CC BY
37
РЕГИСТРАЦИ в ТКАН1 КАК
1ИЯ ГРАНИЦ
научный сотрудник кафедры теории колебаний и автоматического регулирования изического факультета1;
A.В. Лебедева, к.б.н., научный сотрудник лаборатории функционального имиджинга отдела фундаментальных и прикладных исследований1; ассистент кафедры нейротехнологий Института биологии и биомедицины1;
Т.А. Мищенко, к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории по разработке методов нейропротекции Центра трансляционных технологий1; старший научный сотрудник отдела молекулярно-клеточных технологий ЦНИЛ2;
К.С. Яшин, младший научный сотрудник лаборатории сверхразрешающей микроскопии и генных технологий Института биомедицинских технологий2; нейрохирург, Институт травматологии и ортопедии2;
Л.С. Лепехина, магистр кафедры нейротехнологий Института биологии и биомедицины1; К.А. Астафьева, младший научный сотрудник отдела физико-химических исследований ЦНИЛ2; И.П. Иванова, д.б.н., зав. отделом физико-химических исследований ЦНИЛ2; М.В. Ведунова, д.б.н., ведущий научный сотрудник Института биологии и биомедицины1; директор Института биологии и биомедицины1;
И.А. Медяник, д.м.н., ведущий научный сотрудник группы микронейрохирургии Института травматологии и ортопедии2;
B.Б. Казанцев, д.ф.-м.н., проректор по научной работе1; зав. кафедрой нейротехнологий Института биологии и биомедицины1
Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, Н. Новгород, 603950, проспект Гагарина, 23;
2Приволжский исследовательский медицинский университет, Н. Новгород, 603005, пл. Минина и Пожарского, 10/1
Цель исследования — оценить возможности использования показателей электрофизиологической активности опухолевой ткани и перитуморальной области в качестве критериев определения границ на примере экспериментальной модели глиобластомы.
Материалы и методы. Использованы методы регистрации электрофизиологической внеклеточной активности (полевых пост-синаптических потенциалов) и регистрации глутаматных токов в астроцитах с помощью метода пэтч-кламп; магнитно-резонансная томография; хирургическая операционная техника in vivo. Эксперименты выполнены с использованием клеточных культур (первичная моноастроцитарная культура мыши, культура постоянной клеточной линии глиомы человека 2211); переживающих срезов гиппокампа головного мозга мышей; крыс с привитой злокачественной глиомой 101.8 для in vivo исследований.
Результаты. Проведена оценка нескольких электрофизиологических параметров активности нейронов и глиальных клеток в клеточных культурах, переживающих срезах гиппокампа, а также в ткани целого мозга. При регистрации полевых постсинаптиче-ских потенциалов в ткани целого мозга установлены различия функциональной активности неповрежденных участков и области развития глиомы. Полевые потенциалы в области глиомы не детектировались, что свидетельствует о невозбудимости опухолевой ткани.
Заключение. Полевые потенциалы, регистрируемые в ткани мозга in vivo, могут быть использованы в качестве нового критерия для определения границ глиальных опухолей головного мозга.
Ключевые слова: глиома; астроцит; полевой постсинаптический потенциал; границы опухоли; интраоперационная диагностика.
