CC BY
93
УДК 577.112.7
РЕКОМБИНАНТНЫЕ ЭЛАСТОМЕРНЫЕ БЕЛКИ КАК ОСНОВА ДЛЯ СОЗДАНИЯ НОВЫХ ТКАНЕИНЖЕНЕРНЫХ МАТРИКСОВ
Д.В. Гришин, Н.Н. Соколов
Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича, 119121, Россия, г. Москва, ул. Погодинская, 10, molbiol_ibm@inbox.ru
Целью настоящей статьи является обзор и систематизация имеющихся научных данных, касающихся технологии создания матриксов для тканевой инженерии на основе биоактивных и биоинертных материалов. Рассмотрены основные объекты тканевой инженерии, преимущества и недостатки распространённых, на сегодняшний день, биоинертных и биоактивных материалов, а также перспективы использования методов биотехнологии и генетической инженерии для устранения указанных недостатков. Обсуждаются собственные предварительные теоретические и научно-практические исследования, направленные на поиск оптимального биогенного материала в качестве стромы тканеинженерных графтов (англ. «graft» - привой, трансплантат). Проанализирован широкий спектр аминокислотных последовательностей, соответствующих эластомер-ным белкам из различных биологических источников, на основании чего охарактеризован ряд минимальных мотивов данных белков. Ил. 4. Библиогр. 52 назв.
Ключевые слова: тканевая инженерия; рекомбинантные белки; минимальный эластомерный мотив; триболин; строма матрикса; тканевые факторы роста.
RECOMBINANT ELASTOMERIC PROTEINS AS BASELINE
FOR CREATION OF NEW SCAFFOLDS FOR TISSUE ENGINEERING
D.V. Grishin, N.N. Sokolov
Institute of Biomedical Chemistry,
10, Pogodinskaya St., Moscow, 119121, Russia, molbiol_ibm@inbox.ru
The purpose of present article is the overview and systematization of existing scientific data concerning technology of new tissue engineering scaffolds design based on the bioactive and inert materials. The main objects of tissue engineering, advantage and lacks of the currently most commonly used bioactive and inert materials, and also prospects of the implementation of biotechnology and recombinant DNA technology methods for described shortcomings elimination are considered.
In the review preliminary theoretical and practical scientific investigations of our collective directed on search of an optimal biogenic scaffolds material are discussed.
A wide range of the amino acid sequences of elastomeric proteins from various biological sources were studied, on the basis of what a number of the minimal elastomeric motives of these proteins was characterized. 4 figures. 52 sources.
Key words: tissue engineering; recombinant protein; minimal elastomeric motif; tribolinum; scaffolds; tissue growth factors.
ВВЕДЕНИЕ
Несмотря на успехи, достигнутые в биоматериаловедении в настоящее время, подобные материалы все еще являются остродефицитными. В наибольшей степени этот дефицит ощутим в России. По данным программы развития биотехнологий до 2020 г. доля РФ на мировом рынке биоразлагаемых материалов составляет, на сегодняшний день, порядка 0,5% (http://Www. biorosinfo. т).
В мировой практике тканевого инжиниринга существует несколько разновидностей каркасных материалов, которые в самом общем виде можно классифицировать на а) биоинертные или нерезорбируемые материалы (окислы циркония, гидроксиапатит, полипропилен и т.п.) и Ь) биоактивные или резорбируемые материалы (коллаген, шелк, фибрин, полигликолевая кислота (ПГК), полимолочная кислота (ПМК) и
т.п.) [3,12].
Ряд существенных недостатков современных биоинертных материалов заставляют исследователей уделять большее внимание изучению возможностей биоактивных материалов. При этом требования к каркасам возрастают: они должны выступать уже не только в качестве некоего шаблона для размножения клеток, генерирующих специфическую новую ткань, но и рассасываться (резорбироваться) по мере ее роста, позволяя клеткам занять место дефекта.
Между тем, распространённые в настоящее время биоактивные материалы (коллаген, фибрин, фиброин, ПГК, ПМК) также имеют целый ряд недостатков (см. в разд. «общая характеристика материалов для тканевой инженерии...»), не позволяющих перейти к их широкомасштабному применению в медицинской практике [34].
Научно-исследовательская работа нашего коллектива, анонсируемая в настоящей статье, нацелена на использование методов биотехнологии, генной и белковой инженерии для создания новых биоактивных стромальных материалов, лишенных наиболее одиозных недостатков, а также на оптимизацию и усовершенствование собственно технологии получения эффективных биоактивных графтов для тканевой инженерии.
СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ
ИССЛЕДОВАНИЙ В ОБЛАСТИ
РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЫ
Современная биомедицинская наука предлагает несколько альтернативных путей восстановления или замены поврежденных или пораженных патологией тканей и органов:
1. трансплантацию;
2. имплантацию;
3. тканевую инженерию.
Трансплантация, по сути, является процессом изъятия жизнеспособного органа у одного индивидуума (донора) с перенесением его другому индивидууму (реципиенту). Если донор и реципиент принадлежат к одному и тому же виду, то говорят об аллотрансплантации; если к разным - о ксенотрансплантации. Если донор и пациент - однояйцовые близнецы, то речь идет об изотрансплантации. Ксено- и аллотранс-плантаты, в отличие от изотрансплантатов, очень часто подвергаются отторжению. Наиболее часто встречающимся в медицине видом трансплантации является аутотрансплантация, при которой донор и реципиент являются одним и тем же человеком. При этом виде трансплантации риск отторжения сводится к минимуму. В целом, механизм отторжения трансплантатов носит иммунологический характер, сходный с
реакцией организма на введение чужеродных агентов. Изотрансплантаты, взятые у генетически родственных особей, обычно не отторгаются. В экспериментах на животных производилась пересадка практически всех жизненно важных органов, однако далеко не всегда был достигнут желаемый результат [15,22].
Имплант - медицинское устройство, произведенное с целью замены или поддержания утраченной биологической структуры или функции. Медицинские импланты - это преимущественно искусственные устройства (в отличие от трансплантатов), которые являются пересаживаемой биологической тканью. Поверхности имплантов, контактирующих с телом, обычно выполняются из биомедицинского инертного материала, такого как титан, силикон или апатит в зависимости от того, какой из материалов является наиболее функциональным в данном конкретном случае [44].
Импланты порой могут содержать электронные элементы, например, кардиостимулятор, кохлеарные импланты и нейроимплантаты. Однако общей и наиболее важной проблемой для всех видов имплантов является стремление живого организма элиминировать чужеродную вставку, что достигается либо образованием фиброзной сумки, либо кальцификацией периметра импланта [25,32].
Тканевая инженерия, как обособленная дисциплина, начала свою историю в первой половине XX века. Фундаментом для её развития послужили теоретические и практические разработки по созданию «искусственных» органов и тканей и работы по трансплантации клеток и биологически активных компонентов на носителях для восстановления повреждений в различных тканях организма [29].
Таким образом, тканевая инженерия - это междисциплинарная отрасль, объединяющая в единое целое потенциал и методологию наук о жизни и медицины с основами инженерных дисциплин. Основные объекты тканевой инженерии - это клетки и матриксы.
