CC BY
65
УДК 577.352.465
Регуляция депо-управляемых кальциевых каналов белками семейства Homer в клетках А431
А. В. Шалыгин1, М. А. Рязанцева1, Л. Н. Глушанкова1, И. Б. Безпрозванный2, Г. Н. Можаева1, Е. В. Казначеева1*
1 Учреждение Российской академии наук Институт цитологии РАН, 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий просп., 4, Россия
2Юго-Западный медицинский центр Техасского университета, 75235, Даллас, США *E-mail: evkazn@hotmail.com Поступила в редакцию 29.08.2010 г.
РЕФЕРАТ Адаптерные белки семейства Homer играют важную роль в кальциевой сигнализации в различных типах клеток. В данной работе в экспериментах по регистрации одиночных каналов на изолированных фрагментах плазматической мембраны (inside-out) разобщение белков Homer с их белками-мишенями специфически активирует каналы I . , но не каналы I . В аналогичных условиях инозитол-1,4,5-
1 А 1 ^ min max ^
трисфосфат может активировать оба типа каналов. Короткие (1a) и длинные (1c) изоформы белков Homer по-разному влияют на каналы I . . Белок Homer 1a, в отличие от белка Homer 1c, активирует каналы I . .
1 ^ min 1 ^ min
Таким образом, нами показано, что в клетках А431 депо-управляемые каналы I . регулируются белками Homer.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА депо-управляемые каналы, Homer, A431, IP3R, кальциевая сигнализация.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ SOC - депо-управляемые каналы (store-operated channels); mGluR - метаботроп-ный глутаматный рецептор; IP3 - инозитол-1,4,5-трисфосфат; IP3R - рецептор инозитол-1,4,5-трисфосфата; RyR - рианодиновый рецептор; UTP - уридинтрифосфат; GST - глутатион^-трансфераза.
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время большое внимание уделяется исследованиям кальциевой сигнализации в элек-троневозбудимых клетках, так как изменения концентрации ca2+ в цитоплазме регулируют огромное количество внутриклеточных процессов. Концентрация ca2+ в цитоплазме может увеличиться как за счет выброса ca2+ из внутриклеточных кальциевых депо, так и за счет входа ca2+ из внеклеточной среды. В электроневозбудимых клетках вход ca2+ в основном происходит через депо-управляемые каналы (store-operated channels, SOc) [1]. Депо-управляемые каналы активируются в ответ на опустошение кальциевых депо. В разных тканях были описаны депо-управляемые каналы с различными биофизическими характеристиками, что предполагает различный молекулярный состав таких каналов [1]. Несмотря на то что основные белки, участвующие в депо-управляемом входе ca2+, известны, непонятным остается механизм колокализации этих белков.
В нервных клетках описаны адаптерные белки семейства Homer, которые связывают в единый макро-молекулярный комплекс метаботропный глутамат-ный рецептор (mGluR) плазматической мембраны c
рецептором инозитол-1,4,5-трисфосфата (IP3R) эн-доплазматического ретикулума [2]. Позже было показано, что Homer может взаимодействовать с белками TRPc [3, 4], кальциевой АТФазой, рианодиновым рецептором (ГуГ) и другими белками [5]. Более того, в нервных клетках адаптерные белки Homer и Shank образуют сетеподобную структуру, которая организует постсинаптические белки [6]. На N-конце белков Homer расположен домен EVH1, позволяющий им узнавать свои мишени, а именно аминокислотную последовательность PPXXF (пролин, пролин, две любые аминокислоты, фенилаланин). Существуют длинные и короткие изоформы белков Homer (рис. 1А). Длинная изоформа на С-конце имеет домен coil-coiled, позволяющий образовывать олигомеры. У короткой изоформы, образующейся при альтернативном сплайсинге, этот домен отсутствует [5]. Длинные изоформы образуют тетрамеры с параллельной укладкой С-концов и четырьмя доменами EVH1; такая структура позволяет им колокализовать белки кальциевой сигнализации [7]. Поскольку короткие изоформы не могут олигомеризоваться, то они являются негативными регуляторами функции длинных Homer. Также было показано, что Homer не только
регулирует колокализацию белков, но и может модулировать активность mGluR [8], ионных каналов RyR [9] и TRPC [3, 4].