Как цитировать: Mishchenko M.A., Lebedeva A.V., Mishchenko Т.А., Yashin K.S., Lepekhina L.S., Astafyeva K.A., Ivanova I.P., Vedunova M.V., Medyanik I.A., Kazantsev V.B. Field potentials recording in the brain tissueas a new criterion for determination of glial tumors boundaries. Sovremennye tehnologii v medicine 2018; 10(3): 32-42, https://doi.org/10.17691/stm2018.10.3.4
Для контактов: Мищенко Михаил Андреевич, e-mail: mischenko@neuro.nnov.ru
Field Potentials Recording in the Brain Tissue as a New Criterion for Determination of Glial Tumors Boundaries
M.A. Mishchenko, PhD, Researcher, Department of Theory of Oscillations and Automatic Control, Faculty of Radiophysics1;
A.V. Lebedeva, PhD, Researcher, Functional Imaging Laboratory, Department of Basic and Applied Research1; Assistant, Department of Neurotechnologies, Institute of Biology and Biomedicine1; Т.А. Mishchenko, PhD, Senior Researcher, Laboratory for Neuroprotection Methods Development, Center for Translational Technologies1; Senior Researcher, Molecular and Cell Technologies Department, Central Scientific Research Laboratory2;
K.S. Yashin, MD, Junior Researcher, Laboratory of Super-Resolution Microscopy and Gene Technologies, Institute of Biomedical Technologies2; Neurosurgeon, Institute of Traumatology and Orthopedics2; L.S. Lepekhina, Master, Department of Neurotechnologies, Institute of Biology and Biomedicine1; K.A. Astafyeva, Junior Researcher, Department of Physico-Chemical Researches, Central Scientific Research Laboratory2;
I.P. Ivanova, DSc, Head of the Department of Physico-Chemical Researches, Central Scientific Research Laboratory2;
WI.V. Vedunova, DSc, Leading Researcher, Institute of Biology and Biomedicine1; Director of Institute of Biology and Biomedicine1; I.A. Medyanik, MD, DSc, Leading Researcher, Microneurosurgery Group, Institute of Traumatology and Orthopedics2;
V.B. Kazantsev, DSc, Vice-Rector for Research1; Head of the Department of Neurotechnologies, Institute of Biology and Biomedicine1
1Lobachevsky State University of Nizhni Novgorod, 23 Prospekt Gagarina, Nizhny Novgorod, 603950, Russia; 2Privolzhsky Research Medical University, 10/1 Minin and Pozharsky Square, Nizhny Novgorod, 603005, Russia
The aim of the study was to evaluate the electrophysiological activities of tumor and peritumoral tissues in an experimental glioblastoma model and rationalize their use for determining the tumor boundaries.
Materials and Methods. Following methods were used in this study: extracellular electrophysiological activity (field postsynaptic potentials) registration; astrocytic glutamate currents patch-clamp registration; magneto-resonant imaging; surgical techniques in vivo. The experiments were performed using cell cultures (primary murine astrocyte culture and constant cell line cultures of rat glioma cells 2211), acute murine hippocampal slices, and rats with transplanted malignant glioma 101.8.
Results. A number of electrophysiological parameters of neurons and glial cells were evaluated using cell cultures, acute hippocampal slices, and the rat brain as a whole. Field postsynaptic potentials in the brain tissue differed between the non-injured areas and the zone of glioma development. No field potentials detected in the tumoral area, indicating the lack of excitability in the tumor cells.
Conclusion. Field potentials recorded in the brain tissue in vivo can be used as a novel criterion for determining the glial brain tumors boundaries.
Key words: glioma; astrocyte; postsynaptic field potential; tumor boundary; intraoperative diagnosis.
English
Введение
Проблема эффективной диагностики и терапии злокачественных глиом головного мозга является одним из наиболее острых социально значимых вопросов современной нейроонкологии. По степени распространенности глиомы занимают лидирующие позиции среди других видов опухолей головного мозга, при этом средняя продолжительность жизни пациентов с данным диагнозом в среднем составляет 10-24 мес и лишь в редких случаях доходит до 5 лет [1-3].
Современная терапия злокачественных глиом
представляет собой комплекс методов и подходов, включающих микрохирургическое удаление опухоли, лучевую и химиотерапию в сочетании с инновационными методами лечения, например фотодинамической терапией и иммунотерапией [4-6].
Хирургическая резекция является основным этапом всех применяемых схем лечения, так как позволяет удалить большой объем опухолевой ткани, уменьшить внутричерепную гипертензию, снизить степень неврологического дефицита, а также установить точный фенотип опухоли для решения вопроса о дальнейшей тактике лечения. Основной задачей хирургического
лечения является максимально возможное удаление опухоли и элиминация жизнеспособных опухолевых клеток из перитуморальной области с минимальным повреждением прилежащих к опухоли функционально значимых зон мозга. Однако тотальное удаление опухолевых клеток хирургическим путем не представляется возможным. В первую очередь причина заключается в инвазивном характере роста новообразований, которые распространяются в окружающие ткани до нескольких сантиметров от основного опухолевого узла и являются источником продолженного роста опухолей [2, 7-11]. В этих обстоятельствах важную роль играет диагностика опухоли.