Тканевая инженерия ориентирована на создание композитных конструкций, обеспечивающих восстановление, укрепление и улучшение функций тканей (рис. 1). Материалы, применяемые в тканевой инженерии, должны обладать спектром специальных свойств. Прежде всего, продукты деградации конструкции не должны быть токсичными, конструкция должна сохранять свою форму и обладать достаточной прочностью до тех пор, пока новая ткань организма-хозяина в месте имплантации полностью не восстановится, т.е. очевидно, что тканевая инженерия призвана не только пассивно восполнить ту или иную тканевую структуру при её
Рис. 1. Общие принципы тканевой инженерии
повреждении, но и мобилизовать внутренние регенеративные резервы самого организма, направляя их на восстановление данной ткани.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МАТЕРИАЛОВ ДЛЯ ТКАНЕВОЙ ИНЖЕНЕРИИ, ОСНОВНЫЕ ПРОБЛЕМЫ И ПРИНЦИПЫ СОЗДАНИЯ БИОАКТИВНЫХ ТКАНЕИНЖЕНЕРНЫХ МАТРИКСОВ
Круг материалов, используемых в восстановительной медицине, включает материалы природного и искусственного происхождения, среди которых следует выделить металлы, керамику, синтетические и естественные полимеры и др.
Материалы, предназначенные для контакта с различными средами живого организма и используемые для изготовления медицинских изделий и устройств, получили название «биоматериалы».
Целью тканевой инженерии является конструирование вне организма биофункциональных компонентов, которые могут быть использованы для регенерации поврежденных тканей и/или органов. Используемый в тканевой инженерии междисциплинарный подход направлен, в первую очередь, на создание новых биокомпозиционных каркасных материалов для восстановления утраченных функций отдельных тканей или органов [29].
В самом общем виде можно сказать, что в мировой практике тканевого инжиниринга распространены два основных вида каркасных материалов:
a) биоинертные или нерассасывающиеся материалы (окислы циркония, полиэтилен и т.п.);
b) биоактивные или рассасывающиеся материалы (коллаген, фиброин, фибрин, ПГК, ПМК [3,12].
Ряд существенных недостатков современных биоинертных материалов (малая биоде-градируемость, низкая универсальность, отсутствие клеточной и тканевой индуктивности, сложность обработки) заставляют исследователей сфокусировать своё внимание на изучении возможностей биоактивных материалов. При этом каркасы должны выступать не только в качестве некоего шаблона для размножения клеток, генерирующих специфическую новую ткань, но и полностью резорбироваться по мере роста новой ткани. Наиболее физиологичным представляется имплантирование «биокомпозита», состоящего из матрикса с уже частично сформированной ex vivo новой тканью, либо обработанного специфическими факторами роста целевой ткани. После имплантации такая матрица-графт должна сохранить свою структуру и функции в течение периода времени, необходимого для восстановления нормально функционирующей ткани в месте дефекта и
интегрировать с окружающими тканями.
Биоактивные материалы также имеют ряд недостатков, не позволяющих перейти к широкомасштабному их применению в медицинской практике [34]. К подобным недостаткам биоматериалов могут быть отнесены следующие:
■ иммуногенность (фиброин, коллаген, фибрин);
■ низкая клеточная и тканевая индуктивность;
■ невозможность равномерного распределения тканевых факторов роста в сетке такого матрикса;
■ сложная молекулярная структура и, по этой причине, сложности биотехнологического производства (фибрин, коллаген и т.п.);
■ гидролиз ПГК и ПМК в окружении живых тканей с образованием и снижением рН, что приводит к некрозу окружающих тканей;
■ вероятность заражения реципиента вирусными и прионными инфекциями в случае использования аутопсийного фибрина и коллагена.
В настоящее время тканевая инженерия всё чаще внедряет в свою практику методы генной и белковой инженерии. В своей работе мы применяем ряд новых биотехнологических приёмов, нацеливаясь при этом на оптимизацию, усовершенствование и повышение рентабельности технологии получения биоактивных материалов.
Затрагивая проблему рентабельности производства, следует отметить, что среди многочисленных проблем регенеративной медицины, помимо собственно биохимических и физико-химических недостатков используемых материалов, можно также выделить степень их доступности для пациентов, которая неразрывно связана с рентабельностью. Так, даже в странах-производителях, стоимость бесклеточных дермальных коллагеновых матриксов превышает 5 000 долл. на человека [9], а в случае апатит-коллагеновых графтов составляет 1000 долл. за 1 см2 материала [http://collagenmatrix dental.com/cart/index.php?main_page=index&cPat h=9], что не позволяет всерьёз говорить о доступности данных биомедицинских материалов для большинства нуждающихся в них пациентов.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БЕЛКОВ РАЗЛИЧНОЙ
ПРИРОДЫ В ПРОИЗВОДСТВЕ
МАТЕРИАЛОВ ДЛЯ ТКАНЕВОЙ
ИНЖЕНЕРИИ
Как уже было отмечено ранее, основными объектами тканевой инженерии являются клетки и матриксы (каркасы). Каркас или строма биомиметического графта может быть выпол-
нена из различных материалов, однако наиболее физиологичным и пластичным материалом, несомненно, являются белки и полипептиды.
На сегодняшний день основными стро-мальными биоматериалами являются коллаген, фибрин, фиброин и резилин.
Коллаген - это фибриллярный белок, составляющий основу соединительной ткани человека и животных. Почти 30% общего белка организма взрослого человека приходится на коллаген, т.е. 5-6% от массы тела.
Основной структурной единицей коллагена является тропоколлаген. Коллагеновое волокно представляет собой гетерогенное образование и содержит, кроме белка коллагена, другие компоненты. Одной из отличительных черт данного белка является то, что, помимо остатков стандартных незаменимых аминокислот, таких как глицин и пролин, в их структуре представлены и нестандартные модификации аминокислот, такие как, например, 4-гидрокси-пролин, гидроксилизин и 3-гидроксипролин [43].
Молекулярная масса тропоколлагена составляет около 280 кДа. Тропоколлаген представляет собой тример, состоящий из трех полипептидных цепей одинакового размера, которые сливаются в спиралевидный триплет (рис. 2,а). Тройная спираль стабилизируется многочисленными межцепочечными поперечными сшивками между лизиновыми и гидроксилизи-новыми остатками. Каждая полипептидная цепь тропоколлагена содержит около 1000 аминокислотных остатков. Таким образом, структурная единица коллагена имеет весьма большие размеры, в десятки раз превосходящие размер среднего белка.
Коллаген - внеклеточный белок, но он синтезируется в виде внутриклеточной молекулы-предшественника, которая перед образованием фибрилл зрелого коллагена подвергается существенной посттрансляционной модификации. Внеклеточные амино- и карбоксипротеаза про-коллагена удаляют соответственно аминокон-цевой и карбоксиконцевой пропептиды. Вновь образованные молекулы коллагена спонтанно собираются в коллагеновые фибриллы. В результате перекрестного связывания цепей и спиральных молекул фибрилл через основания Шиффа и альдольную конденсацию, образовавшиеся протофибриллы приобретают вид зрелых коллагеновых фибрилл [23].
