилирование, включение "бисектного" N-ацетилглюкозамина и N-ацетилгексозамина, частичное или полное сиалирование, сиали-рование с образованием а-2,3 и а-2,6 связей, и замещение галактозы сульфатированным га-лактозамином (Dalpathado et al., 2006).

а-субъединица

Рис. 2. Фолликулостимулирующий гормон человека (pdb: 1FL7 (Fox, et al., 2001). Длинными палочками обозначены внутримолекулярные дисуль-фидные связи а- и fí- субъединиц, представленных в виде лент; углеводы представлены в виде шариков, соединённых короткими палочками.

Биологические особенности гликоформ ФСГ с разной структурой углеводных цепей, возможно, связаны с активацией разных эффекторных и сигнальных путей в активации метаболических путей, необходимых для развития фолликул и созревания ооцитов (Babu et al., 2000, 2001; Jiang et al., 2014). Оказывая разнообразные действия на протяжении всего цикла фолликулогенеза, изменения в составе изоформ могут осуществлять тонкую настройку реакции яичников на ФСГ стимулирование (Ulloa-Aguirre, et al., 2003). Таким образом, сложный и динамичный комплекс гликозилирования ФСГ может, вероятно, являться основой тонкой регуляции взаимодействий различных метаболических путей в процессе созревания ооцита.

Экспрессионные системы для получения рФСГ

Для получения рекомбинантных белков были разработаны различные экспрессионные системы — бактериальные, дрожжевые, на основе мицеллиарных грибов, клеток насекомых и млекопитающих, трансгенные животные и растения. В зависимости от поставленных задач и лимитирований, характерных для каждой из систем, вероятно, возможно подобрать оптимальный вариант для получения конкретного белка с заданными характеристиками. Выбор экс-прессионной системы зависит от таких факторов, как уровень экспрессии, посттрансляционные модификации, стоимость производства, доступность генетических систем и других (см. табл.).

Попытки добиться экспрессии рФСГ предпринимались в разных организмах, способных к производству гетерологических белков — в бактериях E. coli (Samaddar et al., 1999; Wilson et al., 2008), грибах Hansenula polymorpha (Qian et al., 2009) и Pichia pastoris (Samaddar et al., 1997; Ribela et al., 2003; Huo et al., 2007; Hesser, 2011), бакуловирус-инфицированных клетках насекомых (Delahaye et al., 1996; Kato et al., 1998; Inaba et al., 1998; van de Wiel et al., 1998; Fox et al., 2001), клетках простейшего клеточного слизевика диктиостелиум (Dictyostelium discoideum) (Linskens et al., 1999), в растениях табака (Dirnberger et al., 2001), в молочной железе трансгенных мышей (Greenberg et al., 1991) и кроликов (Galet et al., 2001; Coulibaly et al., 2002).

Экспрессионные системы для получения рекомбинантных белков

Экспрес- Ско- Про- Посттрансляционные модификации Доступ- Возмож- Затраты

сионная рость дук- ность гене- ность на среды

система роста тив- Гликозилиро- Образование Протеоли- тических масшта-

ность вание дисульфид- тический систем бирова-

ных связей процессинг/ ния

фолдинг

белка

Прокариоты

Бактерии очень очень отличное от отсутствует нет/ очень хо- очень очень

быстрая высо- млекопитаю- недостаточ- рошая хорошая низкие

кая щих ный

Эукариоты

Дрожжи быстрая высо- простое; воз- хорошее слабый хорошая очень низкие

кая можно гиперг- /удовлетво- хорошая

ликози- рительный

лирование

Ь средняя сред- аналогично хорошее слабый/ хо- удовлетво- хорошая средние

tarentolae няя млекопитаю- роший рительная

щим

Клетки медлен- высо- отличное от хорошее есть/очень удовлетво- удовлетво высокие

насеко- ная кая млекопитаю- хороший рительная -

мых щих рительная

Клетки медлен- низкая отличное от хорошее есть/очень хорошая хорошая высокие

растений ная млекопитаю- хороший

щих

Клетки медлен- низкая присутствует хорошее есть/очень удовлетво- удовлет- высокие

млеко- ная хороший рительная во-

питающих рительная

Лимитирующим фактором бактериального производства рФСГ является неспособность многих бактерий осуществлять посттрансляционные модификации, свойственные системам млекопитающих, необходимые для правильной конформации белковой молекулы (см. табл.). В настоящее время установлено, что бактерии могут осуществлять как N- так и O-гликозилирование (Nothaft, Szymanski, 2010). Однако перенос гликозилирующей бактериальной системы Campylobacter jejuni, например в E. coli, является далеко не простым условием для воспроизводства гликозилированых белков млекопитающих (Sodoyer, 2004: Nothaft, Szy-manski, 2010). Так, бактериальные системы требуют наличия расширенной последовательности для связывания N-гликозилирующего сайта (Asp или Glu в позиции -2 (Asp/Glu-Xj-Asn-X2-Ser/Thr, где Xi и X2 представляют любую аминокислоту за исключением Pro), чем это нужно для эукарот и архей (Asn-X-Ser/Thr мотив (где X представляет любую аминокислоту за исключением Pro) (Kowarik et al., 2006). Отсюда вытекают определенные требования, предъявляемые к экспрессионной системе для биосинтеза рФСГ, что делает затруднительным использование прокариот для биосинтеза таких молекул животного происхождения.

Эукариотические системы способны осуществлять пострансляционный процессинг вновь синтезированных рекомбинантных белков, аналогичный найденному у млекопитающих - отщеплять сигнальный пептид, осуществлять гликозилирование и формирование дисуль-фидных связей во время фолдинга функционального белка. Сравнительный анализ преимуществ и недостатков разных экспрессионных систем проведен в обзорах (Fernandez, Vega 2013; Wang et al., 2013).

Наиболее распространенным методом получения рекомбинантного аналога ФСГ для большинства видов животных является гетерологическая экспрессия в линии клеток яичника млекопитающего - китайского хомячка (Chinese hamster ovary, СНО), способных к естественной посттрансляционной модификации новосинтезируемых белков, легко трансфицируемых инородной ДНК и успешно пролиферирующих в культуральных условиях (Looney et al., 19SS; Wilson et al., 1993). Эти клетки могут секретировать гормон в культуральную среду, из которой он очищается и анализируется на активность. Несмотря на способность культуры клеток линии СНО производить белки, почти идентичные молекулам доноров - прототипов генетической конструкции, их недостатком является использование при культивировании фетальной бычьей сыворотки (ФБС), которая потенциально может содержать вещества, являющиеся источниками болезней (например, губчатой энцефалопатии), проявление симптомов которых растягивается иногда на годы (Balen, 2002). В отсутствие ФБС, клетки СНО не развиваются должным образом, что делает получение адекватного количества рекомбинантных белков затруднительным и дорогостоящим.

Использование других систем в качестве клеток-хозяев могло бы обеспечить более безопасный вариант производства рФСГ по сравнению с линией клеток СНО, однако они не осуществляют аналогичного гликозилирования, а в некоторых случаях приводят к получению гипергликозилированных белков, что может сказываться на биологической активности ФСГ (Porro et al., 2005). Из множества других исследованных методов производства биологически активного рФСГ ни один не имел превосходства над получением его с применением клеток СНО. Поэтому, несмотря на такие недостатки, как низкий выход белка и необходимость использования ФБС, метод получения рФСГ с помощью экспрессионной системы на основе клеточной культуры СНО остается на сегодняшний день востребованным как наиболее адекватный для получения белков других видов млекопитающих с желательной биологической активностью.

Перспективную в отношении биосинтеза рФСГ альтернативную систему экспрессии представляет эукариотическая экспрессионная система на основе Leishmania tarentolae - паразитического простейшего, выделенного из мавританского геккона Tarentola mauritanica. Данная экспрессионная система позволяет получать гликозилированный белок, близкий к синтезируемому у млекопитающих и одновременно гомогенный по составу сахаров (Breitling et al., 2002; Niimi, 2012). Посттрансляционные модификации в L. tarentolae и метаболический путь

гликозилирования, характерный для L. tarentolae, гораздо ближе к таковому у млекопитающих, чем у дрожжей и клеток насекомых. Гликозилирование в клетках L. tarentolae является исключительно гомогенным, с биантенными N-гликанами и Man3GlcNAc2 структурой ядра. N-гликаны полностью галактозилированы, не содержат остатков сиаловой кислоты, для их ядра характерен а-1,6 тип фукозилирования. К недостаткам данной экспрессионной системы относится относительно повышенная затратность ее культивирования, хотя оно намного проще, чем культивирование клеток млекопитающих. Генно-инженерные работы с L. tarentolae могут способствовать получению мультиантенного типа гликозилирования и сиалирования (Belen et al., 2000).

