CC BY
7УДК 575.858 + 631.523.55 + 631.527.5: 582.542.1
Н.И. Дубовец, Е.А. Сычева, Л.А. Соловей, Т.И. Штык, Е.Б. Бондаревич
РЕКОМБИНАНТНЫЙ ГЕНОМ КАК ИСТОЧНИК ВНУТРИВИДОВОЙ ДИВЕРГЕНЦИИ ПОЛИПЛОИДНЫХ ЗЛАКОВ
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
Введение
Исследования последних лет, проведенные на различных растительных системах как естественного, так и искусственного происхождения с применением молекулярных технологий, показали, что генезис аллополиплоидных форм сопровождается кардинальными геномными преобразованиями и модификациями [1-9]. Часть этих изменений происходит на ранних стадиях формирования аллополиплои-да и обеспечивает его цитологическую и генетическую диплоидизацию. Другие изменения возникают спорадически на протяжении длительного периода жизни полиплоидных видов, и их роль сводится к повышению генетической изменчивости, пластичности и адаптивности таксона. К числу последних относится уникальная способность аллополиплоидных видов скрещиваться между собой с образованием рекомбинантных геномов, содержащих генетический материал двух или более диплоидных видов. [10, 11]. Появление таких геномов в ходе гибридизации тетраплоидных форм впервые было продемонстрировано Zohary и Feldman на примере рода Aegilops [12]. Авторами предложена модель «pivotal-differential» эволюции, согласно которой все многообразие полиплоидных видов Triticum и Aegilops возникло в результате скрещиваний небольшого числа первичных тетраплоидов, имевших один общий геном (A, U, или D) и различавшихся вторыми геномами. При этом общий (базовый) геном служил буфером, обеспечивающим возможность рекомбинаций между хромосомными наборами вторых (различных) геномов. В итоге формировался тетраплоидный гибрид, включающий исходный базовый геном и сильно модифицированный новый геном. Есть все основания полагать, что на ранних
этапах эволюция злаков была в значительной степени «перекрещивающейся» [13], и многие полиплоидные виды являются результатом аналогичных гибридизаций. Вследствие этого, изучение процесса формирования ре-комбинантного генома представляется актуальной задачей.
Удобной экспериментальной моделью для подобного рода исследований являются тетра-плоидные пшенично-ржаные амфидиплоиды. Гибриды Б1 этих форм содержат в кариотипе диплоидный набор хромосом ржи и гаплоидные наборы хромосом А и В геномов пшеницы, что по геномной структуре полностью соответствует упомянутой теоретической модели. В последующих поколениях тетраформ в каждой гомеологичной группе пшеничного компонента кариотипа происходит замещение одного из гомеологов на соответствующий гомолог. В результате формируется рекомби-нантный геном, отличительной особенностью которого является огромная вариация хромосомного состава, обусловленная разными сочетаниями хромосом А и В геномов пшеницы. Теоретически возможны 128 таких сочетаний, однако в эксперименте число их значительно ниже, причем в материале из разных селекционных программ наблюдаются различия по частоте встречаемости отдельных хромосом пшеницы [14-17], что свидетельствует о неслучайном характере происходящих рекомби-национных событий. Исходя из этого, мы поставили перед собой задачу на созданном нами материале провести детальное исследование процесса стабилизации хромосомного состава тетраформ и на основе сопоставления полученных результатов с литературными данными выявить закономерности этого процесса.