Было выдвинуто предположение, что белки Homer могут участвовать и в регуляции SOC. Предыдущие исследования, подтверждающие эту гипотезу, проводились с помощью техники patch clamp в конфигурации whole-cell или флуоресцентных измерений внутриклеточной концентрации кальция [3, 4]. Однако эти методы позволяют оценить лишь суммарный вход кальция в клетку. Поскольку в клетках сосуществуют различные типы депо-управляемых кальциевых каналов, то оставалось неизвестным, какие конкретно типы депо-управляемых каналов регулируются белками семейства Homer. Цель настоящей работы заключалась в исследовании роли белков семейства Homer в регуляции депо-управляемых кальциевых каналов в клетках А431.
экспериментальная часть
Клетки
Клетки эпидермоидной карциномы человека A431 (из коллекции клеточных культур Института цитологии РАН) культивировали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и антибиотиков (100 мкг/мл пенициллина, 100 ед./мл стрептомицина). За 2-4 сут до начала эксперимента клетки высевали на фрагменты покровных стекол (3 х 3 мм).
Материалы
Для культивирования клеток использовали среду DMEM (ICN), сыворотку крови эмбрионов телят (FCS, GIBCO BRL, США), сыворотку крови эмбрионов крупного рогатого скота (FBS, GIBcO BRL, США), ге-нетицин G-418 (Geneticin, GIBCO BRL, США). В работе также применяли глутатион-сефарозу (Phar-macia, Швеция); 1,5-изопропилтио^^-галактозид (1,5 isopropylthio-ß-D galactoside, IPTG, Pharmacia, Швеция); инозитол-!,4,5-трисфосфат (IP3) (LC Laboratories, США); уридинтрифосфат (UTP, Cal-biochem, Германия); HEPES, Тритон Х-100 (Sigma, США), EGTA (Fluka, Швейцария); антитела к GST (Sigma, США), вторичные антитела (кроличьи и мышиные) (Sigma, США); антитела к Homer 1bc (Santa Cruz, США). Поликлональные антитела (pAb) к IP3R первого типа T443 были описаны ранее [10]. Синтез пептидов PPKKFR и PPKKRR был заказан в фирме «Диафарм» (Россия).
Метод локальной фиксации потенциала (patch clamp)
Во всех экспериментах потенциал внеклеточного раствора принимали за нулевой.
В конфигурации inside-out внутриклеточный раствор (камера) содержал (в мМ): 140 K-глутамат, 5 NaCl, 1 MgCl2, 10 HEPES-K, pH 7.4, 2 EGTA-K и 1.13 CaCl2 (pCa 7). Раствор пипетки содержал (в мМ): 105 BaCl2, 10 Tris-HCl (pH 7.3). Присутствие ионов Ва2+ способствовало предотвращению активации кальцийзависимых и блокированию потенциалзависимых калиевых каналов. Электрическое сопротивление заполненных раствором пипеток составляло 8-20 МОм.
В конфигурации whole-cell внутрипипеточный раствор содержал (в мМ): 145 NMDG аспартата, 10 Cs-EGTA, 10 Cs-HEPES, pH 7.3, 1.5 MgCl2 и 4.5 CaCl2 (pCa 7.0). Внеклеточный раствор содержал (в мМ): 140 NMDG аспартата, 10 BaCl2, 10 Cs-HEPES, pH 7.3. Для конфигурации whole-cell вытягивались пипетки, сопротивление которых после оплавления составляло 3-5 MОм. Во всех опытах whole-cell на мембране поддерживался потенциал, равный 0 мВ. С периодом в 5 с управляющий потенциал менялся по следующей схеме. Сначала подавался потенциал -100 мВ в течение 60 мс, затем следовало пилообразное изменение потенциала (voltage ramp) от -100 до 100 мВ в течение 600 мс, после чего потенциал возвращался к 0 мВ. Токи whole-cell нормализовались относительно емкости клетки, которая отражает клеточный размер. Среднее значение клеточной емкости составляло 21 ± 4 пФ (общее число опытов n = 25).