Именно сложная структура и чувствительность коллагена к аминокислотным заменам не позволяют эффективно нарабатывать его в ре-комбинантном виде. И именно по этой причине основная масса используемого в медицинской практике коллагена имеет естественное происхождение, т.е. добывается из трупного мате-
риала, что чревато вероятностью заражения реципиента опасными инфекционными заболеваниями.
Фибрин - белок, образующийся из фибриногена под действием фермента тромбина. Данный белок является конечным продуктом свертывания крови, структурной основой тромба. Предшественник фибрина (фибриноген) -гликопротеин с молекулярной массой 340 кДа, содержащий две идентичные субъединицы, каждая из которых состоит из трех различных полипептидных цепей [33].
В молекуле фибриногена находятся 24 ди-сульфидных связи, три из которых объединяют 6 полипептидных цепей в ^концевых областях, формируя центральный домен.
Структура фибрина стабилизируется транспептидазой, или фактором ХШа, который в присутствии ионов кальция катализирует образование поперечных «сшивок» между антипараллельными гамма-цепями путем образования ковалентных изопептидных связей между Gln-398 одной цепи и Lys-406 другой. В связи с высокой сложностью строения фибрина (рис. 2,б), получение его в рекомбинантной форме, даже на субъединичном уровне, также не представляется возможным, поэтому, как и в случае с коллагеном, прибегают к выделению данного белка из биологического материала, а именно из крови человека и животных, что, в случае нарушения режимов стерилизации, также имеет потенциальную инфекционную опасность.
Фиброин. В последние годы интенсивно изучаются свойства белков шёлка паутины и шелка тутового шелкопряда в связи с возмож-
ностью использования их в качестве материалов медицинского назначения. Фиброин это фибриллярный белок из группы склеропротеи-нов, составляющий основную массу (около 65%) натурального шёлкового волокна, а также паутины [5]. Представляет собой вязкую жидкость, затвердевающую на воздухе в прочную нерастворимую нить. Волокно шёлка состоит из 2 нитей фиброина, окружённых оболочкой из другого белка - серицина [7,35,52]. Фиброин имеет высокую молекулярную массу - 300 кДа и содержит большое количество остатков аминокислот глицина, аланина, серина и тирозина [6,39,40]. Вторичная структура фиброина образуется за счёт антипараллельного расположения пептидных цепей и поддерживается множественными межмолекулярными водородными и дисульфидными связями (рис. 3, а). Следует отметить, что присутствие в составе фиброина белка серицина может иметь негативные последствия с медицинской точки зрения, так как данный компонент является сильным аллергеном для организма человека и животных. Однако, несмотря на эти недостатки, фиброин весьма перспективен в области медицины, так как нити фиброина сочетают в себе высокую механическую прочность с эластичностью: величина прочности на разрыв у них выше, чем у стали, а энергия разрыва больше, чем у кевлара и нейлона [24].
Резилин - это белок, отличающийся весьма высокой эластичностью и упругостью. Данный белок был впервые охарактеризован в середине прошлого века датским биологом Тор-келем Вайс-Фогом, который обнаружил его в
а) б)
Рис. 3. Трёхмерная структура молекул фиброина (а) и резилина (б)
«сухожилиях» стрекоз и крыловых сочленениях саранчи [8,13].
Вставки из резилина находятся в главных суставах прыгательных ног блох, саранчи, а также в системе ответственной за движение крыла у таких насекомых как чернотелки. Любопытно, что у взрослых насекомых ген выработки резилина замолкает и практически не экспрессируется, поэтому белок-эластомер, раз появившись, служит всю жизнь, показывая удивительную устойчивость к циклическим нагрузкам. Так, за жизнь некоторых насекомых, сочленения, прикрепляющие крылья к туловищу, срабатывают миллионы раз, и резилин, входящий в состав этих сочленений, нисколько не срабатывается, не «устает», не теряет своих свойств. Расправляясь, сжатый резилин отдает 97% запасенной энергии, белок эластин, входящий в состав связок у млекопитающих -85-90%, лучшая резина - лишь 80%. Белок резилин весьма стабилен: он сохраняет свою структуру и свойства и при воздействии низких температур, и при нагревании до 125 оС, на его свойства не влияют ни спирты, ни такие сильные денатурирующие агенты, как формалин [14].
По предварительным оценкам, основанным на изучении доменного и аминокислотного состава, данные белки способны превзойти по ряду параметров такие биоматериалы как коллаген и фиброин, широкомасштабное биотехнологическое производство которых пока весьма затруднительно. Такие ограничения связаны, прежде всего, с тем, что коллаген и фиброин не имеют ярко выраженных автономных эластомерных мотивов, проявляя свою функциональную активность лишь в полноразмерном виде, поэтому и должны быть экспрессиро-ваны как полноразмерные белки, чего практически невозможно достигнуть в прокариотиче-ских и даже в эукариотических системах экс-
прессии. Здесь возникает резонный вопрос: каким же может быть выход из этой патовой ситуации, ведь полноразмерный резилин также представляет собой весьма массивный белок с молекулярным весом 200кДа (рис. 3,б), с трудом экспрессирующийся в прокариотических системах. В решении данного вопроса на помощь приходит биоинформатика, одной из основных задач которой является поиск функциональных мотивов различных белков.
Одним из наиболее перспективных является мотив резилина насекомых рода чернотелок (ТпЪоНит), названный нами триболином (МЬоНпит). Эластомерный мотив данного белка замечателен, прежде всего, тем, что является минимальным структурно-функциональным элементом полноразмерного белка-резилина, в той или иной степени повторяющим его базовые свойства. С подобными мотивами уже возможно работать в таких направлениях как экспрессия в клетках Е.ооН, а также гибридизация на генно-инженерном уровне, с различными необходимыми белками и белковыми доменами. Всё это является залогом успешного молекулярного планирования и создания полипептидной стромы матриксов нового поколения. Эластомерный мотив триболин является основным объектом наших исследований. Он обладает потенциалом универсального и высоко рентабельного материала, который способен решить многие из перечисленных ранее проблем биоактивных матриксов, прежде всего за счёт возможности получения его рекомбинант-ных и гибридных гомологов.