Материалы и методы
Объектом исследований являлись яровые тетраплоидные пшенично-ржаные амфиди-плоиды ПРАТ 12, ПРАТ16 и ПРАТ72, полученные в результате гибридизации 6х-тритикале с диплоидной аллоплазматической рожью [14]. Каждая из 3-х форм представляет собой потомство гибрида Б2, репродуцируемое в условиях свободного опыления. Анализ хромосомного состава растений в ряду поколений (Г Б Б - Б) выполнялся с помощью метода дифференциального окрашивания хромосом по Гимза [18]. В ходе исследования гибридов
Б6 цитологические препараты готовились из суспензии клеток, полученной при мацерации корешков нескольких растений, что не позволяет достоверно оценить частоту встречаемости различных вариантов кариотипа в гибридном материале (данные анализа не включены в таблицу). В последующих поколениях анализировался хромосомный состав индивидуальных растений - не менее 30 на каждую форму. Учет количества аберрантных хромосом пшеницы был проведен в гибридном материале Б - Б
Результаты и обсуждение
Первый анализ хромосомного состава полученных нами тетраплоидных тритикале был проведен в Б6 гибридов. Было установлено, что каждая из трех форм представляет собой популяцию растений с различными вариантами кариотипа. В каждом варианте геном ржи был представлен полностью, а пшеничный компонент образован определенным сочетанием хромосом А и В геномов. Всего в исследованном материале было выявлено 30 вариантов таких сочетаний. Различия между ними главным образом были обусловлены разным составом 2, 3 и 7-й гомеологичных групп. В этих же группах наряду с парами гомологов с высокой частотой встречались гетерологичные пары хромосом. Состав остальных гомеологичных групп практически полностью стабилизировался: 1-я группа в большинстве случаев (за исключением двух вариантов кариотипа) была представлена хромосомой 1В; 4-я и 5-я - у всех форм содержали хромосомы А генома; в 6-й также преобладали хромосомы А генома (6В отмечена в четырех вариантах кариотипа, в двух из них в моносомном состоянии). Поскольку первоначально предполагалось, что конечным этапом формирования хромосомного состава тетраплоидных тритикале является подбор пар гомологов во всех гомеологичных
группах, полученные данные свидетельствовали о незавершенности процесса стабилизации кариотипа исследованных форм. Полагая, что растения с несбалансированным кариотипом, как менее жизнеспособные, в ходе репродукции материала будут подвержены элиминации, мы ожидали скорого его завершения в одном из следующих поколений. Однако хромосомный анализ более поздних поколений 4х-тритикале не подтвердил наши ожидания. Так, в Б из 33 выявленных вариантов кариотипа сбалансированными по хромосомному составу всех гомеологичных групп (стабильными) были лишь 10, остальные по-прежнему характеризовались гетерогенностью одной, двух или трех гомеологичных групп.
Частота встречаемости гетерологичных пар хромосом пшеницы в разных гомеологичных группах тетраформ представлена в таблице 1. Как видно из данных (Табл. 1), самой нестабильной у гибридов Б была 2-я группа, затем в порядке возрастания стабильности следовали 3, 7, 1 и 6 группы. Следует отметить существенное снижение уровня стабильности 1-й гомеологичной группы, которая в Б6 преимущественно была представлена парой хромосом В генома, а в Б в 13 вариантах кариотипа содержала 1 А хромосому (Рис. 1).
В целом по трем популяциям растения с нестабильным кариотипом составили 48,94 % от числа проанализированных. У гибридов Б было выявлено 41 сочетание хромосом А и В геномов пшеницы, из которых 11 относились
Рис. 1. С-окрашенная метафазная пластинка тетра-плоидного пшенично-ржаного амфидиплоида Б Т — обозначает транслоцированные хромосомы.
к стабильным вариантам кариотипа. Растения с нестабильным кариотипом составили 55,0 %. Особого внимания заслуживает факт появления гетерологичных пар хромосом в 5-й гомео-логичной группе, а в Б — и в 4-й (Табл. 1).
Таблица 1
Частота встречаемости гетерологичных пар хромосом пшеницы (АВ) в кариотипах тетраплоидных тритикале Б1б-Б17
Гомеологичные группы Поколение
Форма 10 14 15 16 17
1 6,06 12,50 6,90 9,52 10,71
2 15,15 12,50 17,24 23,81 17,86
<м 3 3,03 16,67 24,14 28,57 14,29
4 0 0 0 0 0
5 0 16,67 3,45 1,47 1,04
6 6,06 0 0 0 0
7 12,12 33,33 13,79 19,05 25,00
1 6,45 24,32 23,33 34,78 37,50
2 32,26 21,63 16,67 26,09 21,88
3 29,03 8,11 16,67 13,04 31,25
4 0 0 6,67 0 0
5 0 0 6,67 0 0
6 0 0 3,33 0 0
7 9,68 32,43 16,67 39,13 37,50
1 23,33 25,00 0 37,50 16,67
2 13,33 12,50 13,33 4,17 22,22
<М 3 3,33 6,25 0 12,50 13,89
4 0 0 0 0 0
5 0 6,25 6,67 0 0
6 3,33 0 0 0 0
7 23,33 6,25 6,66 4,17 13,89
Увеличение числа нестабильных групп зации наших популяций с дагестанской лини-произошло вследствие спонтанной гибриди- ей ПРАТ 21, имеющей пшеничный компонент
кариотипа следующего состава - 1В2А3В4В5 В6А7А.
