CC BY
82
УДК 500-599.57.088
Рекомбинантная форма TERT Hansenula polymorpha обладает ограниченной обратнотранскриптазной активностью
Е. М. Смекалова*, О. А. Петрова, М. Э. Зверева, О. А. Донцова
Химический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 3 *Е-mail: esmekalova@yahoo.com Поступила в редакцию 09.12.2011 г.
РЕФЕРАТ Теломераза - рибонуклеопротеидный комплекс, функция которого состоит в синтезе теломер, повторяющихся последовательностей, локализованных на концах эукариотических хромосом. Теломераза поддерживает стабильность генома эукариотических клеток за счет репликации концов хромосом. Структурно-функциональные исследования теломеразного комплекса существенно затрудняет сложность получения основной каталитической субъединицы теломеразы в рекомбинантной форме. В представленном сообщении описан метод выделения теломеразной обратной транскриптазы термотолерантных дрожжей Hansenula polymorpha, экспрессированной в клетках Escherichia coli. Функциональный тест на субстрате, моделирующем взаимодействие теломеразной РНК и теломеры, показывает, что полученный белок обладает ограниченной обратнотранскриптазной активностью.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА теломеразная обратная транскриптаза, рекомбинантные белки, термотолерантные дрожжи Hansenula polymorpha.
ВВЕДЕНИЕ
Теломераза представляет собой рибонуклеопротеидный комплекс, функция которого состоит в синтезе теломер - расположенных на концах хромосом повторяющихся последовательностей,неспособных реплицироваться с помощью механизма классической репликации. Теломераза активна в клетках, способных к неограниченному делению, таких, как половые и стволовые клетки, а также в большинстве (85%) типов злокачественных опухолей. Предполагается, что ингибирование каталитической функции теломеразы приведет к прекращению поддержания длины теломер, что отменит безграничный репликативный потенциал опухолевых клеток. Все это позволяет считать теломеразу универсальной мишенью для создаваемых противоопухолевых средств [1]. Основные компоненты теломеразы - белок, теломеразная обратная транскриптаза (ТЕИТ) и теломеразная РНК, по матрице которой осуществляется синтез теломерной последовательности [2]. Одна из главных трудностей, с которой сталкиваются при изучении теломеразы, состоит в низкой стабильности ее каталитической субъединицы, выделяемой в рекомбинантной форме [3]. Отсутствие данных о структуре теломеразы не позволяет провести докинг известных веществ с целью поиска потенциальных эффекторов этого фермента, а невозможность выделения полно-
размерной функциональной теломеразной обратной транскриптазы препятствует тестированию взаимодействий фармакологических агентов с мишенью. Единственная полноразмерная теломеразная обратная транскриптаза, которую к настоящему времени удалось выделить и закристаллизовать, это TERT Tribolium castaneum [4]. Отличительная особенность этого белка состоит в отсутствии N-концевого домена, характерного для других теломеразных обратных транскриптаз. Получены данные о структуре N-концевого домена теломеразной каталитической субъединицы Tetrahymena thermophila и ее РНК-связывающего домена [2, 5].
Использование термофильных организмов часто более перспективно для структурно-функционального изучения белков, так как они имеют более компактную пространственную организацию, что способствует стабилизации в растворе. Ранее мы идентифицировали теломеразную обратную транскриптазу термотолерантных дрожжей Hansenula polymorpha (hpTERT) и впервые показали, что hpTERT можно экспрессировать в клетках Escherichia coli и выделить рекомбинантный белок [6]. Нами разработан метод эффективного выделения hpTERT H. polymorpha, экспрессированного в E. coli. Мы использовали экспрессионные конструкции, позволяющие получить каталитическую субъединицу
теломеразы с различными аффинными метками либо на N-, либо на С-конце белка. Показано, что оптимальным для экспрессии и выделения hpTERT является вектор pET30aTEV, в котором открытая рамка считывания кодирует hpTERT с 6His- и S-тагами с N-конца. Мы провели тест, который подтвердил наличие обратнотранскриптазной активности у полученного белка, что доказывает его пригодность для функциональных и структурных исследований. Мы считаем, что данное сообщение будет полезно не только исследователям теломеразы, но и всем, кто сталкивался с проблемой получения рекомбинантных белков, нестабильных в растворимой форме.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Клонирование гена hpTERT в различные экспрессионные системы
Ген hpTERT клонировали с использованием следующих праймеров: 1) BamH1a/E2 - 5'-aaggatccaaggtt-tgatcagtatgttgatga-3', и E2/Pst1/Rev - 5'-tttctgcag-ttagaatgctttaagaagcga-3' - для получения плазмиды pCDF, где hpTERT слит с 6His-тагом с N-конца;
2) Nco1E2Fwd - 5'-aaaaaccatgggaaggtttgatcagtatgt-tgat-3', и E2Sal1Rev - 5'-tttttgtcgac gaatgctttaagaagc-gaac-3' - для получения pET33b+, где hpTERT слит с 6His-тагом с С-конца; 3) HpET30F - 5'-gacggagctc-gaattttattagaatgctttaagaagcgaac-3', и HpET30S - 5'-gt-attttcagggcgccatgaggtttgatcagtatgttgat-3' - для получения плазмиды pET30aTEV, где hpTERT слит с 6His- и S-тагами с N-конца. Плазмида pET30aTEV любезно предоставлена Даниелой Родэс (Кембридж, MRC LMB, Великобритания). Секвенирование ДНК проводили с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer.