ОПИСАНИЕ НОВЫХ НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ПЕПТИДНОЙ СТРОМЫ ТКАНЕИНЖЕНЕРНЫХ МАТРИКСОВ
Еиэюп-технология, гибридный триболин, факторы роста. Структура любого матрикса
для тканевой инженерии обычно включает в себя биогенную или абиогенную строму, факторы роста той или иной ткани и клетки пациента. В нашей работе, в качестве стромы матрикса, был выбран биогенный компонент - эластомерный белок триболин. Однако совершенно очевидно, что мало создать строму матрикса с оптимальной пористостью, необходимо ещё и обеспечить «привлекательность» матрикса для заселения его клетками и прорастания целевой ткани. Подобную «привлекательность» или, правильнее сказать, тканеиндуктивность стромы обеспечивают тканевые факторы роста, являющиеся триггерами, запускающими клеточный рост и пролиферацию по пути RAS/MAP-киназного каскада [38,47]. MAP-киназы - это серин либо треонин-специфичные протеинки-назы, которые, в ответ на внеклеточные стимулы, регулируют клеточную активность (клеточная дифференцировка, экспрессия генов, митоз и т.п.). Одним из важнейших участников этого каскада являются G-белки Ras (малые ГТФа-зы). Это группа мембрансвязанных белков, участвующих в передаче биогенного сигнала внутрь клетки. Также не менее важную роль в регуляции экспрессии генов, при всех проявлениях жизнедеятельности клеток, играют проте-инкиназы, активируемые митогенами (MAPK -mitogen activated protein kinases) [31]. После получения внеклеточных сигналов в виде белкового или небелкового воздействия на соответствующие поверхностные рецепторы, в клетках начинают развиваться каскады реакций фос-форилирования, завершающиеся специфической активацией или подавлением активности факторов транскрипции, деацетилаз гистонов или других регуляторных белков, что сопровождается изменением уровней экспрессии соответствующих генов [41,51].
В настоящее время для обеспечения тканевой индуктивности прибегают к простому пропитыванию сетки матрикса факторами роста целевой ткани. Но этот приём не решает проблему, так как в подобном случае не удаётся равномерно распределить фактор роста по всей внутренней поверхности матрикса. Для решения этого вопроса нами принята на вооружение Usion-технология, задачей которой является объединение на генно-инженерном уровне усеченного резилина и факторов роста различных тканей, что должно стать залогом успешного равномерного распределения тканевых факторов роста в губке матрикса.
Fusion-технология или технология слитных генно-инженерных конструкций представляет собой комплексный подход, заключающийся в гибридизации разно-функциональных белковых доменов и мотивов на генно-инженерном уров-
не [1,2,42]. Данный неординарный подход позволяет направленно влиять на фолдинг и некоторые базовые свойства белковых конструкций [10,11,27,30]. Использование подобной технологии, в сочетании со вспомогательными методами и приёмами, позволило нам разработать целый спектр рекомбинантных гомологов эластомерного белка триболина, объединяющих в одной рамке не только минимальный эластомерный мотив, но и сигнальные белковые молекулы, обладающие свойствами факторов роста тех или иных тканей организма человека и животных (EGF; FGF; NGF и т.п.). При физико-химической полимеризации, когда формируются перекрёстные сшивки в полученных рекомбинантных белках, факторы роста неминуемо окажутся равномерно распределенными в пористой структуре матрикса. В дальнейшем это должно обеспечить сокращение времени заживления повреждённой ткани, благодаря интенсификации процессов прорастания клеток целевой ткани в трёхмерной структуре матрик-са и его последующей резорбции.
ПОДХОДЫ К СОЗДАНИЮ БИОКОМПОЗИТОВ НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ЭЛАСТОМЕРОВ С ЗАДАННОЙ ПОРИСТОСТЬЮ И ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
Полипептид триболин обладает повторяющимися с определённым шагом кластерами аминокислотных остатков с химически активными боковыми радикалами (аргинин, глута-мин, аспарагин, лизин, тирозин). Такой аминокислотный состав позволяет применить в качестве основной стратегии полимеризации эла-стомерного рекомбинантного белка стратегию химической полимеризации при помощи гете-робифункциональных реагентов.
Кроме того, следует отметить, что при создании биокомпозитов зачастую возникает необходимость использования культур эукариотиче-ских клеток. В анонсируемой работе немаловажным моментом является изучение влияния разрабатываемых стромальных материалов на эффективность дифференцировки in vitro различных клеточных культур, в том числе нейро-нальных (НСК) и мезенхимальных стволовых клеток (МСК), в клетки целевой ткани.
Мезенхимальные клетки-предшественники, в рамках нашей работы, интересны своей способностью к дифференцировке, в соответствующих условиях микроокружения, в присутствии определённых факторов роста, в клетки с фенотипом и функциональными характеристиками остеобластов, адипоцитов, стромальных
Рис. 4. Способы перекрёстной сшивки белковых цепей: а-в - химические способы сшивки белков и аминокислот; г - биологический способ ковалентного объединения белков (адаптировано из [18] Arthritis Research and Therapy, 2007, 9 (3))
гемопоэтических клеток, хондроцитов или фиб-робластов [17,28,46,49], что является залогом создания функционального матриксно-клеточ-ного биокомпозита.
Говоря о работе с клетками и тканями различной этиологии нельзя не отметить тот факт, что восстановление различных тканей требует различной пористости тканеинженерного мат-рикса. Неординарность анонсируемого в нашей работе минимального эластомерного мотива триболина заключается в уникальном аминокислотном составе, который характеризуется чередованием, с определённым шагом, различных аминокислотных остатков с химически активными боковыми группами, что приводит к возможности целенаправленного планирования шага поперечной сшивки полипептидных цепей и, соответственно, возможности формирования матриксов с заданной величиной пор.
Так повторение в последовательности три-болина аминокислоты тирозин с шагом в 20-22 аминокислотных остатка делает возможным использование пероксидазы хрена в присутст-
вии H2O2 для оксидативной поперечной сшивки, итогом чего станет образование крупнопористого матрикса.
Выбор же в качестве основных мишеней для сшивки аминокислот аргинин, аспарагин и глутамин, чередующихся в триболине с шагом в 3-10 аминокислотных остатков, открывает возможности создания мелкопористой стромы матрикса, посредством использования в качестве основных инициаторов поперечной сшивки как стандартных химических кросслинкеров (глутаровый альдегид, генипин, карбодиимид), так и биохимического агента трансглутаминазы (рис. 4) [18].
ВЫВОДЫ
Одной из ключевых проблем биомедицины является проблема разработки новых восстановительных материалов, предназначенных для контакта со средой живого организма и необходимых для реконструктивной медицины. При этом наиболее востребованы специализированные биосовместимые материалы для
сформировавшегося в последние годы нового направления - клеточной и тканевой инженерии, связанного с разработкой искусственных органов. Проблема использования новых материалов в различных областях медицины, помимо фундаментальных вопросов изучения взаимодействия материала с тканями организма, представляет большой интерес для практической медицины. Исследования в области материалов медицинского назначения реализуются на стыке медицины, химии высокомолекулярных соединений, биотехнологии, биофизики, молекулярной и клеточной биологии и включают в себя следующие взаимосвязанные задачи:
■ разработку новых материалов, методов их модификации и переработки в специализированные изделия биомедицинского назначения;
■ изучение механизма взаимодействия биоматериалов с клетками, кровью и/или тканями;
■ оценку физико-химических свойств биоматериалов и изделий из них;
■ оценку медико-биологических свойств биоматериалов и изделий из них;
■ экспериментально-клиническое исследование и применение новых материалов и изделий.
Осуществляется непрерывный поиск технологий для создания биомиметических граф-тов, представляющих собой систему из материалов искусственного и/или биологического происхождения, включающих функциональные клетки тканей, либо специфически стимулирующие регенерацию соответствующих клеток в зоне имплантации.