Молекулярное моделирование и создание "дизайнерских" гонадотропинов

с улучшенными свойствами

Как следует из предыдущего изложения, создание эффективного аналога не может, и в принципе, не обязательно должно полностью дублировать природный ФСГ, представляющий собой сложную смесь изомеров по углеводным цепям. Одновременное присутствие до 20 изомеров гормона, а также дополнительное количество его свободных субъединиц, усложняют и без того непростую картину фолликулогенеза для успеха в индукции суперовуляции при использовании экзогенного ФСГ. В зависимости от поставленных целей, следует, вероятно, стремиться к получению аналога природного ФСГ с измененными и улучшенными функциональными свойствами с применением наиболее оптимального метода его биосинтеза. Поэтому с момента производства первого рФСГ и до настоящего времени ведётся разработка все новых суперэффективных аналогов с более длительным периодом полужизни, чтобы избавиться от необходимости проведения ежедневных инъекций для индукции овуляции.

Определение кристаллической структуры гонадотропинов стало большим шагом вперед в понимании структурно-функциональных характеристик ФСГ. К настоящему времени в банке данных белков (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do) депонировано 5 структур ФСГ человека: 4MQW (Jiang et al., 2014); 4AY9 (Jiang et al., 2012); 3G04 (Sanders et al., 2007); 1XWD (Fan et al., 2005); 1FL7 (Fox et al., 2001). Известно, что структуры белков более консервативны, чем их аминокислотные последовательности, поэтому, несмотря на то, что пока отсутствуют кристаллографические структуры ФСГ быка, высокий уровень гомологии аминокислотных последовательностей ФСГ крупного рогатого скота и человека позволяет использовать 3-D структуру последнего в качестве модели для создания аналога ФСГ крупного рогатого скота и изучения особенностей его взаимодействий с рецептором, агонистами и ингибиторами. В этом плане неоценимый вклад в повышение биологической эффективности аналогов дает молекулярное моделирование, устанавливающее направленность и целесообразность видоизменений ФСГ с использованием доступных генно-инженерных и химических методов модификаций, направленных на специфическое его изменение с целью улучшения требуемых свойств. При этом большое значение имеют участки молекулы ФСГ, особо значимые для проявления его биологической активности или физико-химических свойств, влияющих, например, на улучшение растворимости белка и уменьшение скорости его биодеградации.

До настоящего времени преобразование рФСГ молекулярно-биотехнологическими методами заключалось в следующем: ковалентное сшивание через линкер субъединиц а и в в один комлекс; изменение аминокислотной последовательности с заменой нейтральных аминокислотных остатков на положительно заряженные лизин или аргинин; создание дополнительных центров гликозилирования путем введения дополнительных аминокислот, содержащих до четырех дополнительных сайтов N- или О-гликозилирования в а-субъединицу или линкер; создание комплексов рФСГ с другими белками, а также введение различных видоспе-цифичных в-субъединиц в одну белковую конструкцию с целью создания гонадотропинов двойного действия, способных связываться и активировать разные рецепторы гонадотропи-нов; модификацию олигосахаридов для увеличения биологической активности in vivo благо-

даря увеличению времени полужизни препарата в плазме за счет уменьшения скорости биодеградации.

Первоначально рФСГ производился в виде двух отдельных субъединиц, олигомери-зуемых после синтеза (Kaetzel et al., 1985; Keene et al., 1989). Позже субъединицы ковалентно соединили вместе в одну конструкцию, что быстро стало одним из стандартных методов производства, поскольку требует меньшего количества этапов синтеза и очистки (Olijve et al., 1996; D'Antonio et al., 1999; Garcia-Campayo, Boime, 2001b). При этом конструкции для биосинтеза одноцепочечного ФСГ задаются таким образом, что С-терминальная часть р-субъединицы через линкер стыкуется с N-терминальной частью а-субъединицы. Синтез одно-цепочечных гонадотропинов минует стадию димеризации, что повышает эффективность производства в условиях in vitro. Свойства линкеров и необходимые требования к ним рассмотрены в ряде обзоров и отдельных статей (Weenen et al., 2004; Chichili et al., 2013; Chen et al., 2013).

С использованием генно-инженерной технологии, позволяющей получать а- и р-субъединицы ФСГ в виде одной полипептидной цепи, были разработаны и более сложные химерные молекулы с двумя или более типами р-субъединиц, обладающие способностью связываться с несколькими рецепторами гонадотропинов. Примером такой конструкции служит белок, кодируемый генами а- и р-субъединиц хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) и р-субъединицы ФСГ, который проявляет in vitro связывающую способность к рецепторам ЛГ и ФСГ (Kanda et al., 1999; Garcia-Campayo, Boime, 2001a; Jablonka-Shariff et al., 2006), хотя и зависящую от ориентации р-субъединицы (Garcia-Campayo, Boime, 2001a).

У овец была индуцирована суперовуляция с использованием химерного одноцепочечного аналога с двойной активностью ЛГ и ФСГ (Lemke et al., 2008). Окончательный вес яичников опытной группы животных превысил контрольную в 8-10 раз. Производство такого аналога в чистом и свободном от патогенов виде, наряду с присущей ему двойной активностью и долгосрочной функциональностью, может сделать этот уникальный химерный препарат эффективной альтернативой натуральным гонадотропинам для индукции суперовуляции у крупного рогатого скота.

Введение в С-терминальный участок р-субъединицы ФСГ карбокси-терминального пептида (КТП) ХГЧ стало первой модификацией, продемонстрировавшей значительное увеличение времени полувыведения и биологического потенциала ФСГ (Fares et al., 1992). В отличие от ФСГ, ХГЧ имеет относительно большой период полужизни, отчасти благодаря наличию четырех олигосахаридных цепочек, присоединенных к остаткам серина путем О-гликозилирования и создающих большой по размерам гидрофильный С-концевой «хвост» молекулы. Синтезированный белок с такой конструкцией сохраняет биологическую активность ФСГ, при этом дольше оставаясь в плазме крови, значительно увеличивая активность гонадо-тропина в условиях in vivo за счет снижения скорости биодеградации (LaPolt et al., 1992 , Joshi et al., 1995). Время полувыведения этой гибридной молекулы (КТП-ФСГ) увеличилось в 2-3 раза, что обусловлено, в основном, дополнительным присутствием отрицательно заряженных остатков сиаловой кислоты в молекуле КТП, поскольку кислые остатки, как правило, уменьшают скорость клубочковой фильтрации крупных молекул в почках и обладают защитным эффектом в процессах их биодеградации в печени (Fares et al., 1992; D'Antonio et al., 1999; Fauser et al., 2009).

Однако время полужизни и биологический потенциал ФСГ могут быть также увеличены при введении дополнительных центров N-гликозилирования, которые оказались даже более эффективными, чем О-гликозилирование КТП (Weenen et al., 2004; Ruman et al., 2005). Это было продемонстировано при введении четырёх дополнительных центров (как наиболее эффективного в ряду от 0 до 4) N-гликозилирования в линкерную последовательность между С-терминалом р- и N-терминалом а-субъединиц (Ruman et al., 2005). Такого же эфекта удалось добиться при присоединении пептида с четырьмя центрами N-гликозилирования к N-терминалу а-цепи ФСГ (Perlman et al., 2003; Trousdale et al., 2009).

Дополнительное гликозилирование увеличивает присутствие отрицательно заряженных остатков сиаловой кислоты, что в свою очередь ведет к понижению изоэлектрической точки белка (pI) и в конечном итоге увеличивает время полужизни модифицированного ФСГ. Было показано, что время полужизни изоформ рФСГ с pI в границах от 3 до 5 было в 100-200 раз выше, чем у изоформ гормона с pI от 5,5 до 6,0 (Mulders et al., 1997).

Комбинируя структурно-функциональные домены в обеих субъединицах, группа исследователей (Grossmann, et al., 1998; Leitolf et al., 2000) в результате многолетних экспериментов на разных гонадотропинах апробировали свою стратегию структурных изменений в рФСГ, приводящих в конечном итоге к увеличению его биологической активности. Несмотря на высокий консерватизм аминокислотных последовательностей субъединиц ФСГ у ряда видов позвоночных, в различных участках все же наблюдается полиморфизм (Szkudlinski et al., 1996; Leitolf et al., 2000). Поэтому при разработке дизайна аналогов рФСГ учитываются отличия, выявленные у разных видов в домене, содержащем аминокислотные остатки в позициях от 11 по 21. Замены обнаруживаются в положительно заряженном кластере, развившемся у позвоночных и исчезнувшего у человекоподобных обезьян и у человека, по основным аминокислотам, лизину и аргинину в позициях 11, 13, 16 и 20, на треонин, глутамин, пролин и глу-тамин соответственно (Ruddon, 1996; Szkudlinski et al., 1996). Этот домен не участвует в меж-субъединичном контакте, но петля, образованная аминокислотными остатками в позициях 1623, принимает участие в связывании рецептора. Согласно этому наблюдению, была предложена замена основных аминокислот на нейтральные в этом районе, увеличивающая сродство и эффективность взаимодействия с рецептором (Szkudlinski et al., 1996; Szkudlinski, 2015). Предложенная уникальная позиция мутаций 13-20 а-субъединицы подтверждена позднее структурными исследованиями (Jiang et al., 2012; 2014). Замена в молекуле ФСГ нескольких нейтральных аминокислот и одного отрицательно заряженного аминокислотного остатка, образующих слабые водородные связи в комплексе гормон-рецептор, на положительно заряженный аргинин приводит к дополнительному электростатическому взаимодействию с отрицательно заряженными аспарагиновым и глутаминовым аминокислотными остатками в области петли рецептора ФСГ, не участвующими до этого в лиганд-рецепторном взаимодействии.