Выделение и очистка рекомбинантного hpTERT
Клетки E. coli штамма BL21DE3, трансформированного плазмидой pCDF_hpTERT, либо pET33b_hpTERT, либо pET30_hpTERT, растили при 37°С до оптической плотности 0.1 — 0.3 (OD600), после чего индуцировали экспрессию белка 0.1 мМ изопропилтио-Р^-галактозидом (IPTG) и инкубировали при перемешивании в течение 12-16 ч при 16°С. Клетки собирали центрифугированием при 5000 об/мин и замораживали в жидком азоте, разрушали с помощью дисмембратора (2000 об/мин, 2 раза по 30 с), что способствовало меньшей денатурации белка в процессе выделения. Разрушенные клетки ресуспендировали в буфере А: 50 мМ NaH2PO4 (pH 7), 200 мМ NaCl, 10% глицерин, 10 мМ Р-меркаптоэтанол, 0.05% Tвин-20. Клеточный де-
брис отделяли с помощью центрифугирования при 15000 об/мин в течение 20 мин. Затем инкубировали клеточный лизат с Ni-NTA-агарозой в течение 30 мин при 4°С, аффинный сорбент отделяли от не-связавшейся фракции белков центрифугированием при 3000 об/мин с последующим декантированием супернатанта. Ni-NTA-агарозу промывали трижды буфером А, содержащим 50 мМ имидазол. Белок hpTERT, связавшийся с аффинным сорбентом, элюировали буфером А с 300 мМ имидазолом.
При проведении дополнительной очистки с помощью ионообменной хроматографии на SP-сефарозе препарат, полученный на предыдущем этапе, разбавляли до суммарной концентрации солей 150 мМ, добавляли предварительно уравновешенную в буфере Б (50 мМ NaH2PO4 (pH 7), 100 мМ NaCl, 10% глицерин, 10 мМ Р-меркаптоэтанол, 0.05% Твин-20) SP-сефарозу (~1 мл на 5 мл лизата) и инкубировали смесь в течение 30 мин при 4°С. Затем промывали буфером, содержащим 50 мМ NaH2PO4, 200 мМ NaCl, 10% глицерин, 10 мМ Р-меркаптоэтанол, 0.05% Твин-20. Связавшуюся фракцию белков смывали градиентом концентрации NaCl (0.1-1 М) в аналогичном буфере. В полученный образец добавляли глицерин (до 30%), замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С.