Тканевая инженерия является одной из наиболее молодых отраслей в медицине, базирующейся в частности на принципах молекулярной биологии и генной инженерии. Используемый в ней междисциплинарный подход направлен в первую очередь на создание новых биокомпозитов для восстановления утраченных функций отдельных тканей или органов в целом [29]. Основные принципы данного подхода заключаются в разработке и применении при имплантации в поврежденный орган или ткань носителей из биоразлагаемых материалов, которые используются в сочетании с донорскими клетками и с биоактивными веществами. Это могут быть коллагеновые покрытия с собственными фибробластами пациента [16], синтетические и натуральные матриксы с подсаженными адипогенными стволовыми клетками [20, 21,48], соответствующим образом обработанные костные ксенографты или аллографты вкупе с мезенхимальными стволовыми клетками и необходимыми факторами роста [4,19,45]. Кро-
ме того, одним из серьезных требований к такого рода материалам-носителям является и то, что они должны обеспечивать надежную поддерживающую, то есть структурообразующую функцию в поврежденной области.
Следовательно, одной из основных задач тканевой инженерии в области лечения патологий тканей и органов является создание искусственных композитов, состоящих из алло- и/или ксеноматериалов в сочетании с биоактивными молекулами (морфогенетические белки, факторы роста и т.д.) и способных индуцировать формирование замещающей ткани. При этом такие материалы должны обладать рядом необходимых свойств, присущих целевой ткани [26,36,37,50]:
• поддержание объема в месте дефекта;
• тканеидуктивность, т.е. стимуляция ме-зенхимальных клеток к формированию зрелой ткани.
• биосовместимость, т.е. матриксы должны быть биодеградируемыми и не вызывать у рецепиента масштабных воспалительных реакций, что обычно достигается за счет снижения антигенных характеристик материала.
Выявленный нами минимальный эласто-мерный мотив резилина чернотелок и разрабатываемые на его основе рекомбинантные гомологи обладают всеми необходимыми качествами уникальной пептидной стромы для тканеин-женерных материалов. Использование реком-бинантного усечённого резилина имеет большую перспективу, ведь до сих пор с целью увеличения степени тканевой индуктивности мат-рикс необходимо фактически пропитывать факторами роста соответствующих тканей. При этом факторы распределяются неравномерно и легко вымываются из сетки матрикса, что значительно снижает тканеиндуктивный эффект. Предлагаемый же нами подход, при создании рекомбинантных гомологов резилина, заключается в гибридизации, на генно-инженерном уровне, эластомерного мотива данного белка (базовой стромы матрикса) и различных факторов роста, присутствие которых будет определяться тем, для восстановления какой ткани данный матрикс в дальнейшем будет служить. После физико-химической полимеризации факторы роста будут в достаточной степени фиксированы и равномерно распределены в сетке матрикса, что является необходимым условием для последующей равномерной регенерации целевой ткани. Цикл проводимых нами в настоящее время исследований должен показать, является ли это достаточным условием для инициации процессов пролиферации.
Рекомбинантные технологии получения подобных матриксов являются залогом не
только рентабельности их производства, но и их безопасности в отношении распространения вирусных и прионных инфекций, в виду того, что процесс создания подобных графов не будет зависеть от аутопсийного материала. Также немаловажно отметить, что отсутствие в структуре белков триболинового ряда характерных
сайтов узнавания для пептидаз, а также отсутствие гомологии данных белков с наиболее одиозными антигенами для организма человека и животных, свидетельствует о потенциально оптимальных показателях биосовместимости и биодеградируемости подобных материалов.
1. Гришин Д. В. Разработка новой химерной белковой конструкции для гидролиза бета-галактозидов // Антибиотики и химиотерапия. 2009. Т. 54, № 5-6. С. 3-7.
2. Гришин Д.В., Соколов Н.Н. Дефензины -естественные пептидные антибиотики высших эукариот // Биомедицинская химия. 2014. Т. 60, № 4. С. 438-447.
3. Хенч Л., Джонс Д. Биоматериалы, искусственные органы и инжиниринг тканей / пер. с англ. М.: Техносфера, 2007. 304 с.
4. Ai J., Ebrahimi S., Khoshzaban A., Jafarzadeh Kashi T.S., Mehrabani D. Tissue engineering using human mineralized bone xenograft and bone marrow mesenchymal stem cells allograft in healing of tibial fracture of experimental rabbit model // Iran Red. Crescent. Med. J. 2012. V. 14, № 2. P. 96-103.
5. Altman G.H., Diaz F., Jakuba C., Calabro T., Horan R.L. Silk-based biomaterials // Biomaterials. 2003. V. 24. P. 401-416.
6. Andersen S.O. Amino acid composition of spider silks // Comp. Biochem. Physiol. 1970. V. 35, № 3. P. 705-711.
7. Aramwit P., Kanokpanont S., De-Eknamkul W., Srichana T. Monitoring of inflammatory mediators induced by silk sericin // J. Biosci. Bioeng. 2009. V. 107, № 5. P. 556-561.
8. Bennet-Clark H.C. The first description of resilin // J. Exp. Biol. 2007. 210. Р. 3879-3881.
9. Blatnik J., Jin J., Rosen M. Abdominal hernia repair with bridging acellular dermal matrix-an expensive hernia sac // Amer. J. Surgery. 2007. V. 196, № 1. P. 47-50.
10. Boado R.J, Pardridge W.M. Genetic engineering of IgG-glucuronidase fusion proteins // J. Drug Target. 2010. V. 18, № 3. P. 205-211.
11. Boado R.J., Zhang Y., Xia C.F., Wang Y., Pardridge W.M. Genetic engineering, expression, and activity of a chimeric monoclonal antibody-avidin fusion protein for receptor-mediated delivery of biotinylated drugs in humans // Bioconjug. Chem. 2008. V. 19, № 3. P. 731-739.
12. Boccaccini A.R., Gough J. Tissue Engineering Using Ceramics and Polymers. Woodhead Publishing Ltd., 2007. 604 p.
13. Burrows M., Sutton G.P. Locusts use a composite of resilin and hard cuticle as an energy store for jumping and kicking // J. Exp. Biol. 2012.
ЖИЙ СПИСОК
V. 215. P.3501-3512.
14. Burrows M. Energy storage and synchronisation of hind leg movements during jumping in planthopper insects (Hemiptera, Issidae) // J. Exp. Biol. 2010. V. 213. P. 469-478.
15. Ching-Shwun Lin, Guiting Lin, Tom F. Lue. Allogeneic and Xenogeneic Transplantation of Adipose-Derived Stem Cells in Immunocompetent Recipients Without Immunosuppressants // Stem Cells Dev. 2012. V. 21, № 15. P. 2770-2778.
16. Cima L.G., Vacanti J., Vacanti C., Ingber D., Mooney D., Langer R. Tissue engineering by cell transplantation using degradable polymer substrate // J. Biomech. Eng. 1991. V. 113. P. 143-151.