Важность этих аминокислотных остатков была продемонстрирована в опытах по минимизации связанных линкером (Ser-Gly)4 а- и ß-субъединиц ХГЧ за счет удаления суммарно 17 аминокислотных остатков и С-терминального участка ß субъединицы с его 4 сайтами О-гликозилирования (Heikoop et al., 1999). Замена четырех аминокислот на положительно заряженные Arg или Lys в позициях 13, 14, 16, 20 в а-субъединице практически полностью восстанавливает значительную долю утраченной биологической активности уменьшенного в размерах белка до уровня ХГЧ, не затронутого изменениями.

Комбинация перечисленных модификаций на основе присоединения неиммуногенного шестиаминокислотного пептида, несущего двойной центр О-гликозилирования, замены пяти аминокислотных остатков в белковой последовательности N-терминальной части на положительно заряженный аргинин приводит к синергическому эффекту изменения pI и в конечном итоге к пролонгированию действия бычьего рФСГ, а также к значительному увеличению (в 10-50 раз) его активности (http://www.trophogen.com/press/pressreleases/docs/ Trophogen%20 Pitch%20Deck_2016-02-01_BWMS.pdf). Новая формула суперактивного аналога (суперагони-ста) не уменьшает биологическую активность лиганда и не ингибирует аффинность лиганд-рецепторных взаимодействий, как делает большинство неогликозилирований и пегилирова-ний (физико - химическая модификация, достигаемая соединением нативной молекулы с молекулой полиэтиленгликоля (Roberts et al., 2002), а наоборот, увеличивает время полужизни и эффективность электростатического взаимодействия с рецептором и афинность к нему (Szkudlinski, 2015; http://www.trophogen.com/).

Удачная конструкция суперагониста гликопротеинового гормона была использована биотехнологической компанией Trophogen (Роквилле, штат Мэриленд USA) при производстве высокоэффективного аналога ФСГ крупного рогатого скота длительного действия для ин-

дукции суперовуляции у коров, превосходящего по своим свойствам природный аналог и полученные ранее другие белковые комплексы, в частности, по биологической активности. Новый препарат рФСГ, полученный с использованием линии клеток яичника китайского хомячка, имеет следующие преимущества: однократность обработки для индукции суперовуляции в отличие от стандартной четырехкратной, улучшенная эффективность и уменьшение произ-водственых затрат на дозу ФСГ в расчете на животное/цикл обработки, увеличение среднего прироста массы переносимых эмбрионов, уменьшение загруженности специализированного ветеринара и уменьшение общей вариабельности результатов (Rogan et al., 2009; Во, Mapletoft 2014; Szkudlinski, 2015; http://www.trophogen.com/).

Заключение

В обзоре проанализировано современное состояние исследований и разработок в области создания и модификации рекомбинантных препаратов ФСГ для индукции суперовуляции у продуктивных животных. Разнообразие методов получения рекомбинантного ФСГ для целей животноводства значительно увеличилось за последние 30 лет, однако до сих пор не удалось разработать общий стандарт, который бы соответствовал включению его на постоянной основе в протокол по индукции суперовуляции у коров для получения ожидаемого количества овуляций в расчете на одно животное. Как показывают многочисленные опыты, между рядом рекомбинантных форм ФСГ и гормоном, выделенным из нативных источников, отсутствуют различия в результативности и они могут быть приемлемы для практики индукции суперовуляции. Следует подчеркнуть, что в подавляющем большинстве случаев расходы на приобретение гонадотропинов имеют первостепенное значение, поскольку являются самой затратной частью при выполнении эмбриотрансплантаций. То есть использование рекомбинантного ФСГ может повысить экономическую эффективность эмбриотрансплантаций и про-гнозируемость получения ооцитов, пригодных для оплодотворения.

К преимуществам рФСГ относятся относительная простота его производства и применения, отсутствие необходимости привлечения биологического материала для его извлечения, доступность, высокая биологическая активность и гомогенность относительно нативного ФСГ, отсутствие загрязняющих примесей, которые могут вызвать иммунологическую реакцию, возможность получения желательных концентраций в получаемом материале и прогнозируемое содержание в них белка рФСГ. Кроме того, использование модифицированных форм рФСГ с повышенной активностью и сниженной скоростью биодеградации приводит к снижению требуемой дозы и укорачивает период стимуляции.

Указанные преимущества однозначно свидетельствуют в пользу рФСГ, поскольку примененение новейших высокоэффективных препаратов пролонгированного действия, позволяющих снизить необходимую дозировку, сможет компенсировать более высокие затраты на получение рекомбинантной формы ФСГ. Эти преимущества способствуют снижению затрат и облегчают широкое распространение эмбриотрансплантаций (Gabriel et al., 2010).

Совершенствование метода возможно путем поиска новых, несущих желательные системы гликозилирования, экспрессионных систем для получения безопасных, наиболее приближенных к нативному белку препаратов ФСГ, гомогенных по составу и экономически выгодных для менее сложного, но более дешевого производства. Однако еще остается много неясного в вопросе участия разных форм ФСГ в процессе фолликулогенеза. Только выяснение их вовлечения в регуляторные механизмы оогенеза позволит выйти на новый уровень создания необходимых гормональных препаратов, адресно и безопасно воздействующих на репродуктивную систему крупного рогатого скота.

Использование новейших биологически высокоэффективных рекомбинантных препаратов ФСГ с эффектом пролонгируемости должно стать приоритетным направлением с экономически обоснованным снижением затрат на всех этапах его применения и, самое главное, -позволяющим сделать качественный скачок в воспроизводстве животных с использованием технологии трансплантации эмбрионов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Babu P.S., Danilovich N., Sairam M.R. Hormone-induced receptor gene splicing: enhanced expression of the growth factor type I follicle-stimulating hormone receptor motif in the developing mouse ovary as a new paradigm in growth regulation // Endocrinology. - 2001. - Vol. 142. - No. 1. - P. 381-389.

2. Babu P.S., Krishnamurthy H., Chedrese P.J., Sairam M.R. Activation of extracellular-regulated kinase pathways in ovarian granulosa cells by the novel growth factor type 1 follicle-stimulating hormone receptor. Role in hormone signaling and cell proliferation // J. Biol. Chem. - 2000. - Vol. 275. - No. 36. - P. 2761527626.

3. Baenziger J.U., Green E.D. Pituitary glycoprotein hormone oligosaccharides: structure, synthesis and function of the asparagine-linked oligosaccharides on lutropin, follitropin and thyrotropin // Biochim. Biophys. Acta. - 1988. - Vol. 947. - No. 2. - P. 287-306.

4. Balen A. Is there a risk of prion disease after the administration of urinary-derived gonadotrophins? // Hum Reprod. - 2002. - Vol. 17. - No. 7. - P. 1676-1680.

5. Bedows E., Huth J.R., Ruddon R.W. Kinetics of folding and assembly of the human chorionic gonadotropin beta subunit in transfected Chinese hamster ovary cells // Biol. Chem. - 1992. - Vol. 267. - No. 13. - P. 8880-8886.

6. Belen Carrillo M., Gao W., Herrera M., Alroy J., Moore J.B., Beverley S.M., Pereira M.A. Heterologous expression of Trypanosoma cruzi trans-sialidase in Leishmania major enhances virulence // Infect Immun. - 2000. - Vol. 68. - No. 5. - P. 2728-2734.

7. Breitling R., Klingner S., Callewaert N., et al. Non-pathogenic trypanosomatid protozoa as a platform for protein research and production // Protein Expression and Purification. - 2002. - Vol. 25. - No. 2. - P. 209218.

8. Bo G.A., Mapletoft R.J. Historical perspectives and recent research on superovulation in cattle // Theriogenology. - 2014. - Vol. 81. - No. 1. - 38-48.

9. Cahoreau C., Klett D., Combarnous Y. Structure-function relationships of glycoprotein hormones and their subunits' ancestors // Frontiers in Endocrinology. - 2015. - Vol. 6. - No. 26. - P. 1-14.