Регистрацию токов проводили с помощью усилителя Axopatch 200B (Axon Instruments, США). Сигнал оцифровывали на частоте 5000 Гц с помощью платы АЦП L 305 (L-Card, Россия). Для анализа и представления данных по измерениям токов одиночных каналов низкой проводимости осуществляли дополнительную фильтрацию (80-100 Гц). Амплитуды токов одиночных каналов определяли по записям токов и по амплитудным гистограммам. Для количественной оценки степени активности каналов использовали величину NP0, т.е. произведение количества проводящих каналов (N) в данном фрагменте записи на величину вероятности открытого состояния (Р0), которая определялась из соотношения P0 = I/Ni, где I - среднее значение тока через мембранный фрагмент на данном временном интервале, i - амплитуда тока открытого канала.
Для оцифровки и анализа записей использовали программное обеспечение, написанное В.А. Алексеенко, и пакеты программ pClamp 6.0.4, Microcal Origin 6.0, Microsoft Excel.
Электрофорез и иммуноблоттинг (ИБ)
Белковые пробы разделялись с помощью электрофореза в 8% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Гель либо окрашивали Кумасси, либо
переносили белки из него на мембрану, которую проявляли с помощью специфических антител на интересующие нас белки.
Экспрессия и очистка рекомбинантных белков GST-Homer 1c и GST-Homer 1а
Клетки Escherichia coli BL-21(DE3) трансформировали плазмидами pGEX-2T-Homer1A и pGEX-2T-HomerlC (любезно предоставленными М.М. Соловьевым из университета Оксфорда, Великобритания). Экспрессию рекомбинантных белков индуцировали 1 мМ IPTG. Затем бактерии разрушали и очищали химерные белки GST-Homer на глутатион-сефарозе. Полученные белки хранили при 4оС. Степень очистки белка проверяли с помощью электрофореза и им-муноблоттинга с использованием поликлональных антител к GST и Homer.
Клеточный лизат
Клетки A431 в чашке диаметром 10 см лизировали в течение 10 мин при 4оС в 1 мл раствора, содержащего 150 мМ NaCl, 20 мМ Tris-HCl (pH 7.6), 1 мМ EDTA, 1 мМ EGTA, 1% Тритон X-100, 0.5% NP40, 10% глицерин, 0.5 мМ PMSF, с добавлением коктейля ингибиторов протеиназ (PIC, Hoffmann-La Roche AG, Швейцария). Лизат трижды пропускали через шприц, затем центрифугировали с ускорением 22000 g при 4°C в течение 30 мин и отбирали супернатант, который впоследствии использовали в опытах.
Эксперименты pull-down (PD)
К 25 мкл глутатион-сефарозы со связанными на ней химерными белками GST-Homer добавляли лизаты клеток А431 и инкубировали на переворотном шей-кере при 4оС в течение 12-24 ч. Реакцию проводили в буфере PBS с 1% Тритоном Х-100. В ряде экспериментов инкубацию проводили в присутствии IP3. После этого сефарозу промывали 3 раза по 1 мл PBS с 1% Тритоном Х-100 (на сефарозе оставался белок GST-Homer и связавшиеся с ним белки). Наличие IP3R в пробах проверяли методом иммуноблоттинга с использованием поликлональных антител к IP3R.
результаты и обсуждение
Разобщение белков Homer с белками-мишенями, вызванное пептидом PPKKFR, активирует вход кальция в клетках А431
Результаты иммуноблоттинга показали, что в клетках А431 экспрессируются длинные изоформы белков Homer (рис. 1Б). Домен EVH1 белков Homer узнает в белках-мишенях аминокислотную последовательность PPXXFR, где Х - любая аминокислота (рис. 1А) [2]. Чтобы определить роль адаптерных
белков семейства Homer в регуляции кальциевых рецептор- или депо-управляемых каналов, мы использовали синтетический пептид PPKKFR. Ранее было показано, что аналогичный пептид вызывает диссоциацию комплекса, образованного белком Homer с метаботропным глутаматным рецептором [2].
