CC BY
45
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 612.115.12:612.115.3
Рекомбинантный человеческий циклофилин A тормозит образование фибринового сгустка in vitro
Ю. А. Морозов1*, Л. М. Хромых2, И. И. Дементьева1, М. А. Чарная1, Н. Л. Куликова3,
Д. Б. Казанский2
Российский научный центр хирургии им. акад. Б.В. Петровского РАМН, 119991, Москва, Абрикосовский пер., 2
2Научно-исследовательский институт канцерогенеза Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН, 115478, Москва, Каширское ш., 24
3ОАО «Институт инженерной иммунологии», 142380, Московская обл., Чеховский район,
пос. Любучаны
*E-mail: moroz_111@rambler.ru
Поступила в редакцию 27.03.2012 г.
РЕФЕРАТ Хемотаксические свойства циклофилина А хорошо изучены в отличие от его гемостатических эффектов. Показано, что рекомбинантный человеческий циклофилин А (ЦфА), в отличие от гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, способен тормозить образование фибринового сгустка in vitro, нарушая тем самым пространственную динамику роста сгустка крови. Этот эффект кратковременный и дозонезависимый. Выдвинута гипотеза, согласно которой конформационные изменения тромбина в комплексе с ЦфА возможно опосредуют антикоагулянтное действие ЦфА на автоволновые процессы свертывания крови. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА рекомбинантный человеческий циклофилин А, пространственная динамика роста сгустка, антикоагулянтное действие.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ЦфА - рекомбинантный человеческий циклофилин А; ГКСФ - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор.
ВВЕДЕНИЕ
Циклофилин А - белок с молекулярной массой около 20 кДа, который проявляет цис-транс-изомеразную активность и имеет широкий спектр разнообразных функций. Циклофилин А продуцируется клетками тимуса и обладает хемотаксическим действием, регулируя миграцию стволовых клеток из костного мозга на периферию [1]. Активированные макрофаги также секретируют ЦфА, который привлекает зрелые моноциты, нейтрофилы, эозинофилы и активированные Т-клетки к очагу воспаления [2].
Однако участие этого белка в функционировании системы гемостаза изучено недостаточно. Известно, что гладкомышечные клетки сосудистой стенки секретируют ЦфА при гипоксии и окислительном стрессе, а при повреждении сосудистой стенки активированные тромбоциты способны выделять ЦфА [3], который, в свою очередь, стимулирует пролиферацию эндотелиоцитов [4] и таким образом способствует развитию регенеративных процессов.
В представленной работе изучено влияние in vitro рекомбинантного человеческого циклофилина А на рост фибринового сгустка.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Рекомбинантный человеческий ЦфА получали, используя клетки Escherichia coli BL21, трансформированные плазмидой pCyPAwt/pGEX-2TK, кодирующей слитый белок GST-CyPA. Генетическая конструкция использована с любезного разрешения М. Bukrinsky (Albert Einstein College of Medicine of Yeshiva University, США). Синтез GST-CyPA индуцировали, добавляя 0.2 мМ изопропил-P-D-тиогалактопиранозид до конечной концентрации 100 мкМ. Клетки осаждали центрифугированием, суспендировали в Na-K-фосфатном буфере (pH 7.3) и разрушали ультразвуком. Лизат клеток центрифугировали, надосадок наносили на колонку GSTrap FF («GE Healthcare»). Слитый белок GST-CyPA элюировали 50 мМ Tрис-HCl-буфером, pH 8.0, содержащим 10 мМ восстановленного глутатиона. Фракции, содержащие GST-CyPA, объединяли, переводили в раствор 10 мМ Tрис-HCl (pH 8.0) на колонке HiTrap Desalting («GE Healthcare») и наносили на колонку MonoQ 5 х 50 («GE Healthcare»). Элюцию проводили градиентом 1 М хлорида натрия (0-1 М) в 10 мМ Tрис-HCl, pH 8.0. Фракции, содержащие GST-CyPA, переводили диа-
Влияние инкубации в течение 30 мин и 3 ч богатой тромбоцитами плазмы с рекомбинантным человеческим циклофилином А на параметры пространственной динамики роста сгустка
Проба ЗРС, мин НСР, мин ССР, мин РС-30, мкм ПС, усл. ед.
Инкубация в течение 30 мин
Контроль 3.0 ± 1.6 53.3 ± 16.7 32.8 ± 13.1 868.0 ± 180.1 13679.0 ± 2395.0
Опыт 14.8 ± 5.7* 14.3 ± 6.2* 16.8 ± 7.2* 341.1 ± 114.3* 9116.0 ± 2086.0*
Инкубация в течение 3 ч
Контроль 1.0 ± 0.3 59.7 ± 4.8 37.0 ± 9.0 1329.0 ± 244.7 16182.0 ± 2797.0
Опыт 1.4 ± 0.6 61.8 ± 6.7 33.5 ± 5.2 1258.0 ± 189.8 13971.5 ± 3294.5
Примечание. ЗРС - задержка роста сгустка, НСР - начальная скорость роста, ССР - стационарная скорость роста, РС-30 - размер сгустка на 30-й мин роста, ПС - плотность сгустка.