17. Dennis J.E, Merriam A, Awadallah A, Yoo J.U, Johnstone B, Caplan A.I. A quadripotential mesenchymal progenitor cell isolated from the marrow of an adult mouse // J. Bone Miner. Res. 1999. V. 14. P. 700-709.
18. Englert C., Blunk T., Müller R., Schulze von Glasser S., Baumer J., Fierlbeck J., Heid I.M., Nerlich M., Hammer J. Bonding of articular cartilage using a combination of biochemical degradation and surface cross-linking // Arthritis Research and Therapy. 2007. V. 9, № 3. R 47.
19. Fleming J.E. Jr., Cornell C.N., Muschler G.F. Bone cells and matrices in orthopedic tissue engineering // Orthop. Clin. North Am. 2000. V. 31, № 3. P.357-374.
20. Flynn L., Prestwich G.D., Semple J.L., Woodhouse K.A. Adipose tissue engineering in vivo with adipose-derived stem cells on naturally derived scaffolds // J. Biomed. Mater. Res. A. 2009. V. 89, № 4. P. 929-941.
21. Flynn L., Woodhouse K.A. Adipose tissue engineering with cells in engineered matrices // Organogenesis. 2008. V. 4, № 4. P. 228-235.
22. Fraitzl C.R., Leunig M., Demhartner T.J., Sckell A., Ganz R., Hofstetter W. Development of transplanted fetal bones: differences between isografts and allografts in mice // Clin. Orthop. Relat Res. 2001. V. 382. P. 267-276.
23. Gelse K., Poschl E., Aigner T. Collagens-structure, function, and biosynthesis // Adv. Drug Deliv. Rev. 2003. V. 55. P. 1531-1546.
24. Hang Y., Zhang Y., Jin Y., Shao H., Hu X. Preparation of regenerated silk fibroin/silk sericin fibers by coaxial electrospinning // Int. J.
Biol. Macromol. 2012. V. 51, № 5. P. 980-986.
25. Hassler C., Boretius T., Stieglitz T. Polymers for Neural Implants // J Polymer Science-Part B: Polymer Physics. 2011. V. 49, № 1. P. 18-33.
26. Kneser U., Polykandriotis E., Ohnolz J., Heidner K., Grabinger L., Euler S., Amann K.U., Hess A., Brune K., Greil P., Stürzl M., Horch R.E. Engineering of vascularized transplantable bone tissues: induction of axial vascularization in an osteoconductive matrix using an arteriovenous loop // Tissue Eng. 2006. V. 12, № 7. P. 17211731.
27. Kreitman R.J. Chimeric fusion proteins--Pseudomonas exotoxin-based // Curr. Opin. Investig. Drugs. 2001, № 9 (2). P. 1282-1293.
28. Kukekov V.G, Laywell E.D, Suslov O, Davies K, Scheffler B, Thomas L.B, O'Brien T.F, Kusakabe M, Steindler D.A. Multipotent stem/ progenitor cells with similar properties arise from two neurogenic regions of adult human brain // Exp. Neurol. 1999. V. 156, № 2. P. 333-344.
29. Langer R., Vacanti J.P. Tissue engineering // Science. 1993. V. 260, № 5110. P. 920-926.
30. Leal M.T, Camacho A.G, Teixeira L.H, Bargieri D.Y., Soares I.S., Tararam C.A., Rodrigues M.M. Immunogenicity of recombinant proteins consisting of Plasmodium vivax circumsporozoite protein allelic variant-derived epitopes fused with Salmonella enterica Serovar Typhimurium flagellin // Clin. Vaccine Immunol. 2013. V. 20, № 9. P. 1418-1425.
31. Lebreton S., Boissel L., Moreau J. Control of embryonic Xenopus morphogenesis by a Ral-GDS/Xral branch of the Ras signalling pathway // J. Cell Sci. 2003. V. 116, № 22. P. 4651-4662.
32. Levy R.J., Schoen F.J., Anderson H.C., Hamsaki H., Koch T.H., Brown W., Lian J.B., Cumming R., Gavin J.B. Cardiovascular implant calcification: a survey and update // Biomaterials. 1991, № 12. P. 707-714.
33. Lugovskoy E.V., Gritsenko P.G., Kapustianenko L.G., Kolesnikova I.N., Chernishov V.I., Komisarenko S.V. Functional role of Bbeta-chain N-terminal fragment in the fibrin polymerization process // FEBS J. 2007. V. 274, № 17. P. 4540-4549.
34. O'Brien F.J. Biomaterials and scaffolds for tissue engineering // Materials Today. 2011. V. 14, № 3. P. 88-95.
35. Padamwar M.N., Pawar A.P., Daithankar A.V., Mahadik K.R. Silk sericin as a moisturizer: an in vivo study // J. Cosmet. Dermat. 2005. V. 4. P.250-257.
36. Reddi A.H. Morphogenetic messages are in the extracellular matrix: biotechnology from bench to bedside // Biochem. Soc. Trans. 2000. V. 28, № 4. P. 345-349.
37. Ripamonti U., Van Den Heever B.,
Crooks J., Tucker M.M., Sampath T.K, Rueger D.C, Reddi A.H. Long-term evaluation of bone formation by osteogenic protein 1 in the baboon and relative efficacy of bone-derived bone morphoge-netic proteins delivered by irradiated xenogeneic collagenous matrices // J Bone Miner Res. 2000. V. 15, № 9. P. 1798-809.
38. Rubio I, Rennert K, Wittig U, Wetzker R. Ras activation in response to lysophosphatidic acid requires a permissive input from the epidermal growth factor receptor // Biochem J. 2003. V. 376, № 3. P. 571-576.
39. Salamone J.C. Polymeric Materials Encyclopedia, Twelve Volume Set // CRC Press. 1996.
40. Sashina E. S., Bochek A. M., Novoselov N. P., Kirichenko D. A. Structure and solubility of natural silk fibroin // Russ. J. Appl. Chem. 2006. V. 79, № 6. P. 869-876.
41. Schindeler A., Little D.G. Ras-MAPK signaling in osteogenic differentiation: friend or foe? // J. Bone Miner. Res. 2006. V. 21, № 9. P. 13311338.
42. Schmidt S.R. Fusion Protein Technologies for Biopharmaceuticals: Applications and Challenges, Wiley, John and Sons, Incorporated, 2013. 672 p.
43. Schumacher M.A., Mizuno K., Bachinger H.P. The crystal structure of a collagen-like poly-peptide with 3(S)-hydroxyproline residues in the Xaa position forms a standard 7/2 collagen triple helix // J. Biol. Chem. 2006. V. 281, P. 2756627574.
44. Sennerby L., Roos J. Surgical determinants of clinical success of osseointegrated oral implants: a review of the literature // Int. J. Prosthodont. 1998. V. 11, № 5. P. 408-420.
45. Stewart K, Pabbruwe M, Dickinson S, Sims T, Hollander A.P., Chaudhuri J.B. The effect of growth factor treatment on meniscal chondrocyte proliferation and differentiation on polyglycolic acid scaffolds // Tissue Eng. 2007. V. 13, № 2. P. 271-280.