10. Chen X., Zaro J.L., Shen W.C. Fusion protein linkers: property, design and functionality // Adv. Drug. Deliv. Rev. - 2013. - Vol. 65. - No. 10. - P. 1357-1369.

11. Chichili V.P.R., Kumar V., Sivaraman J. Linkers in the structural biology of protein-protein interactions // Protein Science. - 2013. - Vol. 22. - No. 2. - P. 153-167.

12. Cole L.A., Khanlian S.A., Muller C.Y., Giddings A., Kohorn E., Berkowitz R. Gestational trophoblastic diseases: 3. Human chorionic gonadotropin-free beta-subunit, a reliable marker of placental site trophoblastic tumors // Gynecol Oncol. - 2006. - Vol. 102. - No. 2. - P. 160-164.

13. Coulibaly S., Besenfelder U., Miller I., Zinovieva N., Lassnig C., Kotler T., Jameson J.L., Gemeiner M., Müller M., Brem G. Expression and characterization of functional recombinant bovine follicle-stimulating hormone (boFSHalpha/beta) produced in the milk of transgenic rabbits // Mol. Reprod. Dev. 2002. - Vol. 63. - No. 3. - P. 300-308.

14. Dalpathado D.S., Irungu J., Go E.P., Butnev V.Y., Norton K., Bousfield G.R., Desaire H. Comparative glycomics of the glycoprotein follicle stimulating hormone: glycopeptide analysis of isolates from two mammalian species // Biochemistry. - 2006. - Vol. 45. - No. 28. - P. 8665-8673.

15. D'Antonio M., Borrelli F., Datola A., Bucci R., Mascia M., Polletta P., Piscitelli D., Papoian R. Biological characterization of recombinant human follicle stimulating hormone isoforms // Hum Reprod. - 1999. -Vol. 14. - No. 5. - P. 1160-1167.

16. Davis J.S., Kumar T.R., May J.V, Bousfield G.R. Naturally occurring follicle-stimulating hormone glyco-sylation variants // J. Glycomics Lipidomics. - 2014. - Vol. 4. - No. 1. - P. e117.

17. Delahaye R., Berreur P., Salesse R., Counis R. Insect cells infected with a recombinant baculovirus express both O- and N-glycosylated forms of the rat glycoprotein hormone alpha-subunit // J. Mol. Endocrinol. -1996. - Vol. 16. - No. 2. - P. 141-149.

18. Dias J.A., Van Roey P. Structural biology of human follitropin and its receptor // Arch. Med. Res. 2001. -Vol. 32. - P. 510-519.

19. Dirnberger D., Steinkellner H., Abdennebi L., Remy J.J., van de Wiel D. Secretion of biologically active glycoforms of bovine follicle stimulating hormone in plants // Eur. J. Biochem. - 2001. - Vol. 268. - No. 16. - P. 4570-4579.

20. Fan Q.R., Hendrickson W.A. Structure of human follicle-stimulating hormone in complex with its receptor // Nature. - 2005. - Vol. 433. - No. 7023. - P. 269-277.

21. Fares F.A., Suganuma N., Nishimori K., LaPolt P.S., Hsueh A.J., Boime I. Design of a long-acting follitropin agonist by fusing the C-terminal sequence of the chorionic gonadotropin beta subunit to the follitropin beta subunit // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1992. - Vol. 89. - No. 10. - P. 4304-4308.

22. Fauser B.C., Mannaerts B.M., Devroey P., Leader A., Boime I., Baird D.T. Advances in recombinant DNA technology: corifollitropin alfa, a hybrid molecule with sustained follicle-stimulating activity and reduced injection frequency // Hum Reprod Update. - 2009. - Vol. 15. - No. 3. - P. 309-321.

23. Fernandez F.J., Vega M.C. Technologies to keep an eye on: alternative hosts for protein production in structural biology // Current Opin. Struct. Biol. - 2013. - Vol. 23. - No. 3. - P. 365-373.

24. Fox K.M., Dias J.A., Van Roey P. Three-dimensional structure of human follicle-stimulating hormone // Mol Endocrinol. - 2001. - Vol. 15. - No. 3. - P. 378-389.

25. Galet C., Le Bourhis C.M., Chopineau M. et al. Expression of a single betaalpha chain protein of equine LH/CG in milk of transgenic rabbits and its biological activity // Mol Cell Endocrinol. - 2001. - Vol. 174.

- No. 1-2. - P. 31-40.

26. Garcia-Campayo V., Boime I. Novel recombinant gonadotropins // Trends Endocrinol Metab. - 2001a -Vol. 12. - No. 2. - P. 72-77.

27. Garcia-Campayo V., Boime I. Independent activities of FSH and LH structurally confined in a single polypeptide: selective modification of the relative potencies of the hormones // Endocrinology. - 2001b. - 142.

- Vol. 12. - P. 5203-5211.

28. Garcia-Campayo V., Sato A., Hirsch B., Sugahara T., Muyan M., Hsueh A.J. , Boime I. Design of stable biologically active recombinant lutropin analogs // Nature Biotechnology. - 1997. - Vol. 15. - No. 7. - P. 663-667.

29. Gibreel A., Bhattacharya S. Recombinant follitropin alfa/lutropin alfa in fertility treatment // Biologics. -2010. - Vol. 4. - P. 5-17.

30. Green E.D., Baenziger J.U. Asparagine-linked oligosaccharides on lutropin, follitropin, and thyrotropin. II. Distributions of sulfated and sialylated oligosaccharides on bovine, ovine, and human pituitary glycoprotein hormones // J. Biol. Chem. - 1988. - Vol. 263. - No. 1. - P. 36-44.

31. Greenberg N.M., Anderson J.W., Hsueh A.J., Nishimori K., Reeves J.J., deAvila D.M., Ward D.N., Rosen J.M. Expression of biologically active heterodimeric bovine follicle-stimulating hormone in milk of transgenic mice // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1991. - Vol. 88. - No. 19. - P. 8327-8331.

32. Grossmann M., Leitolf H., Weintraub B.D., Szkudlinski M.W. A rational design strategy for protein hormone superagonists // Nat. Biotechnol. - 1998. - Vol. 16. - No. 9. - P. 871-875.

33. Heikoop J.C., Huisman-de Winkel B., Grootenhuis P.D. Towards minimized gonadotropins with full bioac-tivity // Eur. J. Biochem. - 1999. - Vol. 261. - 1. - 81-84.

34. Hesser M. A survey of heterologous expression systems for the production of bovine follicle stimulating hormone and luteinizing hormone // All Dissertations. - 2011. - Paper 692. - P. 1-140.

35. Hesser M.W., Morris J.C., Gibbons J.R. Advances in recombinant gonadotropin production for use in bovine superovulation // Reprod Dom Animal. - 2011. - Vol. 46. - P. 933-942.

36. Huo X., Liu Y., Wang X., Ouyang P., Niu Z., Shi Y., Qiu B. Co-expression of human protein disulfide isomerase (hPDI) enhances secretion of bovine follicle-stimulating hormone (bFSH) in Pichia pastoris // Protein Expr. Purif. - 2007. - Vol. 54. - No. 2. - P. 234-239.

37. Iles R.K., Delves P.J., Butler S.A. Does hCG or hCGp play a role in cancer cell biology? // Mol. Cell. Endocrinol. - 2010. - Vol. 329. - No. 1-2. - P. 62-70.

38. Inaba T, Mori J, Ohmura M, Tani H, Kato Y, Tomizawa K, Kato T, Ihara T, Sato I, Ueda S. Recombinant porcine follicle stimulating hormone produced in baculovirus-insect cells induces rat ovulation in vivo and gene expression of tissue plasminogen activator in vitro // Res. Vet. Sci. - 1998. - Vol. 64. - No. 1. - P. 25-29.

39. Jablonka-Sharif A., Kumar T.R., Eklund J., Comstock A., Boime I. Single-chain, triple-domain gonadotro-pin analogs with disulfide bond mutations in the alpha-subunit elicit dual follitropin and lutropin activities in vivo //Mol Endocrinol. - 2006. - Vol. 20. - No. 6. - P. 1437-1446.

40. Jiang X., Liu, H., Chen X., He X. evidence for follicle-stimulating hormone receptor as a functional trimer // J. Biol.Chem. - 2014. - Vol. 289. - No. 20. - P. 14273-14282.

41. Jiang X., Liu H., Chen X., He X. Structure of follicle-stimulating hormone in complex with the entire ectodomain of its receptor // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 2012. - Vol. 109. - No. 31. - P. 12491-12496.

42. Joshi L., Murata Y., Wondisford F.E., Szkudlinski M.W., Desai R., Weintraub B.D. Recombinant thyrotropin containing a beta-subunit chimera with the human chorionic gonadotropin-beta carboxy-terminus is biologically active, with a prolonged plasma half-life: role of carbohydrate in bioactivity and metabolic clearance // Endocrinology. - 1995. - Vol. 136. - No. 9. - P. 3839-3848.