*Значимость различий (р < 0.05) по сравнению с контролем.
лизом в Na-K-фосфатный буфер (pH 7.3) и добавляли раствор тромбина («Sigma-Aldrich») из расчета 1 ед. акт. на 1 мг слитого белка. Расщепление вели в течение 10 ч при 4°С. Смесь белков CyPA и GST разделяли на колонке GSTrap FF. Раствор CyPA освобождали от тромбина на колонке HiTrap Benzamidine FF («GE Healthcare»). Полноту реакции контролировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (SDS-ПААГ). Чистота используемого белка составила ~98%.
Влияние ЦфА in vitro на пространственную динамику роста сгустка изучали с использованием венозной крови здоровых доноров, полученную самотеком из периферической вены и стабилизированную 3.7% раствором цитрата натрия в соотношении цитрат : кровь = 1 : 9.
Пробы крови центрифугировали при 1500 об/мин в течение 7 мин. Плазму, богатую тромбоцитами, делили на две части. Первая часть служила контролем (К), во вторую часть (опыт - О) добавляли ЦфА в конечной концентрации 10 или 50 мкг/мл и инкубировали при 37оС в течение 30 мин и 3 ч при постоянном перемешивании для предотвращения оседания тромбоцитов. В качестве вещества сравнения использовали гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (ГКСФ) в конечной концентрации 20 мкг/мл.
По прошествии времени инкубации богатую тромбоцитами плазму центрифугировали при 13700 об/мин в течение 10 мин. Плазму без тромбоцитов использовали для изучения пространственной динамики роста сгустка в соответствии с инструкцией к прибору «Тромбоимиджер-2» (ООО «ГемаКор», Россия).
Регистрировали задержку роста сгустка, или lag-фазу (мин), начальную (мин) и стационарную (мин)
скорости роста сгустка, размер сгустка на 30-й мин роста (мкм), плотность сгустка (усл. ед.), спонтанное тромбообразование в объеме камеры.
Статистическую обработку результатов эксперимента проводили с использованием критерия Манна-Уитни. Значимыми считали различия при р < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Параметры пространственной динамики роста сгустка при инкубации богатой тромбоцитами плазмы с ЦфА в течение 30 мин и 3 ч представлены в таблице.
Как видно из таблицы, 30-минутная инкубация богатой тромбоцитами плазмы с ЦфА в конечной концентрации 10 мкг/мл статистически значимо тормозила пространственную динамику роста сгустка, т.е. ЦфА обнаруживал свойства вещества с гипокоа-гуляционной активностью. При этом в двух образцах контрольной группы зарегистрировано спонтанное тромбообразование в объеме измерительной камеры. Инкубация с ЦфА предотвращала развитие спонтанного тромбообразования в системе. Однако этот эффект был кратковременным, и через 3 ч различия в параметрах пространственной динамики роста сгустка исчезали (таблица).
Не выявлено дозозависимого влияния препарата на рост сгустка при инкубации проб богатой тромбоцитами плазмы с ЦфА в конечной концентрации 50 мкг/ мл. Параметры пространственной динамики образования сгустка были такими же, как при инкубации с ЦфА в конечной концентрации 10 мкг/мл. После 3 ч инкубации не наблюдали замедления роста сгустка.
ГКСФ не оказывал какого-либо влияния на величины определенных нами показателей, которые были сравнимы с величинами в контрольной группе.
ОБСУЖДЕНИЕ
В организме сгусток образуется не во всем объеме крови, а строго локально - только в небольшой зоне повреждения стенки кровеносного сосуда. При повреждении стенки сосуда в кровь экспонируется тканевой фактор - белок, иммобилизованный на мембране клеток сосудистой стенки, которые до повреждения закрыты слоем эндотелия. При этом диффузия факторов свертывания играет важную роль в процессе пространственного роста сгустка и его локализации. Отдельные патологии специфически влияют на активность компонентов системы свертывания, приводя к выраженным изменениям в различных фазах процесса. Нарушения в механизмах гемокоагуляции клинически проявляются либо кровотечением, либо тромбозом, либо их сочетанием.
Однако в значительной степени процесс тромбо-образования происходит в организме в пространственно неоднородных условиях. Поэтому роль отдельных реакций свертывания может проявляться по-разному в in vitro-экспериментах при перемешивании и in vivo [5].
Метод регистрации пространственной динамики роста сгустка основан на контакте крови с тканевым фактором в измерительной кювете с иммобилизованным тромбопластином [6]. Появление и пространственный рост сгустка от активатора регистрируется по светорассеянию методом темного поля. При этом можно измерять такие важные характеристики процесса, как скорость роста, размер сгустка, образование спонтанных сгустков - информацию, которая недоступна гомогенным методам [7]. Это позволяет одновременно и независимо регистрировать нарушения на всех стадиях процесса.