В контрольных экспериментах мы использовали пептид PPKKRR, где замена фенилаланина на аргинин отменяла узнавание пептида доменом EVH1. Для выяснения роли белков Homer в регуляции входа кальция в клетки А431 мы использовали метод локальной фиксации потенциала в конфигурации whole-cell. Интегральный вход Са2+, регистрируемый в условиях внутриклеточного диализа PPKKFR-или PPKKRR-содержащими растворами, сравнивали с интегральным депо-управляемым входом кальция, активированным уридинтрифосфатом.
Внутриклеточный диализ раствором, содержащим 1 мкМ PPKKFR, приводил к активации селективного кальциевого тока со средней максимальной амплитудой в 1.3 ± 0.1 пА/пФ (n = 5) (рис. 2А). Если раствор в пипетке содержал пептид PPKKRR, ток не развивался (n = 10). Последующее добавление 100 мкМ UTP к таким клеткам приводило к развитию тока (n = 5) (рис. 2А). Амплитуда тока, вызванного uTP, составля-
Л
EVH1
Coil-coiled
Homer 1a
Homer 1c
----KW4WW4 Homer 1c
-----PPXXF-------
Б кДа
-50
> фт
- 37 “20
Рис. 1. В клетках А431 экспрессируются длинные изоформы белков семейства Homer. А - Схема структуры белков семейства Homer. Б - Иммуноблоттинг лизата клеток А431, проявленный моноклональными антителами к Homer 1bc. Справа отмечены положения молекулярных маркеров.
ла в среднем 1.8 ± 0.3 пА/пФ, то есть была больше, чем амплитуда тока, активированного пептидом PPKKFR (рис. 2Б). Потенциал реверсии токов, активированных пептидом PPKKFR, был выше, чем у токов в ответ на UTP. Таким образом, каналы, активированные пептидом PPKKFR, были селективнее для ионов Са2+, чем каналы, активированные uTP (рис. 2Б).
Полученные нами данные согласуются с опубликованными ранее работами других авторов, предположивших взаимосвязь между белками Homer и депо-управляемым входом Са2+ в электроневозбудимые клетки [3, 4].
Ранее в клетках А431 нами было описано несколько типов чувствительных к uTP кальциевых каналов, токи через которые имели разный потенциал реверсии [11]. Мы предположили, что различия в амплиту-
100 мкМ UTP
в 1 мкМ PPKKFR
1 мкМ PPKKFR
1 мкМ PPKKRR, 100 мкМ UTP
- 2 пА/пФ
50 мВ
Ь*
Рис. 2. Записи токов, индуцированных пептидами PPKKFR или PPKKRR в экспериментах whole-cell. А - Развитие во времени токов при потенциале -80 мВ, в присутствии пептида PPKKFR (серые квадраты) или PPKKRR (черные квадраты) в регистрирующей пипетке. Момент добавления UTP отмечен стрелкой сверху. Стрелками а и b отмечены максимальные значения токов. Б - Усредненные вольт-амперные характеристики токов, индуцированных пептидом PPKKFR или UTP. Усреднение проводилось для максимального значения токов whole-cell, которые отмечены стрелками а и b на панели А.
де токов и селективности каналов в ответ на пептид PPKKFR и на UTP связаны с тем, что стимуляция клеток UTP активирует несколько типов кальциевых каналов, тогда как пептид PPKKFR активирует не все типы каналов.