43. Kaetzel D.M., Browne J.K., Wondisford F., Nett T.M., Thomason A.R., Nilson J.H. Expression of biologically active bovine luteinizing hormone in Chinese hamster ovary cells // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. -1985. - Vol. 82. - No. 21. - 7280-7283.

44. Kanda M., Jablonka-Shariff A., Sato A., Pixley M.R., Bos E., Hiro'oka T., Ben-Menahem D., Boime I. Genetic fusion of an alpha-subunit gene to the follicle-stimulating hormone and chorionic gonadotropin-beta subunit genes: production of a bifunctional protein // Mol Endocrinol. - 1999. - Vol. 13. - No. 11. - P. 1873-1881.

45. Kato Y., Sato I., Ihara T., Tomizawa K., Mori J., Geshi M., Nagai T., Okuda K., Kato T., Ueda S. Expression and purification of biologically active porcine follicle-stimulating hormone in insect cells bearing a baculovirus vector // J. Mol. Endocrinol. - 1998. - Vol. 20. - No. 1. - P. 55-65.

46. Keene J.L., Matzuk M.M., Boime I. Expression of recombinant human choriogonadotropin in Chinese hamster ovary glycosylation mutants // Mol Endocrinol. - 1989. - Vol. 3. - No. 12. - 2011-2017.

47. Kowarik M., Young N.M., Numao S. et al. Definition of the bacterial N-glycosylation site consensus sequence // EMBO J. - 2006. - Vol. 25. - No. 9. - P. 1957-1966.

48. LaPolt P.S., Nishimori K., Fares F.A., Perlas E., Boime I., Hsueh A.J. Enhanced stimulation of follicle maturation and ovulatory potential by long acting follicle-stimulating hormone agonists with extended carbox-yl-terminal peptides // Endocrinology. - 1992. - Vol. 131. - No. 6. - P. 2514-2520.

49. Leitolf H., Tong K.P., Grossmann M., Weintraub B.D., Szkudlinski M.W. Bioengineering of human thyrotropin superactive analogs by site-directed "lysine-scanning" mutagenesis. Cooperative effects between peripheral loops // J. Biol. Chem. - 2000. - 275. - No. 35. - P. 27457-27465.

50. Lemke E.P., Adams B.M., Jablonka-Shariff A., Boime I., Adams T.E. Single-chain human gonadotropin analogs induce follicle development in sheep // J. Endocrinol. - 2008. - Vol. 196. - No. 3. - P. 593-600.

51. Linskens M.H., Grootenhuis P.D., Blaauw M., Huisman-de Winkel B., Van Ravestein A., Van Haastert P.J., Heikoop J.C. Random mutagenesis and screening of complex glycoproteins: expression of human gonadotropins in Dictyostelium discoideum //FASEB J. - 1999. - Vol. 13. - No. 6. - P. 639-645.

52. Looney C.R., Bondioli K. Bovine FSH produced by recombinant DNA technology // Theriogenology. -1988. - Vol. 29. - No. 1. - P. 235.

53. Morell A.G., Gregoriadis G., Scheinberg I.H., Hickman J., Ashwell G. The role of sialic acid in determining the survival of glycoproteins in the circulation // J. Biol. Chem. - 1971. - Vol. 246. - No. 5. - P. 1461 -1467.

54. Mulders J.W., Derksen M., Swolfs A., Maris F. Prediction of the in vivo biological activity of human recombinant follicle stimulating hormone using quantitative isoelectric focusing // Biologicals. - 1997. - Vol. 25. - No. 3. - P. 269-281.

55. Niimi T. Recombinant protein production in the eukaryotic protozoan parasite Leishmania tarentolae: a review // Methods Mol. Biol. - 2012. - Vol. 824. - P. 307-315.

56. Nothaft H., Szymanski C.M. Protein glycosylation in bacteria: sweeter than ever // Nature Rev. Microb. -2010. - Vol. 8. - No. 11. - P. 765-778.

57. Olijve W., de Boer W., Mulders J.W., van Wezenbeek P.M. Molecular biology and biochemistry of human recombinant follicle stimulating hormone (Puregon) // Mol. Hum. Reprod. - 1996. - Vol. 2. - No. 5. - P. 371-382.

58. Perlman S., van den Hazel B., Christiansen J. et al. Glycosylation of an N-terminal extension prolongs the half-life and increases the in vivo activity of follicle stimulating hormone // J. Clin. Endocrinol. Metab. -2003. - Vol. 88. - No. 7. - P. 3227-3235.

59. Pierce J.G., Parsons T.F. Glycoprotein hormones: structure and function // Annu. Rev. Biochem. - 1981. -Vol. 50. - P. 465-495.

60. Porro D., Sauer M., Branduardi P., Mattanovich D. Recombinant protein production in yeasts // Mol. Biotechnol. - 2005. - Vol. 31. - No. 3. - P. 245-259.

61. Qian W., Liu Y., Zhang C., Niu Z., Song H., Qiu B. Expression of bovine follicle-stimulating hormone subunits in a Hansenula polymorpha expression system increases the secretion and bioactivity in vivo // Protein Expres. Purific. - 2009. - Vol. 68. - No. 2. - P. 183-189.

62. Ribela M.T.C.P., Gout P.W., Bartolini P. Synthesis and chromatographic purification of recombinant human pituitary hormones // J. Chromat. B. - 2003. - Vol. 790. - No. 1-2. - P. 285-316.

63. Roberts M.J., Bentley M.D., Harris J.M. Chemistry for peptide and protein PEGygulation Advanced Drug // Delivery Reviews. - 2002. - Vol. 54. - No. 4. - P. 459-476.

64. Rogan D., Strauss C., Mapletoft R., Bo G., Tribulo H., Szkudlinski M., Weintraub B. Opportunities for the production of the recombinant gonadotropins for assisted reproduction and embryo transfer // In: Proceedings of the joint annual meeting of the canadian and american embryo transfer association. - Montreal, Quebec. - 2009. - P. 59-67.

65. Rose M.P., Gaines Das R.E., Balen A.H. Definition and measurement of follicle stimulating hormone // Endocr. Rev. - 2000. - 21. - No. 1. - P. 5-22.

66. Ruddon R.W., Sherman S.A., Bedows E. Protein folding in the endoplasmic reticulum: lessons from the human chorionic gonadotropin beta subunit // Protein Science. - 1996. - Vol. 5. - No. 8. - P. 1443-1452.

67. Ruman J.I., Pollak S., Trousdale R.K., Klein J., Lustbader J.W. Effects of long-acting recombinant human follicle-stimulating hormone analogs containing N-linked glycosylation on murine folliculogenesis // Fertil. Steril. - 2005. - Vol. 83. - No. 1. - P. 1303-1309.

68. Samaddar M., Babu P.S., Catterall J.F., Dighe R.R. Identification of an attenuating region in the bovine follicle-stimulating hormone beta subunit mRNA that decreases its expression in E. coli // Gene. - 1999. -Vol. 228. - No. 1-2. - P. 253-260.

69. Samaddar M., Catterall J.F., Dighe R.R. Expression of biologically active beta subunit of bovine follicle-stimulating hormone in the methylotrophic yeast Pichia pastoris // Prot. Expres. Purif. - 1997. - Vol. 10. -No. 3. - P. 345-355.

70. Sanders J., Chirgadze D.Y., Sanders P. et al. Crystal structure of the TSH receptor in complex with a thyroid-stimulating autoantibody // Thyroid. - 2007. - Vol. 17. - No. 5. - P. 395-410.

71. Shental-Bechor D., Levy Y. Folding of glycoproteins: toward understanding the biophysics of the glycosylation code // Curr. Opin. Struct. Biol. - 2009. - Vol. 19. - No. 5. - P. 524-533.

72. Sinclair A.M., Elliott S. Glycoengineering: the effect of glycosylation on the properties of therapeutic proteins // J. Pharm. Sci. - 2005. - Vol. 94. - No. 8. - P. 1626-1635.

73. Sodoyer R. Expression systems for the production of recombinant pharmaceuticals. - Biodrugs. - 2004. -Vol. 18. - No. 1. - P. 51-62.

74. Stanton P.G., Pozvek G., Burgon P.G., Robertson D.M., Hearn M.T. Isolation and characterization of human LH isoforms // J. Endocrinol. - 1993. - Vol. 138. - No. 3. - P. 529-543.

75. Stockell H.A., Renwick A.G. Molecular structures of glycoprotein hormones and functions of their carbohydrate components // Biochem. J. - 1992. - Vol. 287. - No. 3. - P. 665-679.

76. Szkudlinski M.W. New frontier in glycoprotein hormones and their receptors structure-function // Front Endocrinol (Lausanne). - 2015. - Vol. 6. - P. 155.