На протяжении двух полевых сезонов эта линия высевалась рядом с популяциями тетра-форм. Поскольку тетраплоидные тритикале являются перекрестноопыляющейся культурой, совместная репродукция материала привела к интрогрессии в популяции нетипичных для них 4В и 5В хромосом. Как следствие этого, в материале F гетерологичные пары хромосом были обнаружены во всех семи гомеологичных группах пшеничного компонента кариотипа. Из 44 выявленных вариантов кариотипа стабильными были 17. Растения с нестабильным кариотипом составили 47,3 %.
Дальнейшая пространственная изоляция линии ПРАТ 21 вызвала резкое сокращение в популяциях тетраплоидных тритикале численности растений с хромосомами В генома в 4 и 5-й гомеологичных группах. В проанализированном материале F растения с 4В хромосомой не были обнаружены вообще, а растения с 5В хромосомой составили только 2,94 %, из которых 1,47 % содержали в 5-й группе гетерологичную пару хромосом. Гетерологичные пары были отмечены также в 1, 2, 3 и 7-й группах. Из 35 выявленных в этом поколении вариантов кариотипа 9 были стабильными, растения с нестабильным карио-типом составили 55,88 %.
В материале F было выявлено 52 варианта кариотипа, из которых 14 имели стабильный хромосомный состав. Гетерологичные пары хромосом пшеницы были отмечены в тех же гомеологичных группах, что и в F16, с той лишь разницей, что по уровню нестабильности 1-я и 7-я группы поменялись местами (Табл. 1). Частота встречаемости гетерологичной пары в 5-й группе была еще ниже, чем в F16, что свидетельствовало о продолжающейся элиминации хромосом В генома из этой группы.
Таким образом, полученные в ходе хромосомного анализа данные свидетельствуют о том, что стабилизация хромосомного состава различных гомеологичных групп пшеничного компонента кариотипа 4х-тритикале происходит с различной скоростью. В одних группах (в нашем материале это 4, 5 и 6-я группы) подбор пар гомологов заканчивается довольно быстро, в других гете-рологичные пары хромосом наблюдаются на протяжении очень большого числа поколений. Вследствие этого в популяциях постоянно поддерживается определенное количество растений (около 50 % с небольшими колебаниями в ту или другую сторону) с нестабильным кариотипом.
Другой характерной особенностью процесса формирования кариотипа тетраформ является появление хромосом пшеницы с модифицированной структурой (Рис. 2)
Рис. 2. Варианты межгеномных транслокаций хромосом, выявленные в кариотипах тетраплоидных тритикале Б14-Б17. N - нормальная хромосома, Т - транслоцированная хромосома. Стрелкой обозначены места локализации перестроек.
Единичные растения 4х-тритикале с аберрантными хромосомами пшеницы были отмечены нами уже в ранних поколениях гибридов [19]. В дальнейшем их количество постоянно увеличивалось и в Б уже 84,4 % растений
от общего числа проанализированных амфи-диплоидов характеризовалось наличием того или иного типа хромосомных аберраций, а в ряде случаев и нескольких типов одновременно (Табл.2).
Таблица 2
Частота встречаемости ( %) транслоцированных хромосом
в популяциях тетраплоидных тритикале Б - Б
17
Поколение Транслоцированные хромосомы
1АТ 1ВТ 2АТ 2ВТ 3АТ 3ВТ
Б 14 21,05 23,30 35,23 5,56 17,65 0
Б 15 39,02 28,97 26,83 18,18 25,00 4,63
Б 16 42,22 26,37 51,67 6,58 58,93 2,50
Б 17 59,82 47,50 54,10 6,38 33,00 9,78
Примечание. Надстрочный знак Т обозначает транслоцированную хромосому.