К отделению белков Homer от белков-мишеней, вызванному пептидом PPKKFR, чувствительны каналы I . , но не каналы I
min max
Чтобы исследовать, какие кальциевые каналы, экспрессируемые в клетках А431, ответственны за токи, активируемые диссоциацией комплекса, образованного Homer с белками-мишенями, мы поставили эксперименты в конфигурации inside-out. В экспериментах inside-out на клетках А431 встречаются два типа депо-управляемых каналов: I . и I [11]. Электро-
^ «/ 1 min max L J 1
физиологические характеристики этих каналов различны, что позволяет легко идентифицировать их по экспериментальным записям токов. Каналы I
1 min
обладают малой проводимостью (1.2 пСм) и высокой селективностью для двухвалентных катионов. Каналы I обладают большей, чем I , проводимостью
max ^ ’ mm7 1 ^
(18 пСм), но при этом их селективность меньше.
В конфигурации inside-out добавление 100 нМ пептида PPKKFR с цитоплазматической стороны мембранного фрагмента приводило к активации входящего тока (рис. 3А). Оказалось, что основные элек-трофизиологические свойства активируемых каналов (кинетика работы, проводимость и потенциал реверсии) совпадают с характеристиками каналов I . , описанными нами ранее [11 — 18]. Этот факт позволяет сделать вывод о том, что разъединение белков Homer с белками-мишенями, вызванное пептидом PPKKFR, приводит к активации каналов I , в клетках А431, что согласуется с полученными ранее в нашей лаборатории данными на клетках НЕК293 [12]. Каналы I активировались пептидом PPKKFR в 43% случаев (n = 60) (рис. 3А). Контрольный пептид PPKKRR (не приводящий к отделению молекул Homer от мишеней) не активировал каналы ни в одном из 36 опытов, причем последующее добавление PPKKFR в том же эксперименте активировало каналы Imin в 42% опытов (n = 26) (рис. 3Б). Пептид PPKKFR не вызывал активацию каналов I - другого типа депо-управляемых каналов в клетках А431 (n = 60).
В аналогичных экспериментах добавление 2.5 мкМ инозитол-1,4,5-трисфосфата (IP3) с цитоплазматической стороны мембраны в экспериментах insideout активировало каналы I в 32% и каналы I в 8%
1 min max
опытов (n = 80) (рис. 3В, Г), что согласуется с нашими предыдущими результатами [11]. При потенциале в -70 мВ амплитуды токов через каналы Imin составляли 0.18 пА, тогда как амплитуды токов через каналы I составляли 1.7 пА (рис. 3А-Г).
max
Б
Л
100нМPPKKFR
-70 мВ'
0.6 пА| 50 с 0
-0.18 пА -0.36 пА
400 мс
2.5 мкМ IP,
-70 мВ
0.5 пА
■HUAifltlkiUINUáJiMkÉuiiu
гЧ|И*|р
40 с
0
-0.18 пА
100 нМ PPKKFR
-70 мВ
100 нМ PPKKRR
**!■
0.5 пА
|""2ЇЇ
0
-0.18 пА
-70 мВ
2 пА
щптг
500 мс
2.5 мкМ IP,
20 с 0
-1.65 пА
500 мс
2 с
Рис. 3. Пептид PPKKFR активирует каналы I , но не I . A -
1 • min max
Добавление 100 нМ PPKKFR с цитоплазматической стороны мембранного фрагмента (конфигурация inside-out, потенциал на мембране -70 мВ) приводит к активации каналов Imin. Внизу показан фрагмент записи тока в развернутом временном масштабе.
Б - Добавление 100 нМ контрольного пептида PPKKRR не активирует токи, тогда как последующее добавление 100 нМ пептида PPKKFR активирует каналы I . В, Г -Добавление 2.5 мкМ IP3 активирует каналы Imin (В) и каналы Imax (Г). Примеры записей токов через одиночные каналы на изолированном фрагменте мембраны при потенциале, равном -70 мВ.
Б
В
Таким образом, нарушение связи белков Homer с белками-мишенями, вызванное пептидом PPKKFR, приводит к активации каналов I , тогда как каналы I в клетках А431 не чувствительны к этому пепти-
max ^ J
ду. Мы не знаем, регулируются ли белками Homer два других типа депо-управляемых каналов клеток А431 - I и ICRAC, поскольку эти каналы не встречаются (или не различимы) в конфигурации inside-out.