46. Tavassoli M, Minguell J.J. Homing of hemopoietic progenitor cells to the marrow // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1991. V. 196. № 4. P.367-373.
47. Tiensuu T., Larsen M.K., Vernersson E., Tuck S. Lin-1 has both positive and negative functions in specifying multiple cell fates induced by Ras/MAP kinase signaling in C. elegans // Dev. Biol. 2005. V. 286, № 1. P. 338-351.
48. Tholpady S.S, Aojanepong C, Llull R, Jeong J.H., Mason A.C., Futrell J.W., Ogle R.C., Katz A.J. The cellular plasticity of human adipocytes // Ann. Plast. Surg. 2005. V. 54, № 6. P.651-656.
49. Torres J., Prieto J., Durupt F.C., Broad
S., Watt F.M. Efficient differentiation of embryonic stem cells into mesodermal precursors by BMP, retinoic acid and Notch signaling // PLoS One. 2012. V. 7, № 4. e36405. doi: 10.1371/ jour-nal.pone.0036405.
50. Yannas I.V. Facts and theories of induced organ regeneration // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2005. V. 93. P. 1-38.
51. Yan D, Chen D, Im H.J. Fibroblast growth
factor-2 promotes catabolism via FGFR1-Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2 axis that coordinates with the PKCS pathway in human articular chondrocytes // J. Cell Biochem. 2012. V. 113, № 9. P. 28562865.
52. Zhaoming W, Codina R, Fernández-Caldas E, Lockey RF Partial characterization of the silk allergens in mulberry silk extract // J Invest Allergol Clin Immunol. 1996. V. 6. P. 237-241.
1. Grishin D.V. Design of a novel chimeric protein construction for hydrolysis of beta-galactosides. Antibiotiki i khimioterapiya - Antibiotics & Chemotherapy, 2009, no. 54(5-6), pp. 3-7. (In Russ.)
2. Grishin D.V., Sokolov N.N. Defensins are natural peptide antibiotics of higher eukaryotes. Biomeditsinskaya khimiya - Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry, 2014, no. 8(1), pp. 11-18. (In Russ.)
3. Hench L., Jones J. Biomaterials, artificial organs and tissue engineering. Woodhead Publishing Ltd., 2007. 304 p.
4. Boccaccini A.R., Gough J. Tissue Engineering Using Ceramics and Polymers. Woodhead Publishing Ltd., 2007. 604 p.
5. O'Brien F.J. Biomaterials and scaffolds for tissue engineering. Materials Today, 2011, vol. 14, no. 3, pp. 88-95.
6. Ching-Shwun Lin, Guiting Lin, Tom F. Lue. Allogeneic and Xenogeneic Transplantation of Adipose-Derived Stem Cells in Immunocompetent Recipients without Immunosuppressants. Stem Cells Dev., 2012, vol. 21, no. 15, pp. 2770-2778.
7. Fraitzl C.R., Leunig M., Demhartner T.J., Sckell A., Ganz R., Hofstetter W. Development of transplanted fetal bones: differences between isografts and allografts in mice. Clin. Orthop. Relat. Res., 2001, vol. 382, pp. 267-276.
8. Sennerby L., Roos J. Surgical determinants of clinical success of osseointegrated oral implants: a review of the literature. Int. J. Prosthodont., 1998, vol. 11, no. 5, pp. 408-420.
9. Levy R.J., Schoen F.J., Anderson H.C., Hamsaki H., Koch T.H., Brown W., Lian J.B., Cumming R., Gavin J.B. Cardiovascular implant calcification: a survey and update. Biomaterials, 1991, no. 12, pp. 707-714.
10. Hassler C., Boretius T., Stieglitz T. Polymers for Neural Implants. J Polymer Science. Part B: Polymer Physics, 2011, vol. 49, no. 1, pp. 1833.
11. Langer R., Vacanti J.P. Tissue engineering. Science, 1993, vol. 260, no. 5110, pp. 920926.
12. Blatnik J., Jin J., Rosen M. Abdominal hernia repair with bridging acellular dermal matrix -
an expensive hernia sac. Amer. J. Surgery, 2007, vol. 196, no. 1, pp. 47-50.
13. Schumacher M.A., Mizuno K., Bächinger H.P. The crystal structure of a collagen-like polypeptide with 3(S)-hydroxyproline residues in the Xaa position forms a standard 7/2 collagen triple helix. J. Biol. Chem, 2006, vol. 281, pp. 2756627574.
14. Gelse K., Poschl E., Aigner T. Collagens-structure, function, and biosynthesis. Adv. Drug Deliv. Rev., 2003, vol. 55, pp. 1531-1546.
15. Lugovskoy E.V., Gritsenko P.G., Kapustianenko L.G., Kolesnikova I.N., Chernishov V.l., Komisarenko S.V. Functional role of beta-chain N-terminal fragment in the fibrin polymerization process. FEBS J., 2007, vol. 274, no. 17, pp. 4540-4549.
16. Altman G.H., Diaz F., Jakuba C., Calabro T., Horan R.L. Silk-based biomaterials. Biomaterials, 2003, vol. 24, pp. 401-416.
17. Padamwar M.N., Pawar A.P., Daithankar A.V., Mahadik K.R. Silk sericin as a moisturizer: an in vivo study. J. Cosmet. Dermat., 2005, vol. 4, pp. 250-257.
18. Zhaoming W., Codina R., Fernández-Caldas E., Lockey R.F. Partial characterization of the silk allergens in mulberry silk extract. J. Invest. Allergol. Clin. Immunol., 1996, vol. 6, pp. 237-241.
19. Aramwit P., Kanokpanont S., De-Eknamkul W., Srichana T. Monitoring of inflammatory mediators induced by silk sericin. J. Biosci. Bioeng., 2009, vol. 107, no. 5, pp. 556-561.
20. Andersen S.O. Amino acid composition of spider silks. Comp. Biochem. Physiol., 1970, vol. 35, no. 3, pp. 705-711.
21. Salamone J.C. Polymeric Materials Encyclopedia, Twelve Volume Set. CRC Press, 1996.
22. Sashina E.S., Bochek A.M., Novoselov N.P., Kirichenko D.A. Structure and solubility of natural silk fibroin. Russ. J. Appl. Chem., 2006, vol. 79, no. 6, pp. 869-876.
23. Hang Y., Zhang Y., Jin Y., Shao H., Hu X. Preparation of regenerated silk fibroin/silk sericin fibers by coaxial electrospinning. Int. J. Biol. Macromol., 2012, vol. 51, no. 5, pp. 980-986.
24. Bennet-Clark H.C. The first description of resilin. J. Exp. Biol., 2007, vol. 210, pp. 3879-
3881.
25. Burrows M., Sutton G.P. Locusts use a composite of resilin and hard cuticle as an energy store for jumping and kicking. J. Exp. Biol., 2012, vol. 215, pp. 3501-3512.
26. Burrows M. Energy storage and synchronisation of hind leg movements during jumping in planthopper insects (Hemiptera, Issidae). J. Exp. Biol., 2010, vol. 213, pp. 469-478.