При этом модификациям подвергались хромосомы тех гомеологичных групп, для которых характерно сохранение гетерогеномного состава в ряду поколений. Если сопоставить это наблюдение с выявленным характером структурных изменений, становится очевидным, что эти изменения представляют собой реципрокные транслокации, образовавшиеся в ходе спаривания гомеологов А и В геномов. Факт спаривания гомеологов пшеницы в мейозе тетраформ был подтвержден нами экспериментально в ходе анализа микроспо-рогенеза у линий с нестабильным кариотипом с использованием метода дифференциального окрашивания хромосом [20].
Полученные в ходе эксперимента данные свидетельствуют о том, что полная стабилизация кариотипа тетраформ по формальному признаку - наличию пар гомологов пшеницы во всех гомеологичных группах - не наступает никогда. В популяциях постоянно сохраняется определенное количество растений (около 50 %) с гетерогеномным составом ряда гомеологичных групп пшеничного компонента кариотипа (в нашем материале это 1, 2, 3 и 7-я группы). Выявленная особенность формирования хромосомного состава тетраплоидных тритикале присуща не только нашим гибридным формам. Различная скорость стабилизации гомеологичных групп была отмечена также в материале польской и немецкой селекции
[16,17], однако распределение групп по уровню нестабильности здесь выглядит иным образом.
Другой характерной особенностью процесса формирования рекомбинантного генома тетраформ является появление хромосом пшеницы с модифицированной структурой, причем модификациям подвергаются хромосомы лишь тех гомеологичных групп, для которых характерно сохранение гетерогеномного состава. Количество растений с рекомбинант-ными хромосомами в ходе смены поколений неуклонно растет, что свидетельствует об их большей жизнеспособности по сравнению с растениями, у которых сохранилась исходная структура хромосом пшеницы.
Таким образом, формирование рекомбинант-ного генома тетраплоидных тритикале происходит за счет межгеномных рекомбинаций двух типов - на уровне целых хромосом и на уровне их сегментов. Рекомбинации первого типа характерны для гомеологичных групп с высокой скоростью стабилизации хромосомного состава, а второго - с низкой, где длительное время сохраняются гетерологичные пары хромосом.
Возникает вполне закономерный вопрос: «Чем вызвано наблюдаемое у тетраформ сохранение гетерологичных пар хромосом?». Можно предположить, что растения с гетеро-геномным составом групп образуются в каж-
дом очередном поколении тетраформ заново, как результат гибридизации особей, в карио-типах которых эти группы содержат пары хромосом из разных геномов пшеницы. Однако в таком случае, при исходном равенстве частот хромосом А и В геномов у гибридов F гете-рологичные пары хромосом должны присутствовать во всех гомеологичных группах, и частота их образования должна быть сходной. Мы же этого не наблюдаем.
Возможно в ранних поколениях гибридов, когда эффективная численность популяций была низкой, произошли чисто случайные отклонения в соотношении частот генотипов, вызванные статистическими причинами, что и привело к быстрой стабилизации ряда групп при сохранении гетерологичных пар в остальных. Но тогда не поддается объяснению факт сходства хромосомного состава 4, 5 и 6-й го-меологичных групп , которые в нашем материале не только быстро стабилизировались, но и все содержат пары гомологов А генома. Вероятность случайного совпадения состава в трех группах у трех форм (Р=(1/2)9) очень мала. Из этого следует, что в ходе становления кариотипа 4х-тритикале как подбор пар гомологов в группах с высокой скоростью стабилизации, так и сохранение гетерогеном-ного состава остальных групп происходит не случайным образом.
Сопоставление результатов анализа поведения хромосом на стадии метафазы I мейоза у гибридов F1 с результатами кариотипирования более поздних поколений свидетельствует о том, что существует корреляция между частотой спаривания гомеологичных хромосом и скоростью стабилизации соответствующей гомеологичной группы [21]. Исходя из этого, логично предположить, что именно синапсис гомеологов замедляет процесс подбора пар гомологов. Но в таком случае необъясним факт различия по набору гомеологичных групп с гетерогеномным составом между тетрапло-идными тритикале из разных селекционных программ. Известно, что частота спаривания хромосом определяется их структурным сходством, которое для гомеологов различных субгеномов мягкой пшеницы является величиной постоянной, отражающей степень их эволюционной дивергенции. Поэтому сортовые различия включенного в гибридизацию исходного
материала не могут столь существенно влиять на синапсис гомеологов, чтобы обеспечить в гибридном материале различные наборы гомеологичных групп с гетерогеномным составом.