Данные по регистрации активности одиночных каналов хорошо согласуются с результатами экспериментов whole-cell. Поскольку UTP активирует все типы депо-управляемых каналов у клеток А431, а пептид PPKKFR не активирует по крайней мере каналы I , это означает, что пептид вызывает частичную активацию кальциевых каналов в конфигурации whole-cell. Этот факт объясняет разницу в величинах зарегистрированных интегральных токов. Поскольку каналы I
max
менее селективны, чем каналы I . , то UTP-вызванный
min
интегральный ток проявляет меньшую селективность.
Каналы I . активируются изоформой Homer 1a, но не Homer 1c
Среди белков Homer есть две принципиально разные группы [5]. У длинных изоформ белка (таких, как Homer 1с) на С-конце находится домен coil-coiled, который позволяет им образовывать гомоолигомеры. Отсутствие домена coil-coiled у коротких изоформ (таких, как Homer 1а) не позволяет им формировать олигомерные комплексы (рис. 1А). Чтобы исследовать действие коротких и длинных изоформ на активность депо-управляемых каналов в А431, мы использовали
рекомбинантные белки Homer, полученные из бактерий E. coli, трансформированных плазмидой GST-Homer. Функциональную активность выделенных таким образом белков Homer 1а и Homer 1с мы проверяли по их способности связывать IP3R1 в экспериментах pull-down.
Мономерная изоформа белков Homer 1а в концентрации 100 нМ активировала кальциевые каналы в 30% экспериментов inside-out (n = 101) (рис. 4А). Вольт-амперная характеристика каналов, активированных белком Homer 1а, совпадала с вольт-амперной характеристикой каналов I . , активированных UTP, опу-
1 min7 1 7
стошением депо или IP3 в клетках А431 или HEK293 [11, 13-18]. Проводимость каналов, активированных белком Homer 1а, составила 1.3 пСм. Длинная изоформа Homer 1с в концентрации 100 нМ не активировала каналы (n = 58), в то время как последующее добавление Homer 1а приводило к активации каналов Imin в 27% экспериментов (n = 44) (рис. 4Б). Ни Homer 1а, ни Homer 1с не активировали каналы I .
1 max
Из полученных данных можно сделать вывод
о том, что разные изоформы Homer неодинаково действуют на каналы I в А431, причем мономерные белки Homer 1а активируют, а длинные изоформы Homer 1с не активируют каналы. Аналогичное действие различные изоформы белков Homer оказывают на mGluR [8] и каналы TRPC [3, 4], но не на каналы RyR [19, 20], которые активируются как длинными, так и короткими изоформами Homer, причем длинные изоформы активируют RyR первого типа даже сильнее, чем короткие изоформы.
А 100 нМ Homer 1a
-70 мВ
Б
100 нМ Homer 1с 100 нМ Homer 1a
-70 мВ
Рис. 4. Белок Homer 1а активирует каналы I . А - Добавление 100 нМ белка Homer 1а с цитоплазматической стороны мембранного фрагмента (конфигурация inside-out, потенциал на мембране -70 мВ) приводит к активации каналов Imin. Внизу представлена запись тока в расширенном масштабе времени. Б - 100 нМ Homer 1с не активирует каналы, тогда как последующее добавление 100 нМ Homer 1а активирует каналы Imin. Внизу представлена запись тока в расширенном масштабе времени.