Нами установлено также (неопубликованные данные), что in vitro ЦфА в дозе 10 мкг не влияет на внешний и внутренний пути свертывания крови. Однако уже через 10 мин инкубации с ЦфА наблюдалось увеличение уровня анти-Ха-активности плазмы в 8 раз относительно контрольных значений. После инкубации в течение 30 и 60 мин с белком уровень анти-Ха-активности хотя и снижался, но в 3 раза превышал уровень в контроле. Аналогичные данные получены в модельных опытах на животных. Введение ЦфА в дозе 100 мкг интактным мышам Р815 сопровождалось статистически значимым повышением (в 3 раза) уровня ингибирования фактора Ха, а доза 200 мкг приводила к ингибированию фактора Ха, соответствующему 0.6 анти-Ха-Ед/мл. Представленные в данной статье результаты свидетельствуют о том, что ЦфА препятствует росту сгустка, замедляя скорость его образования через ингибирование
фактора Ха, а поскольку сгусток начинает расти не сразу и неравномерно, то возникновение тромба менее вероятно, поскольку в организме такой сгусток будет смываться током крови [8].
Система свертывания крови обладает пороговыми и автокаталитическими свойствами, поэтому ее поведение в пространстве может иметь много общего с активными средами. Атауллаханов и Гурия в 1994 г. выдвинули гипотезу, согласно которой пространственное (но не гомогенное) формирование сгустка происходит автоволновым образом [9]. Автоволно-вая фаза роста может быть нарушена при дефиците или ингибировании факторов внутреннего пути свертывания.
Автоволновое распространение тромбина не может тормозиться естественными ингибиторами, так как они не способны остановить автоволну в силу их однородного распределения в пространстве. Чтобы это произошло, нужно погасить автокаталитическое производство факторов свертывания. Гипотеза об ав-товолновом распространении процесса свертывания предполагает существование «двухавтоволнового» механизма остановки волны тромбина [10]. Считается, что в среде может запускаться вторая волна вещества, возникающего после появления тромбина и прекращающего его синтез. Если эта волна будет распространяться с большей скоростью, чем первая, то она сможет остановить движение первой волны.
К настоящему времени неизвестен ингибитор тромбина, который мог бы распространяться авто-каталитическим образом. Предполагается, что тромбин может существовать в про- и антикоагулянтной формах [11]. В прокоагулянтном состоянии тромбин высокоактивен по отношению к фибриногену и слабо - к белку С; а в антикоагулянтной форме (вследствие изменения конформации тромбина в комплексе с некоторыми веществами) наоборот, высокоактивен в отношении белка С и малоактивен в отношении фибриногена [12]. Наши данные о влиянии ЦфА на пространственную динамику роста сгустка позволяют выдвинуть гипотезу о возможном воздействии ЦфА на механизм автоволнового процесса свертывания крови.
ВЫВОДЫ
Рекомбинантный человеческий циклофилин А обладает выраженным дозонезависимым антикоагулянт-ным эффектом.
Рекомбинантный человеческий циклофилин А способен предотвращать спонтанное тромбообразование.
Антикоагулянтный эффект рекомбинантного человеческого циклофилина А сохраняется не более 2 ч.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Khromykh L.M., Kulikova N.L., Anfalova T.V., Muranova T.A., Abramov V.M., Vasiliev A.M., Khlebnikov V.S., Kazansky D.B. // Cell Immunol. 2007. V. 249. № 1. P. 46-53.
2. Xu Q., Leiva M.C., Fischkoff S.A., Handschumacher R.E., Lyttle C.R. // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 1168-1171.
3. Coppinger J.A., Cagney G., Toomey S., Kislinger T., Belton O., McRedmond J.P., Cahill D.J., Emili A., Fitgerald D.J., Maguire P.B. // Blood. 2004. V. 103. № 6. P. 2094-2104.
4. Lay A., Jiang X.M., Kisker O., Flynn E., Underwood A., Con-dron R., Hogg PJ. // Nature. 2000. V. 408. P. 869-873.
5. Tijburg P.N., Ryan J., Stern D.M., Wollitzky B., Rimon S., Rimon A., Handley D., Nawroth P., Sixma J.J., de Groot P.G. // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. № 18. P. 12067-12074.
6. Атауллаханов Ф.И., Гурия Г.Т. // Биофизика. 1994. Т. 39.
№ 1. С. 89-96.
7. Kondratovich A.Y., Pokhilko A.V., Ataullakhanov F.I. // Bio-chim. Biophys. Acta. 2002. V. 1569. № 1-3. P. 86-104.
8. Ованесов М.В. Влияние факторов внутреннего пути свертывания крови на пространственную динамику роста сгустка. М.: ГУ ГНЦ РаМн, 2002.
9. Атауллаханов Ф.И., Гурия Г.Т., Сафрошкина А.Ю. // Биофизика. 1994. Т. 39. № 1. С. 97-106.
10. Атауллаханов Ф.И., Волкова Р.И., Похилко А.В., Синау-ридзе Е.И. // Биофизика. 1994. Т. 39. № 4. С. 713-720.
11. Атауллаханов Ф.И. // Соросовский образовательный журн. 2000. Т. 6. № 7. С. 2-10.
12. Griffin J.H. // Nature. 1995. V. 378. № 6555. P. 337-338.