В итоге мы пришли к заключению, что в ходе стабилизации кариотипа тетраплоидных тритикале процесс взаимозамещения гомеологов А и В геномов определяется их селективными преимуществами, которые, как известно, являются результатом генотип-средовых взаимодействий. Когда гомеолог обладает явными селективными преимуществами, подбор пары гомологов в соответствующей гомеологичной группе происходит довольно быстро. Когда же конкурентоспособность гомеологов одинакова, скорость стабилизации группы замедляется. При этом доминирование генетических систем базового генома ржи обеспечивает си-напсис гомеологов пшеницы с последующей рекомбинацией генетического материала.
Из этого следует, что в различных условиях среды отбор будет благоприятствовать сохранению в гибридном материале разных сочетаний хромосом А и В геномов пшеницы. Анализ собственных и литературных данных подтверждает эти ожидания. В нашем материале из 128 теоретически возможных стабильных вариантов кариотипа были обнаружены лишь 26, причем явное численное преимущество имели только два. В материале, проанализированном Lukaszewski et al. [16], предпочтительное сочетание хромосом А и В геномов выглядело иным образом, и частота встречаемости растений с таким кариотипом в 9 раз превышала теоретически ожидаемую. И, наконец, в материале дагестанской селекции явное численное преимущество имели выявленные у пяти форм из восьми три варианта кариотипа, различающиеся между собой лишь составом 2-й гомеологичной группы [22]. Все они были отличны от вариантов, преобладающих в материале других селекционных программ.
Но особенно яркой иллюстрацией справедливости выдвинутого нами положения является ситуация со спонтанной гибридизацией нашего материала с линией дагестанской селекции ПРАТ21, вызвавшая появление в 4 и 5-й гомеологичных группах нетипичных для популяций хромосом В генома. Тот факт, что дальнейшая пространственная изоляция да-
гестанской линии способствовала быстрой лективных преимуществах в наших условиях элиминации из кариотипов популяций 4В и произрастания соответствующих гомеологов 5В хромосом, бесспорно свидетельствует о се- А генома.
Заключение
Результаты проведенного исследования дают основание полагать, что в ходе эволюционного становления полиплоидных видов злаков гибридизация на основе базового генома одних и тех же первичных тетраплоидных форм в разных экологических нишах могла привести к отбору различных вариантов формируемого рекомбинантного генома. Это способствовало быстрой дивергенции видов и возникновению на их основе новых таксономических единиц. Свойственная интрогрессивным гибридам низкая фертильность могла компенсироваться переходом к вегетативному размножению.
К тому же большинство полиплоидных видов злаков является многолетниками, а гибриды между многолетними видами бывают стерильными лишь при первом цветении, но в последующие годы могут полностью или хотя бы частично восстанавливать фертильность [13]. Нередко возникающие при проведении геномного анализа многолетних видов злаков проблемы с идентификацией диплоидных доноров геномов легко объясняются с позиции образования рекомбинантных геномов и являются косвенным подтверждением реальности этого пути видообразования у злаков.
Список использованных источников
1. Rapid elimination of low-copy DNA sequences in polyploidy wheat: a possible mechanism for differentiation of homoeologous chromosomes / M. Feldman [et al.] // Genetics. -
1997. - Vol. 147, № 3. - P. 1381-1387.
2. Rapid genomic changes in newly synthesized amphiploids of Triticum and Aegilops. Changes in low-copy non-coding DNA sequences / B. Liu [et al.] // Genome. - 1998. - Vol. 41, № 2. -P 272-277.
3. Liu, B. Rapid genomic changes in newly synthesized amphiploids of Triticum and Aegilops. Changes in low-copy coding DNA sequences / B. Liu, J.M. Vega, M. Feldman // Genome. -
1998. -Vol. 41, № 4. - P 535-542.
4. Ozkan, H. Alloploidy induced rapid genome evolution in the wheat (Aegilops- Triticum) group / H. Ozkan, A.A. Levy, M. Feldman // Plant Cell. - 2001. - Vol. 13, № 8. - P. 1735-1747.