Для TRPC было предложено следующее объяснение действия белков Homer, которое, по-видимому, подходит и для каналов I . . Поскольку белки Homer 1с могут формировать олигомеры, а короткие изоформы Homer 1а, у которых нет coil-coiled-домена, не могут, было выдвинуто предположение, что олигомерные комплексы блокируют активность каналов, а активирует каналы разобщение с олигомерами Homer [3, 4]. Наши электрофизиологические эксперименты с пептидами и рекомбинантными белками показывают, что не белок Homer 1а сам по себе, а именно нарушение взаимодействия олигомерных комплексов Homer с белками-мишенями необходимо для активации каналов I . . Можно предположить, что при отделении олигомерных комплексов Homer меняется характер взаимодействия между кальциевым каналом и другими белками, в том числе IP3R. Такое разобщение может вызываться пептидом PPKKFR, короткой изоформой Homer 1а или IP3 (см. ниже). Известно, что белки Homer 1 не влияют
А 2.5 мкМ IP3
100 нМ PPKKFR -------------------------
-70 мВ
-------------
1 пА I
50 с
Б
2.5 мкМ IP3
100 нМ PPKKFR
-70 мВ
В
2.5 мкМ IP3
100 нМ Homer 1a
-70 мВ
0.5 пА|_____
5 с
Рис. 5. Отщепление нативных белков Homer и действие IP3 не аддитивны при активации каналов Imin. А - Активность каналов I , вызванная 100 нМ PPKKFR, не увели-
min •
чивается при последующем добавлении 2.5 мкМ IP3.
Б - Приложение 100 нМ PPKKFR с цитоплазматической стороны мембраны активирует каналы I . Последующее добавление 2.5 мкМ IP3 вызывает активность каналов I . В - Активность каналов I , вызванная 100 нМ
max min'
Homer 1а, не меняется при добавлении 2.5 мкМ IP3.
на метаболизм фосфоинозитидов, в частности не вызывают увеличение концентрации IP3 и не могут вызывать выброса из IP3 чувствительных кальциевых депо [21]. Таким образом, можно утверждать, что Homer активирует депо-управляемые каналы за счет непосредственного воздействия на канал плазматической мембраны, но не за счет дополнительного выброса из кальциевых депо. Следовательно, несмотря на то, что каналы I . являются депо-управляемыми в клетках А431, они, по-видимому, могут функционировать и по депо-нечувствительному механизму - в случае, когда они активируются при диссоциации комплекса, образованного белками Homer с белками-мишенями.
Воздействие IP3 и разобщение нативных белков Homer с белками-мишенями влияют на работу каналов Imin не аддитивно
Поскольку каналы I регулируются как IP3, так и белками Homer, то возникает вопрос, адди-
тивно ли их действие на эти каналы. Добавление
2.5 мкМ IP3 к мембранным фрагментам с PPKKFR-индуцированной активностью обычно не приводило к дальнейшему увеличению активности каналов (10 из 13 опытов) (рис. 5А). В аналогичных экспериментах с рекомбинантным белком Homer 1а аппликация IP3 также не изменяла активность каналов (рис. 5В). Однако в нескольких опытах добавление IP3 активировало каналы I (рис. 5Б). В экспериментах, где пептид PPKKFR или рекомбинантный белок Homer 1а не вызывал активность каналов I , IP также
min 3
не активировал каналы. Таким образом, мы показали, что отщепление нативных белков Homer и действие IP3 не аддитивны. Эти данные позволяют предположить, что каналы Imin регулируются IP3 и белками Homer по одному сигнальному пути.
IP3 нарушает взаимодействие белков Homer с IP3R1
В клетках А431 в основном экспрессируется IP3R первого типа (Глушанкова, неопубликованные данные). Как сообщалось ранее, в этих клетках каналы
Imin, по-видимому, регулируются конформационным сопряжением с IP3R первого типа [15, 17]. В нашей работе мы показали, что белки Homer участвуют в регуляции Imin. Данные рентгеноструктурного анализа IP3R указывают на близкое пространственное расположение мотива, узнаваемого белками Homer, и домена, связывающего IP3 [22]. Также было показано, что IP3 может вызывать диссоциацию комплекса Homer с IP3R третьего типа [4]. В наших экспериментах pull-down мы обнаружили, что IP3 может нарушать взаимодействие IP3R первого типа с белками Homer 1а или Homer 1с (рис. 6А, Б). Эти результа-
- + 10 мкМ IP
кДа 250
ИБ: pAb-IP3R1
кДа
-HP3R1 250 "
+ 10 мкМ IP,
IP3R1
ИБ: pAb-IP3R1
75 ____
50 -ШШШ ИБ: pAb-GST
GST-Homer 1c
50 •— щ *- GST-Homer 1а
ИБ: pAb-GST
PD: GST-Homer
Рис. 6. IP3 ослабляет взаимодействие белков Homer с IP3R1. А, Б - Результаты pull-down-экспериментов. IP3R1 инкубировался с GST-Homer 1с (А) или GST-Hom-er 1а (Б) в отсутствие или в присутствии 10 мкМ IP3.