77. Szkudlinski M.W., Teh N.G, Grossmann M., Tropea J.E., Weintraub B.D. Engineering human glycoprotein hormone superactive analogues // Nat. Biotechnol. - 1996. - Vol. 14. - No. 10. - P. 1257-1263.

78. Trousdale R.K, Yu B, Pollak S.V., Husami N., Vidali A, Lustbader J.W. Efficacy of native and hyperglycosylated follicle-stimulating hormone analogs for promoting fertility in female mice // Fertil. Steril. - 2009. - Vol. 91. - No. 1. - P. 265-270.

79. Ulloa-Aguirre A. et al. Midgley A.R. Jr., Beitins I.Z., Padmanabhan V. Follicle-stimulating isohormones: characterization and physiological relevance // Endocr Rev. - 1995. - Vol. 16. - No. 6. - P. 765-787.

80. Ulloa-Aguirre A., Timossi C. Structure-function relationship of follicle-stimulating hormone and its receptor // Hum. Reprod. Update. - 1998. - Vol. 4. - No. 3. - P. 260-283.

81. Ulloa-Aguirre A., Timossi C., Damián-Matsumura P., Dias J.A. Role of glycosylation in function of follicle-stimulating hormone // Endocrine. - 1999. - Vol. 11. - No. 3. - P. 205-215.

82. Ulloa-Aguirre A., Timossi C., Barrios-de-Tomasi J., Maldonado A., Nayudu P. Impact of carbohydrate heterogeneity in function of follicle-stimulating hormone: studies derived from in vitro and in vivo models // Biol. Reprod. - 2003. - Vol. 69. - No. 2. - P. 379-389.

83. Van de Wiel D.F., van Rijn P.A., Meloen R.H., Moormann R.J. High-level expression of biologically active recombinant bovine follicle stimulating hormone in a baculovirus system // J. Mol. Endocrinol. 1998. -Vol. 20. - No. 1. - P. 83-98.

84. Wang S. Zhao, Bai L., Fan J., Liu E. Expression systems and species used for transgenic animal bioreactors // BioMed. Research.- 2013. - Article ID 580463. - 9 p.

85. Weenen C., Peña J. E., Pollak S. V., Klein J., Lobel L., Trousdale R. K., Palmer S., Lustbader E. G., Ogden R. T., Lustbader J. W. Long-acting follicle-stimulating hormone analogs containing n-linked glyco-sylation exhibited increased bioactivity compared with o-linked analogs in female rats // J. Clin. Endocr. Metab. - 2004. - Vol. 89. - No. 10. - P. 5204-5212.

86. Wilson M.E., Morris J. C., Gibbons J. R. Bioactive, bacterial-derived recombinant bovine follicle-stimulating hormone // Reproduction, Fertility and Development. - 2008. - Vol. 21. - No. 1. - P. 246-247.

87. Wilson R.B., Mastick C.C., Murphy R.F. A Chinese hamster ovary cell line with a temperature-conditional defect in receptor recycling is pleiotropically defective in lysosome biogenesis // J. Biol. Chem. - 1993. -Vol. 268. - No. 34. - P. 25357-25363.

REFERENCES

1. Babu P.S., Danilovich N., Sairam M.R. Hormone-induced receptor gene splicing: enhanced expression of the growth factor type I follicle-stimulating hormone receptor motif in the developing mouse ovary as a new paradigm in growth regulation. Endocrinology. 2001, 142(1): 381-389.

2. Babu P.S., Krishnamurthy H., Chedrese P.J., Sairam M.R. Activation of extracellular-regulated kinase pathways in ovarian granulosa cells by the novel growth factor type 1 follicle-stimulating hormone receptor. Role in hormone signaling and cell proliferation. J. Biol. Chem. 2000, 275(36): 27615-27626.

3. Baenziger J.U., Green E.D. Pituitary glycoprotein hormone oligosaccharides: structure, synthesis and function of the asparagine-linked oligosaccharides on lutropin, follitropin and thyrotropin. Biochim. Biophys. Acta. 1988, 947(2): 287-306.

4. Balen A. Is there a risk of prion disease after the administration of urinary-derived gonadotrophins? Hum Reprod. 2002. 17(7): 1676-1680.

5. Bedows E., Huth J.R., Ruddon R.W. Kinetics of folding and assembly of the human chorionic gonadotropin beta subunit in transfected Chinese hamster ovary cells. J. Biol. Chem. 1992, 267(13): 8880-8886.

6. Belen Carrillo M., Gao W., Herrera M., Alroy J., Moore J.B., Beverley S.M., Pereira M.A. Heterologous expression of Trypanosoma cruzi trans-sialidase in Leishmania major enhances virulence. Infect Immun. 2000, 68(5): 2728-2734.

7. Breitling R., Klingner S., Callewaert N., Pietrucha R., Geyer A., Ehrlich G., Härtung R., Müller A., Contreras R., Beverley S.M., Alexandrov K. Non-pathogenic trypanosomatid protozoa as a platform for protein research and production Protein Expression and Purification. 2002, 25(2): 209-218.

8. Bo G.A., Mapletoft R.J. Historical perspectives and recent research on superovulation in cattle Theriogenology. - 2014. - Vol. 81. - No. 1. - 38-48.

9. Cahoreau C., Klett D., Combarnous Y. Structure-function relationships of glycoprotein hormones and their subunits' ancestors. Frontiers in Endocrinology. - 2015. - Vol. 6. - Art. 26. - P. 1-14.

10. Chen X., Zaro J.L., Shen W.C. Fusion protein linkers: property, design and functionality. Adv. Drug. Deliv. Rev. 2013, 65(10): 1357-1369.

11. Chichili V.P.R., Kumar V., Sivaraman J. Linkers in the structural biology of protein-protein interactions. Protein Science. 2013, 22(2): 153-167.

12. Cole L.A., Khanlian S.A., Muller C.Y., Giddings A., Kohorn E., Berkowitz R. Gestational trophoblastic diseases: 3. Human chorionic gonadotropin-free beta-subunit, a reliable marker of placental site trophoblastic tumors. Gynecol Oncol. 2006, 102(2): 160-164.

13. Coulibaly S., Besenfelder U., Miller I., Zinovieva N., Lassnig C., Kotler T., Jameson J.L., Gemeiner M., Müller M., Brem G. Expression and characterization of functional recombinant bovine follicle-stimulating hormone (boFSHalpha/beta) produced in the milk of transgenic rabbits. Mol. Reprod. Dev. 2002, 63(3): 300-308.

14. Dalpathado D.S., Irungu J., Go E.P., Butnev V.Y., Norton K., Bousfield G.R., Desaire H. Comparative glycomics of the glycoprotein follicle stimulating hormone: glycopeptide analysis of isolates from two mammalian species. Biochemistry. 2006, 45(28): 8665-8673.

15. D'Antonio M, Borrelli F, Datola A, Bucci R, Mascia M, Polletta P, Piscitelli D, Papoian R. Biological characterization of recombinant human follicle stimulating hormone isoforms. Hum. Reprod. 1999, 14(5): 11601167.

16. Davis J.S., Kumar T.R., May J.V, Bousfield G.R. Naturally occurring follicle-stimulating hormone glyco-sylation variants. J. Glycomics Lipidomics. 2014, 4(1): e117.

17. Delahaye R., Berreur P., Salesse R., Counis R. Insect cells infected with a recombinant baculovirus express both O- and N-glycosylated forms of the rat glycoprotein hormone alpha-subunit. J. Mol. Endocrinol. 1996, 16(2): 141-149.

18. Dias J.A., Van Roey P. Structural biology of human follitropin and its receptor. Arch. Med. Res. 2001, 32: 510-519.

19. Dirnberger D., Steinkellner H., Abdennebi L., Remy J.J., van de Wiel D. Secretion of biologically active glycoforms of bovine follicle stimulating hormone in plants. Eur. J. Biochem. 2001, 268(16): 4570-4579.

20. Fan Q.R., Hendrickson W.A. Structure of human follicle-stimulating hormone in complex with its receptor. Nature. 2005, 433(7023): 269-277.

21. Fares F.A., Suganuma N., Nishimori K., LaPolt P.S., Hsueh A.J., Boime I. Design of a long-acting follitropin agonist by fusing the C-terminal sequence of the chorionic gonadotropin beta subunit to the follitropin beta subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992, 89(10): 4304-4308.

22. Fauser B.C., Mannaerts B.M., Devroey P., Leader A., Boime I., Baird D.T. Advances in recombinant DNA technology: corifollitropin alfa, a hybrid molecule with sustained follicle-stimulating activity and reduced injection frequency. Hum. Reprod. Update. 2009, 15(3): 309-321.

23. Fernandez F.J., Vega M.C. Technologies to keep an eye on: alternative hosts for protein production in structural biology. Current Opin. Struct. Biol. 2013, 23(3): 365-373.