5. Sequence elimination and cytosine methylation are rapid and reproducible responses of the genome to wide hybridization and allopolyploidy in wheat / H. Shaked [et al.] // Plant Cell.- 2001.-Vol.13, № 8.- P. 1749-1759.
6. Kashkush, K. Gene loss, silencing and activation in a newly synthesized wheat allotetraploid / K. Kashkush, M. Feldman, A.A. Levy // Genetics.- 2002.- Vol.160, №4.-P. 1651-1659.
7. Soltis, P.S. The role of genetic and genomic attributes in the success of polyploids / P.S. Soltis, D.E. Soltis // Proc. National Academy of Sciences USA.- 2000.- Vol. 97, №13.- P. 7051-7057.
8. Wendel, J.F. Genome evolution in polyploids / J.F. Wendel // Plant Mol. Biol. - 2000. -Vol. 42, № 1. - P. 225-249.
9. Comai, L. Genetic and epigenetic interactions in allopolyploid plants / L. Comai // Plant Mol. Biol. - 2000. - Vol. 43, № 2-3. - Р. 387-399.
10. Levy A. A., Feldman M. The impact of polyploidy on grass genome evolution // Plant Physiology. - 2002. - Vol. 130, № 4. - P. 1587-1593.
11. Feldman M., Levy A.A. Allopolyloidy - a shaping force in the evolution of wheat genomes / M. Feldman, // Cytogenet. Genome Res. - 2005. -Vol. 109, № 1-3. - P. 250-258.
12. Zohary, D. Hybridization between amphi-diploids and the evolution of polyploids in the wheat (Aegilops - Triticum) group / D. Zohary, M. Feldman // Evolution. - 1962. - Vol.16, № 1. -P. 44-61.
13. Цвелев, Н.Н. Система злаков (Poaceae) и их эволюция / Н.Н. Цвелев. - Л.: Наука, 1987.- 75 с.
14. Тетраплоидные тритикале (создание, цитогенетическое изучение и использование в селекции) / В.Е. Бормотов [и др.] - Минск: Наука и техника, 1990. - 136 с.
15. Gustafson, J.P. A tentative identification of chromosomes present in tetraploid triticales based on heterochromatin banding patterns / J.P. Gustafson, K.D. Krolow // Can. J. Genet. Cytol. - 1978. - V. 20, № 2. - P. 199-204.
16. Chromosome constitution of tetraplod triticale / A.J. Lukaszewski [et al.] // Z. Pflanzenzuchtg. -1984. - Bd. 93, № 3. -S. 222-236.
17. Chromosome pairing and aneuploidy in tetraploid triticale. Il.Unstabilized karyotypes / A.J. Lukaszewski [et al.] // Genome. - 1987. -V. 29, № 4. - P. 562-569.
18. Идентификация хромосом А и D геномов пшеницы с использованием замещений и перестроек между гомеологами у пшеницы и тритикале / Н.С. Бадаев [и др.] // Докл. Акад. Наук СССР. - 1983. - Т. 273, № 4. - С. 994-996.
19. Дубовец, Н.И., Структурные изменения хромосом пшеницы в кариотипе тетраплоидных тритикале / Н.И. Дубовец, В.Е. Бормотов // Докл. АН БССР. —1989. — № 12. — С. 1125—1127.
20. Сычева, Е.А. Тетраплоидные тритикале как объект для цитогенетических исследований I. Изучение роли индивидуальных хромосом пшеницы в регуляции мейотического спаривания / Е.А. Сычева, Н.И. Дубовец // Весщ НАН Беларуа, Сер.б1ял.навук. — 2003, № 2. — С. 52—55.
21. Сычева, Е.А. Цитогенетические особенности формирования и функционирования рекомбинантного генома тетраплоидных тритикале: дис. ... канд. биол. наук: 03.00.15 / Е.А. Сычева. — Минск, 2005. — 163 с.
22. Цитогенетический анализ тетраплоид-ных тритикале / Е.Д. Бадаева [и др.] // Докл. ВАСХНИЛ. — 1989. — № 1. — С. 2—4.
Дата поступления статьи 4 декабря 2008 г.