ты хорошо согласуются с данными экспериментов inside-out, показывающими, что действие IP3 и действие белка Homer 1а или пептида PPKKFR не аддитивны.
Таким образом, в данной работе впервые исследована регуляция нативных депо-управляемых каналов белками семейства Homer. Полученные результаты расширяют представления о механизмах организации компонентов депо-управляемого входа. •
Работа выполнена при финансовой поддержке Программы Министерства образования и науки (ГК 02.740.11.5007) и (ГК П332), Программы Президиума РАН “Молекулярная и клеточная биология”, грантов РФФИ (№ 09-04-12035, 10-0401002, 10-04-00956), гранта “Ведущие научные школы” (НШ-3796.2010.4).
Б
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Parekh A.B., Putney J.W., Jr. // Physiol. Rev. 2005. V. 85. № 2. P. 757-810.
2. Tu J.C., Xiao B., Yuan J. P., et al. // Neuron. 1998. V. 21. P. 717-726.
3. Yuan J.P., Kiselyov K., Shin D. M., et al. // Cell. 2003. V. 114.
P. 777-789.
4. Kim J.Y., Zeng W., Kiselyov K., et al. // J. Biol. Chem. 2006.
V. 281. № 43. P. 32540-32549.
5. Worley P.F., Zeng W., Huang G., et al. // Cell Calcium. 2007.
V. 42. № 4-5. P 363-371.
6. Hayashi M.K., Tang C., Verpelli C., et al. // Cell. 2009. V. 137.
№ 1. P 159-171.
7. Hayashi M.K., Ames H.M., Hayashi Y. // J. Neurosci. 2006.
V. 26. № 33. P. 8492-8501.
8. Ango F., Prezeau L., Muller T., et al. // Nature. 2001. V. 411.
№ 6840. P 962-965.
9. Feng W., Tu J., Yang T., et al. // J. Biol. Chem. 2002. V. 277.
№ 47. P. 44722-44730.
10. Kaznacheyeva E., Lupu V.D., Bezprozvanny I. // J. Gen. Physiol. 1998. V. 111. P. 847-856.
11. Kaznacheyeva E., Glushankova L., Bugaj V., et al. // J. Biol. Chem. 2007. V. 282. № 32. P. 23655-23662.
12. Николаев А.В., Скопин А.Ю., Казначеева Е.В. // Биол. мембраны. 2004. Т. 21. № 6. С. 451-457.
13. Kiselyov K.I., Mamin A.G., Semyonova S.B., Mozhayeva G.N. // FEBS Lett. 1997. V. 407. P 309-312.
14. Kiselyov K.I., Semyonova S.B., Mamin A.G., Mozhayeva G.N. // Pflügers Arch. 1999. V. 437. P. 305-314.
15. Zubov A.I., Kaznacheeva E.V., Nikolaev A.V., et al. // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P 25983-25985.
16. Kaznacheyeva E., Zubov A., Gusev K., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. P. 148-153.
17. Gusev K., Glouchankova L., Zubov A., et al. // J. Gen.
Physiol. 2003. V. 122. P 81-94.
18. Bugaj V., Alexeenko V., Zubov A., et al. // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. P. 16790-16797.
19. Feng W., Tu J., Pouliquin P., et al.// Cell Calcium. 2008. V. 43. № 3. P. 307-314.
20. Pouliquin P., Pace S.M., Dulhunty A.F.// Pflügers Arch. 2009. V. 458. P 723-732.
21. Shin D.M., Dehoff M.D., Luo X., et al. // J. Cell Biol. 2003.
V. 162. P. 293-303.
22. Bosanac I., Yamazaki H., Matsu-Ura T., et al. // Mol. Cell. 2005. V. 17. P. 193-203.