24. Fox K.M., Dias J.A., Van Roey P. Three-dimensional structure of human follicle-stimulating hormone. Mol. Endocrinol. 2001, 15(3): 378-389.

25. Galet C., Le Bourhis C.M., Chopineau M., Le Griec G., Perrin A., Magallon T., Attal J., Viglietta C., Houdebine L.M., Guillou F. Expression of a single betaalpha chain protein of equine LH/CG in milk of transgenic rabbits and its biological activity. Mol. Cell Endocrinol. 2001, 174(1-2): 31-40.

26. Garcia-Campayo V., Boime I. Independent activities of FSH and LH structurally confined in a single polypeptide: selective modification of the relative potencies of the hormones. Endocrinology. 2001b, 142(12): 5203-5211.

27. Garcia-Campayo V., Boime I. Novel recombinant gonadotropins. Trends Endocrinol. Metab. 2001a, 12(2): 72-77.

28. Garcia-Campayo V., Sato A., Hirsch B., Sugahara T., Muyan M., Hsueh A.J., Boime I. Design of stable biologically active recombinant lutropin analogs. Nature Biotechnology 1997, 15(7): 663-667.

29. Gibreel A., Bhattacharya S. Recombinant follitropin alfa/lutropin alfa in fertility treatment. Biologics. 2010, 4:5-17.

30. Green E.D., Baenziger J.U. Asparagine-linked oligosaccharides on lutropin, follitropin, and thyrotropin. II. Distributions of sulfated and sialylated oligosaccharides on bovine, ovine, and human pituitary glycoprotein hormones. J. Biol. Chem. 1988, 263(1): 36-44.

31. Greenberg N.M., Anderson J.W., Hsueh A.J., Nishimori K., Reeves J.J., deAvila D.M., Ward D.N., Rosen J.M. Expression of biologically active heterodimeric bovine follicle-stimulating hormone in milk of transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991, 88(19): 8327-8331.

32. Grossmann M., Leitolf H., Weintraub B.D., Szkudlinski M.W. A rational design strategy for protein hormone superagonists. Nat. Biotechnol. 1998, 16(9): 871-875.

33. Heikoop J.C., Huisman-de Winkel B., Grootenhuis P.D. Towards minimized gonadotropins with full bioac-tivity. Eur. J. Biochem. 1999, 261(1): 81-84.

34. Hesser M. A survey of heterologous expression systems for the production of bovine follicle stimulating hormone and luteinizing hormone. All Dissertations. 2011, Paper 692, P. 1-140.

35. Hesser M.W., Morris J.C., Gibbons J.R. Advances in recombinant gonadotropin production for use in bovine superovulation. Reprod. Dom. Animal. 2011, 46: 933-942.

36. Huo X., Liu Y., Wang X., Ouyang P., Niu Z., Shi Y., Qiu B. Co-expression of human protein disulfide isomerase (hPDI) enhances secretion of bovine follicle-stimulating hormone (bFSH) in Pichia pastoris. Protein Expr. Purif. 2007, 54(2): 234-239.

37. Iles R.K., Delves P.J., Butler S.A. Does hCG or hCGp play a role in cancer cell biology? Mol. Cell. Endocrinol. 2010, 329(1-2): 62-70.

38. Inaba T, Mori J, Ohmura M, Tani H, Kato Y, Tomizawa K, Kato T, Ihara T, Sato I, Ueda S. Recombinant porcine follicle stimulating hormone produced in baculovirus-insect cells induces rat ovulation in vivo and gene expression of tissue plasminogen activator in vitro. Res. Vet. Sci. 1998, 64(1): 25-29.

39. Jablonka-Shariff A., Kumar T.R., Eklund J., Comstock A., Boime I. Single-chain, triple-domain gonadotro-pin analogs with disulfide bond mutations in the alpha-subunit elicit dual follitropin and lutropin activities in vivo. Mol Endocrinol. 2006, 20(6): 1437-1446.

40. Jiang X., Liu, H., Chen X., He X. Evidence for follicle-stimulating hormone receptor as a functional trimer. J. Biol. Chem. 2014, 289(20): 14273-14282.

41. Jiang, X., Liu, H., Chen, X., He, X. Structure of follicle-stimulating hormone in complex with the entire ectodomain of its receptor. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2012, 109(31): 12491-12496.

42. Joshi L., Murata Y., Wondisford F.E., Szkudlinski M.W., Desai R., Weintraub B.D. Recombinant thyrotropin containing a beta-subunit chimera with the human chorionic gonadotropin-beta carboxy-

terminus is biologically active, with a prolonged plasma half-life: role of carbohydrate in bioactivity and metabolic clearance. Endocrinology. 1995, 136(9): 3839-3848.

43. Kaetzel D.M., Browne J.K., Wondisford F., Nett T.M., Thomason A.R., Nilson J.H. Expression of biologically active bovine luteinizing hormone in Chinese hamster ovary cells. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1985, 82(21): 7280-7283.

44. Kanda M., Jablonka-Shariff A., Sato A., Pixley M.R., Bos E., Hiro'oka T., Ben-Menahem D., Boime I. Genetic fusion of an alpha-subunit gene to the follicle-stimulating hormone and chorionic gonadotropin-beta subunit genes: production of a bifunctional protein. Mol Endocrinol. 1999, 13(11): 1873-1881.

45. Kato Y., Sato I., Ihara T., Tomizawa K., Mori J., Geshi M., Nagai T., Okuda K., Kato T., Ueda S. Expression and purification of biologically active porcine follicle-stimulating hormone in insect cells bearing a baculovirus vector. J. Mol. Endocrinol. 1998, 20(1): 55-65.

46. Keene J.L., Matzuk M.M., Boime I. Expression of recombinant human choriogonadotropin in Chinese hamster ovary glycosylation mutants. Mol. Endocrinol. 1989, 3(12): 2011-2017.

47. Kowarik M., Young N.M., Numao S., Schulz B.L., Hug I., Callewaert N., Mills D.C., Watson D.C., Hernandez M., Kelly J.F., Wacker M., Aebi M. Definition of the bacterial N-glycosylation site consensus sequence. EMBO J. 2006, 25(9): 1957-1966.

48. LaPolt P.S., Nishimori K., Fares F.A., Perlas E., Boime I., Hsueh A.J. Enhanced stimulation of follicle maturation and ovulatory potential by long acting follicle-stimulating hormone agonists with extended carbox-yl-terminal peptides. Endocrinology. 1992, 131(6): 2514-2520.

49. Leitolf H., Tong K.P., Grossmann M., Weintraub B.D., Szkudlinski MW. Bioengineering of human thyrotropin superactive analogs by site-directed "lysine-scanning" mutagenesis. Cooperative effects between peripheral loops. J. Biol. Chem. 2000, 275(35): 27457-27465.

50. Lemke E.P., Adams B.M., Jablonka-Shariff A., Boime I., Adams T.E. Single-chain human gonadotropin analogs induce follicle development in sheep. J. Endocrinol. 2008, 196(3): 593-600.

51. Linskens M.H., Grootenhuis P.D., Blaauw M., Huisman-de Winkel B., Van Ravestein A., Van Haastert P.J., Heikoop J.C. Random mutagenesis and screening of complex glycoproteins: expression of human gonadotropins in Dictyostelium discoideum. FASEB J. 1999, 13(6): 639-645.

52. Looney C.R., Bondioli K. Bovine FSH produced by recombinant DNA technology. Theriogenology. 1988, 29(1): 235.

53. Morell A.G., Gregoriadis G., Scheinberg I.H., Hickman J., Ashwell G. The role of sialic acid in determining the survival of glycoproteins in the circulation. J. Biol. Chem. 1971, 246(5): 1461-1467.

54. Mulders J.W., Derksen M., Swolfs A., Maris F. Prediction of the in vivo biological activity of human recombinant follicle stimulating hormone using quantitative isoelectric focusing. Biologicals. 1997, 25(3): 269-281.

55. Niimi T. Recombinant protein production in the eukaryotic protozoan parasite Leishmania tarentolae: a review. Methods Mol. Biol. 2012, 824: 307-315.

56. Nothaft H., Szymanski C.M. Protein glycosylation in bacteria: sweeter than ever. Nature Rev. Microb. 2010, 8(11): 765-778.

57. Olijve W., de Boer W., Mulders J.W., van Wezenbeek P.M. Molecular biology and biochemistry of human recombinant follicle stimulating hormone (Puregon). Mol. Hum. Reprod. 1996, 2(5): 371-382.

58. Perlman S., van den Hazel B., Christiansen J. et al. Glycosylation of an N-terminal extension prolongs the half-life and increases the in vivo activity of follicle stimulating hormone. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2003, 88(7): 3227-3235.