Проверка функциональности очищенного hpTERT в системе in vitro
Тест на функциональность hpTERT проводили в системе, содержащей 50 мМ Tрис-HCl, 1 мМ DTT (ди-тиотреитол), 1 мМ спермидин, 50 мкМ dCTP, 5 мкМ субстрат (использовали РНК-олигонуклеотид 5'-cgc-caccccgccaccc-3', ДНК-олигонуклеотиды 5'-cgccac-cccgccaccc-3', 5'-ggcgggcggggtg-3'), 3.75 мкМ [a-32P]-dGTP (800 Ки/ммоль), 5 мкМ hpTERT. Дуплексы (ДНК-ДНК либо ДНК-РНК) формировали предварительно отжигом соответствующих олигонуклеотидов. Реакция продолжалась в течение 30 мин при 37°С, после чего смесь обрабатывали протеиназой K (0.3 мг/мл) и переосаждали в спирте. Продукты реакции разделяли с помощью гель-электрофореза в 15% денатурирующем полиакриламидном гене (ПААГ). Радиоактивный сигнал детектировали с помощью системы Phosphorimager.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖдЕНИЕ
Ген белка hpTERT клонировали под T7-промотор в три различные системы экспрессии с целью последующего выделения белка из клеток E. coli:
1) pCDF с 6His-тагом на N-конце белка hpTERT,
2) pET33b+ с 6His-тагом на С-конце белка hpTERT,
3) pET30aTEV с 6His- и S-тагами на N-конце белка hpTERT. Подобное расположение тагов с разных сто-
Л
100
85
70
60
50
40
pCDF_hpTERT_N
116
60
45 35 25
116
60
45
35
25
pET33b+_hpTERT_C
pET30aTEV_hpTERT
Рис. 1. Результаты экспрессии и аффинного выделения рекомбинантной теломеразной обратной транскриптазы H. polymorpha из клеток E. coli, трансформированных различными генно-инженерными конструкциями. Л -hpTERT в векторе pCDF с 6His-тагом на N-конце белка; Б - hpTERT в векторе pET33b+ с 6His-тагом на С-конце белка; В - hpTERT в векторе pET30aTEV с 6His- и S-тагами на N-конце белка. Образцы клеток до и после индукции экспрессии IPTG, а также образец элюции hpTERT с Ni-NTA-агарозы проанализировали методом электрофореза в 10% ПААГ в денатурирующих условиях. Положение зоны, соответствующей hpTERT, отмечено стрелкой.
рон белка обусловлено возможностью сворачивания концов аминокислотной цепи внутрь белковой глобулы, с чем может быть связано снижение эффективности аффинной хроматографии. S-таг представляет собой небольшую последовательность (4 кДа), которая может использоваться для стабилизации белков в растворе. Экспрессию белков индуцировали IPTG, белки очищали с помощью металл-хелатной хроматографии на №-ПТА-агарозе. Результаты выделения белков, экспрессированных с использованием различных конструкций, представлены на рис. 1. hp-ТЕИТ детектируется во всех образцах, элюированных с №-ПТА-агарозы. Это говорит об успехе выбора термотолерантных дрожжей в качестве источника каталитической субъединицы теломеразы. Однако при использовании векторов pCDF и рЕТ33Ь+ и при расположении тага как с П-, так и с С-конца (рис. 1А,Б), вместе с целевым белком на смоле выделяется значительное количество примесей. Нужно отметить, что соотношение целевой белок-примеси лучше при использовании конструкции рЕТ33Ь+ с 6His-тагом на С-конце белка, что, скорее всего, отражает закрытую ориентацию П-концевой области hpTЕRT. Выделение белка с использованием S-тага (конструкция pЕT30aTЕV) дает принципиально лучший результат (рис. 1В). Очевидно, что хорошо структурированный небольшой П-концевой S-таг значительно повышает стабильность растворимой формы белка. Белок был выделен и дополнительно очищен с помощью ионообменной хроматографии на SP-сефарозе (рис. 2). Конечные характеристики полученного белкового препарата - концентрация 5
170
130
100
70
55
40
35
16
Рис. 2. Экспрессия, выделение и очистка рекомбинантной hpTERT, полученной из клеток E. coli, трансформированных вектором pET30aTEV_hpTERT. Дорожки 1 и 2 - белки суммарных клеточных лизатов E. coli до и после индукции IPTG. Образец в дорожке «hpTERT » соответствует белковому препарату, полученному с помощью дополнительной очистки посредством аффинной хроматографии на Ni-NTA-агарозе и ионообменной хроматографии на SP-сефарозе. Анализ проводили методом электрофореза в 10% ПААГ в денатурирующих условиях.
мг/мл, выход - 5 мг/л клеточной культуры E. coli, содержание примесей не более 1%.