27. Tiensuu T., Larsen M.K., Vernersson E., Tuck S. Lin-1 has both positive and negative functions in specifying multiple cell fates induced by Ras/MAP kinase signaling in C. elegans. Dev. Biol., 2005, vol. 286, no. 1, pp. 338-351.
28. Rubio I., Rennert K., Wittig U., Wetzker R. Ras activation in response to lysophosphatidic acid requires a permissive input from the epidermal growth factor receptor. Biochem. J., 2003, vol. 376, no. 3, pp. 571-576.
29. Lebreton S., Boissel L., Moreau J. Control of embryonic Xenopus morphogenesis by a Ral-GDS/Xral branch of the Ras signalling pathway. J. Cell Sci., 2003, vol. 116, no. 22, pp. 46514662.
30. Yan D., Chen D., Im H.J. Fibroblast growth factor-2 promotes catabolism via FGFR1-Ras-Raf-MEK1 /2-ERK1 /2 axis that coordinates with the PKCS pathway in human articular chondrocytes. J. Cell Biochem., 2012, vol. 113, no. 9, pp. 2856-2865.
31. Schindeler A., Little D.G. Ras-MAPK signaling in osteogenic differentiation: friend or foe? J. Bone Miner. Res., 2006, vol. 21, no. 9, pp. 13311338.
32. Schmidt S.R. Fusion Protein Technologies for Biopharmaceuticals: Applications and Challenges. Wiley, John and Sons, Incorporated, 2013. 672 p.
33. Boado R.J., Pardridge W.M. Genetic engineering of IgG-glucuronidase fusion proteins. J. Drug Target., 2010, vol. 18, no. 3, pp. 205-211.
34. Boado R.J., Zhang Y., Xia C.F., Wang Y., Pardridge W.M. Genetic engineering, expression, and activity of a chimeric monoclonal antibody-avidin fusion protein for receptor-mediated delivery of biotinylated drugs in humans. Bioconjug. Chem., 2008, vol. 19, no. 3, pp. 731-739.
35. Kreitman R.J. Chimeric fusion proteinsPseudomonas exotoxin-based. Curr. Opin. Investig. Drugs, 2001, no. 9 (2), pp. 1282-1293.
36. Leal M.T., Camacho A.G., Teixeira L.H., Bargieri D.Y., Soares I.S., Tararam C.A., Rodrigues M.M. Immunogenicity of recombinant proteins consisting of Plasmodium vivax circumsporozoite protein allelic variant-derived epitopes fused with Salmonella enterica Serovar Typhimurium flagellin. Clin. Vaccine Immunol., 2013, vol. 20, no. 9, pp. 1418-1425.
37. Tavassoli M., Minguell J.J. Homing of hemopoietic progenitor cells to the marrow. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1991, vol. 196, no. 4, pp. 367-373.
38. Dennis J.E., Merriam A., Awadallah A., Yoo J.U., Johnstone B., Caplan A.I. A quadri-potential mesenchymal progenitor cell isolated from the marrow of an adult mouse. J. Bone Miner. Res., 1999, vol. 14, pp. 700-709.
39. Kukekov V.G., Laywell E.D., Suslov O., Davies K., Scheffler B., Thomas L.B., O'Brien T.F., Kusakabe M., Steindler D.A. Multipotent stem/progenitor cells with similar properties arise from two neurogenic regions of adult human brain. Exp. Neurol., 1999, vol. 156, no. 2, pp. 333-344.
40. Torres J., Prieto J., Durupt F.C., Broad S., Watt F.M. Efficient differentiation of embryonic stem cells into mesodermal precursors by BMP, retinoic acid and Notch signaling. PLoS One, 2012, vol. 7, no. 4, e36405. doi: 10.1371/journal .pone.0036405.
41. Englert C., Blunk T., Müller R., Schulze von Glasser S., Baumer J., Fierlbeck J., Heid I.M., Nerlich M., Hammer J. Bonding of articular cartilage using a combination of biochemical degradation and surface cross-linking. Arthritis Research and Therapy, 2007, vol. 9, no. 3, R47.
42. Cima L.G., Vacanti J., Vacanti C., Ingber D., Mooney D., Langer R. Tissue engineering by cell transplantation using degradable polymer substrate. J. Biomech. Eng., 1991, vol. 113, pp. 143151.
43. Flynn L., Woodhouse K.A. Adipose tissue engineering with cells in engineered matrices. Organogenesis, 2008, vol. 4, no. 4, pp. 228-235.
44. Tholpady S.S., Aojanepong C., Llull R., Jeong J.H., Mason A.C., Futrell J.W., Ogle R.C., Katz A.J. The cellular plasticity of human adipocytes. Ann. Plast. Surg., 2005, vol. 54, no. 6, pp. 651-656.
45. Flynn L., Prestwich G.D., Semple J.L., Woodhouse K.A. Adipose tissue engineering in vivo with adipose-derived stem cells on naturally derived scaffolds. J. Biomed. Mater. Res. A., 2009, vol. 89, no.4, pp. 929-941.
46. Fleming J.E.Jr., Cornell C.N., Muschler G.F. Bone cells and matrices in orthopedic tissue engineering. Orthop. Clin. North Am., 2000, vol. 31, no. 3, pp. 357-374.
47. Ai J., Ebrahimi S., Khoshzaban A., Jafarzadeh Kashi T.S., Mehrabani D. Tissue engineering using human mineralized bone xenograft and bone marrow mesenchymal stem cells allograft in healing of tibial fracture of experimental rabbit model. Iran Red. Crescent. Med. J., 2012, vol. 14, no. 2, pp. 96-103.
48. Stewart K., Pabbruwe M., Dickinson S., Sims T., Hollander A.P., Chaudhuri J.B. The effect
of growth factor treatment on meniscal chondrocyte proliferation and differentiation on polyglycolic acid scaffolds. Tissue Eng., 2007, vol. 13, no. 2, pp. 271-280.
49. Yannas I.V. Facts and theories of induced organ regeneration. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., 2005, vol. 93, pp. 1-38.
50. Reddi A.H. Morphogenetic messages are in the extracellular matrix: biotechnology from bench to bedsid. Biochem. Soc. Trans., 2000, vol. 28, no. 4, pp. 345-349.
51. Ripamonti U., Van Den Heever B., Crooks J., Tucker M.M., Sampath T.K, Rueger D.C, Reddi A.H. Long-term evaluation of bone for-
mation by osteogenic protein 1 in the baboon and relative efficacy of bone-derived bone morphogenetic proteins delivered by irradiated xenogeneic collagenous matrices. J. Bone Miner. Res., 2000, vol. 15, no. 9, pp. 1798-809.
52. Kneser U., Polykandriotis E., Ohnolz J., Heidner K., Grabinger L., Euler S., Amann K.U., Hess A., Brune K., Greil P., Stürzl M., Horch R.E. Engineering of vascularized transplantable bone tissues: induction of axial vascularization in an osteoconductive matrix using an arteriovenous loop. Tissue Eng., 2006, vol. 12, no. 7, pp. 17211731.
Поступила в редакцию 12 мая 2015 г.