59. Pierce J.G., Parsons T.F. Glycoprotein hormones: structure and function. Annu. Rev. Biochem. 1981, 50: 465-495.

60. Porro D., Sauer M., Branduardi P., Mattanovich D. Recombinant protein production in yeasts. Mol. Biotechnol. 2005, 31(3): 245-259.

61. Qian W., Liu Y., Zhang C., Niu Z., Song H., Qiu B. Expression of bovine follicle-stimulating hormone subunits in a Hansenula polymorpha expression system increases the secretion and bioactivity in vivo. Protein Expres. Purific. 2009, 68(2): 183-189.

62. Ribela M.T.C.P., Gout P.W., Bartolini P. Synthesis and chromatographic purification of recombinant human pituitary hormones. J. Chromat. B. 2003, 790(1-2): 285-316.

63. Roberts M.J., Bentley M.D., Harris J.M. Chemistry for peptide and protein PEGygulation Advanced Drug Delivery Reviews. 2002, 54(4): 459-476.

64. Rogan D., Strauss C., Mapletoft R., Bo G., Tribulo H., Szkudlinski M., Weintraub B. Opportunities for the production of the recombinant gonadotropins for assisted reproduction and embryo transfer. In: Proceed-

ings of the joint annual meeting of the Canadian and American Embryo Transfer Association. Montreal, Quebec, 2009, P. 59-67.

65. Rose M.P., Gaines Das R.E., Balen A.H. Definition and measurement of follicle stimulating hormone. Endocr. Rev. 2000, 21(1): 5-22.

66. Ruddon R.W., Sherman S.A., Bedows E. Protein folding in the endoplasmic reticulum: lessons from the human chorionic gonadotropin beta subunit. Protein Science. 1996, 5(8): 1443-1452.

67. Ruman J.I., Pollak S., Trousdale R.K., Klein J., Lustbader J.W. Effects of long-acting recombinant human follicle-stimulating hormone analogs containing N-linked glycosylation on murine folliculogenesis. Fertility and Sterility. 2005, 83(1): 1303-1309.

68. Samaddar M., Babu P.S., Catterall J.F., Dighe R.R. Identification of an attenuating region in the bovine follicle-stimulating hormone beta subunit mRNA that decreases its expression in E. coli. Gene. 1999, 228(1-2): 253-260.

69. Samaddar M., Catterall J.F., Dighe R.R. Expression of biologically active beta subunit of bovine follicle-stimulating hormone in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Protein Expression and Purification. 1997, 10(3): 345-355.

70. Sanders J., Chirgadze D.Y., Sanders P. et al. Crystal structure of the TSH receptor in complex with a thyroid-stimulating autoantibody. Thyroid. 2007, 17(5): 395-410.

71. Shental-Bechor D., Levy Y. Folding of glycoproteins: toward understanding the biophysics of the glycosylation code. Curr. Opin. Struct. Biol. 2009, 19(5): 524-533.

72. Sinclair A.M., Elliott S. Glycoengineering: the effect of glycosylation on the properties of therapeutic proteins. J. Pharm. Sci. 2005, 94(8): 1626-1635.

73. Sodoyer R. Expression systems for the production of recombinant pharmaceuticals. Biodrugs. 2004, 18(1): 51-62.

74. Stanton P.G., Pozvek G., Burgon P.G., Robertson D.M., Hearn M.T. Isolation and characterization of human LH isoforms. J. Endocrinol. 1993, 138(3): 529-543.

75. Stockell H.A., Renwick A.G. Molecular structures of glycoprotein hormones and functions of their carbohydrate components. Biochem. J. 1992, 287(3): 665-679.

76. Szkudlinski M.W. New frontier in glycoprotein hormones and their receptors structure-function. Front Endocrinol. (Lausanne). 2015, 6: 155.

77. Szkudlinski M.W., Teh N.G, Grossmann M., Tropea J.E., Weintraub B.D. Engineering human glycoprotein hormone superactive analogues. Nat. Biotechnol. 1996, 14(10): 1257-1263.

78. Trousdale R.K., Yu B., Pollak S.V., Husami N., Vidali A., Lustbader J.W. Efficacy of native and hyperglycosylated follicle-stimulating hormone analogs for promoting fertility in female mice. Fertil. Steril. 2009, 91(1): 265-270.

79. Ulloa-Aguirre A., Midgley A.R. Jr., Beitins I.Z., Padmanabhan V. Follicle-stimulating isohormones: characterization and physiological relevance. Endocr. Rev. 1995, 16(6): 765-787.

80. Ulloa-Aguirre A., Timossi C. Structure-function relationship of follicle-stimulating hormone and its receptor. Hum. Reprod. Update. 1998, 4(3): 260-283.

81. Ulloa-Aguirre A., Timossi C., Barrios-de-Tomasi J., Maldonado A., Nayudu P. Impact of carbohydrate heterogeneity in function of follicle-stimulating hormone: studies derived from in vitro and in vivo models. Biol. Reprod. 2003, 69(2): 379-389.

82. Ulloa-Aguirre A., Timossi C., Damián-Matsumura P., Dias J.A. Role of glycosylation in function of follicle-stimulating hormone. Endocrine. 1999, 11(3): 205-215.

83. Van de Wiel D.F., van Rijn P.A., Meloen R.H., Moormann R.J. High-level expression of biologically active recombinant bovine follicle stimulating hormone in a baculovirus system. J. Mol. Endocrinol. 1998, 20(1): 83-98.

84. Wang S. Zhao, Bai L., Fan J., Liu E. Expression systems and species used for transgenic animal bioreac-tors. BioMedResearch. 2013, Article ID 580463, 9 p.

85. Weenen C., Peña J. E., Pollak S. V., Klein J., Lobel L., Trousdale R. K., Palmer S., Lustbader E. G., Ogden R. T., Lustbader J. W. Long-acting follicle-stimulating hormone analogs containing n-linked glycosylation exhibited increased bioactivity compared with o-linked analogs in female rats. J. Clin. Endocr. Metab. 2004, 89(10): 5204 -5212.

86. Wilson M.E., Morris J. C., Gibbons J. R. Bioactive, bacterial-derived recombinant bovine follicle-stimulating hormone. Reproduction, Fertility and Development 2008, 21(1): 246-247.

87. Wilson R.B., Mastick C.C., Murphy R.F. A Chinese hamster ovary cell line with a temperature-conditional defect in receptor recycling is pleiotropically defective in lysosome biogenesis. J. Biol. Chem. 1993, 268(34): 25357-25363.

Recombinant follicle-stimulating hormone for induction of superovulation in cattle: current state and perspectives (a review)

Bursakov S.A., Kovalchuk S.N., Popov D.V., Kosovsky G.Yu.

Center of Experimental Embryology and Reproductive Biotechnologies, Moscow, Russian Federation.

ABSTRACT. An important element of embryo transfer technology in cattle is a hormonal stimulation of superovulation in donor cows, that is based on the use of follicle stimulating hormone (FSH) for simultaneous growth and maturation of multiple follicles. For elaboration of biologically valuable embryos, it needs to enforce all the necessary conditions, but to date it has not yet formed a unified form of the production and use of FSH. A variety of methods for production of recombinant FSH for animal husbandry has increased significantly over the last 30 years, but so far failed to develop a common standard, that is consistent with the existing requirements to be included in protocol for induction of superovulation in cattle on a permanent basis and for obtaining the expected number of embryos per donor animal. The greatest success is possible in the production of recombinant FSH (rFSH), homogeneous in composition and close to their natural counterparts, but which has new features to increase the biological effectiveness and economic viability. Expenses for the purchase of gonadotropins are of paramount importance, since they are the most expensive part in the performance of embryo transfer. The use of rFSH may improve economic efficiency, predictability in embryo transplantation and efficacy to get oocytes suitable for fertilization. Besides, the application of a new generation of hormone analog will reduce side effects associated with its intensive utilization for the selected high yielding donor cows. The review presents systematic data on existing expression systems for recombinant FSH production and examples of molecular modeling using protein engineering technologies to create highly effective forms of hormone with desired properties.

Keywords: cattle, recombinant follicle-stimulating hormone, gene-engineering techniques, glycosyla-tion, embryo transplantation

Problemy biologii productivnykh zhivotnykh - Problems of Productive Animal Biology, 2016, 3: 5-23

Поступило в редакцию: 03.06.2016 Получено после доработки: 25.07.2016

Бурсаков Сергей Алексеевич, к.б.н., с.н.с., тел.: 8(495)610-21-31; sergeymoscu@gmail.com Ковальчук Светлана Николаевна, к.б.н., зав. отд., тел.:

8(495)6102131; s.n.kovalchuk@mail.ru

Попов Дмитрий Владимирович, зав. отд., тел. 8(495)610-21-31; popov.bio@gmail.com Косовский Глеб Юрьевич, д.б.н., дир., тел.: 8(495)610-21-31; gkosovsky@mail.ru