Функциональность полученного белка мы подтвердили с помощью сконструированной нами in vitro-системы. Теломеры H. polymorpha состоят из 18-23 повторов (5'-GGGTGGCG-3') [7]. На основании этих данных можно предположить состав матричного участка теломеразной РНК и смоделировать ДНК-олигонуклеотид, представляющий теломеру. Таким образом, система содержала очищенную рекомбинантную каталитическую субъединицу теломеразы; субстрат, представляющий собой гибридный
Б
В
1
2
3
Л
5'
РНК
а
і
с с gcggg
ДНК
Субстрат РНК/ДНК/
ДНК ДНК ДНК
hpTERT
+ - + - + -
с с g с і
5'
1 2 3 4 5 6
Б
Рис. 3. Проверка функциональной активности hpTERT, выделенной из клеток E. coli, трансформированных вектором pET30aTEV_hpTERT. А - Схема РНК-ДНК-дуплекса, используемого в качестве субстрата для hpTERT в реакции обратной транскрипции; Б — продукты реакции с участием hpTERT (добавление белка в реакционную смесь обозначено «+», те же компоненты без добавления белка обозначены «-» над рисунком) и различных субстратов (тип субстрата указан над рисунком) проанализированы методом электрофореза в 15% ПААГ в денатурирующих условиях. Для визуализации продуктов удлинения ДНК-олигонуклеотида в реакционной смеси присутствует [a-32P]dGTP. Зона, соответствующая по подвижности исходному ДНК-олигонуклеотиду, отмечена стрелкой. Отсутствие явных продуктов удлинения ДНК-олигонуклеотида во всех дорожках, кроме первой, свидетельствует о получении активной hpTERT в растворимой форме.
РНК-ДНК-дуплекс со свободным З'-концом (рис. 3А); смесь нуклеотидов, в которой для визуализации удлинения олигонуклеотида использовали [a-32P]dGTP. В качестве контроля использовали аналогичный ДНК-ДНК-дуплекс либо одноцепочечную теломе-разную ДНК. Поскольку каталитическая субъединица теломеразы является обратной транскриптазой, такие субстраты не могут использоваться hpTERT для удлинения. Кроме того, каждую реакцию проводили в присутствии и в отсутствие hpTERT (рис. 3Б). На дорожке 1 (рис. 3Б) можно наблюдать специфичный сигнал, соответствующий присоединению dGTP к ДНК-олигонуклеотиду в РНК-ДНК-дуплексе. Эта зона отсутствует в системах с другими субстратами и в отсутствие белка, что исключает участие полимераз E. coli в данной реакции. ДНК-РНК-дуплекс, используемый в реакции, спланирован таким образом, что теоретически в этой системе возможно присоединение трех нуклеотидов. Сигналы, соответствующие присоединению второго и третьего нуклеотидов, можно также видеть на дорожке 1 рис. 3Б, однако их интенсивность намного ниже. Скорее всего, это связано с отсутствием в системе полноразмерной теломераз-ной РНК, необходимой для реконструкции теломераз-ной активности in vitro. Тем не менее присоединение даже одного нуклеотида говорит о наличии у белка специфичной обратнотранскриптазной активности и о сохранении им функциональной структуры.
Таким образом, конструкция pET30aTEV с hpTERT, где 6His- и S-аффинные таги расположены
с N-конца белка, может быть использована для получения рекомбинантной функциональной каталитической субъединицы теломеразы H. polymorpha. Это открывает новые возможности для определения структуры теломеразной обратной транскриптазы и изучения механизма ее работы.
Мы благодарим Даниелу Родэс (MRC LMB, Кембридж, Великобритания) за предоставленную плазмиду pET30aTEV.
Работа поддержана Министерством образования и науки РФ (P1390 № 02.740.11.07.06, 16.512.11.2108) и Российским фондом фундаментальных исследований (гранты № 11-04-01310-а и 11-04-12051-ofi-m-2011, ПНР 5.13).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Zvereva M.I., Shcherbakova D.M., Dontsova O.A. // Biochemistry (Mosc.). 2010. V. 75. № 75. P. 1563-1583.
2. Wyatt H.D., West S.C., Beattie T.L. // Nucl. Acids Res. 2010.
V. 17. № 38. P 5609-5622.
3. Jacobs S.A., Podell E.R., Wuttke D.S., Cech T.R. // Protein Sci. 2005. V. 8. № 14. P 2051-2058.
4. Gillis A.J., Schuller A.P., Skordalakes E. // Nature. 2008.
V. 7213. № 455. P. 633-637.
5. Jacobs S.A., Podell E.R., Cech T.R. // Nat. Struct. Mol. Biol. 2006. V. 3. № 13. P. 218-225.
6. Smekalova E.M., Petrova O.A., Zvereva M.I., Dontsova O.A. // CSHL meeting «Telomeres&telomerase». 2009. P 161.
7. Sohn J.H., Choi E.S., Kang H.A., Rhee J.S., Rhee S.K. // J. Bacteriol. 1999. V. 3. № 181. P. 1005-1013.