Для определения границ глиальных опухолей головного мозга требуется, во-первых, установить различия между нормальными и патологическими глиаль-ными клетками, во-вторых, выявить взаимодействие данных типов клеток на границе опухоли. Результаты исследования клеток глиомы показывают ряд изменений в электрических свойствах и в работе транспортеров возбуждающих аминокислот [12]. В норме транспортеры астроцитов необходимы для нормальной синаптической передачи и обеспечивают быстрое очищение синаптической щели от высвободившегося глутамата, что предотвращает эффект эксайтотоксич-ности. Однако при развитии глиальных опухолей нарушается работа данных транспортеров, что приводит к ряду негативных изменений в метаболизме глиальных клеток и, как следствие, в синаптической передаче.
Новым подходом в диагностике является определение границ глиальных опухолей на основе оценки функционального состояния тканей головного мозга. Формирование электрофизиологического сигнала в ответ на электрическую стимуляцию является отличительной особенностью нервной ткани. При этом гли-альная ткань, составляющая большую часть опухоли, является электрически невозбудимой. По своему принципу данный метод является уникальным методом диагностики для нейрохирургии, так как в отличие от всех остальных существующих методов основывается на анализе электрофизиологической активности, представленной полевыми потенциалами ткани, а не на ее морфологической структуре. Такая информация является крайне важной, учитывая стремление современной хирургии опухолей головного мозга предотвратить развитие неврологических (функциональных) нарушений в постоперационном периоде.
Цель исследования — оценить электрофизиологические особенности злокачественно трансформированной ткани головного мозга и перитуморальной области путем регистрации полевых потенциалов в ответ на электрическую стимуляцию.
Материалы и методы
Материалом для исследований in vitro служили клетки постоянной клеточной линии глиомы крысы 2211 и первичные моноастроцитарные культуры, по-
лученные от новорожденных мышей линии C57BL/6 (P=2).
В экспериментах in vivo использованы половозрелые самцы крыс линии Wistar с привитой злокачественной глиомой (глиобластомой) 101.8 (получена из ФГБНУ НИИ морфологии человека РАН, Москва) [13]. Возраст крыс на момент перевивки опухоли составлял 2,5 мес. Эксперименты проводились на 10-12-е сутки после трансплантации клеток глиомы.
Основные правила содержания и ухода за экспериментальными животными соответствовали Правилам для проведения работ с использованием экспериментальных животных (Россия, 2010) и Международным рекомендациям (этическому кодексу) по проведению медико-биологических исследований с использованием животных (CIOMS и ICLAS, 2012), при этом неукоснительно соблюдались этические принципы, установленные Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Страсбург, 2006). На проведение экспериментальных исследований на животных получено разрешение Биоэтического комитета Национального исследовательского Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского.
Культивирование постоянной клеточной линии глиомы крысы 2211. Постоянная клеточная линия 2211 получена из Российской коллекции клеточных культур позвоночных Института цитологии РАН (Санкт-Петербург). Клетки культивировали в среде Игла МЕМ («ПанЭко», Россия) с добавлением 0,32 мг/мл глутамина («ПанЭко», Россия) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки («ПанЭко», Россия). По завершении периода экспоненциального роста клетки снимали раствором версен (0,02%)/трипсин (0,25%) в соотношении 3:1 и пересевали. Кратность рассева составляла 1:10. Экспериментальные работы проводились после третьего пассажа.
Культивирование первичных моноастроци-тарных культур. Первичные моноастроцитарные культуры получали из ткани коры больших полушарий головного мозга новорожденных мышей (Р=2). Хирургически извлеченная нервная ткань подвергалась механическому измельчению и ферментативной диссоциации 0,25% раствором трипсина (Invitrogen, США). После центрифугирования (3 мин, 1000 об./мин) суспензию клеток раскапывали на покровные стекла (18*18 мм), предварительно обработанные положительно заряженным гидрофильным веществом — полиэтиленимином (Sigma, США), обеспечивающим эффективное прикрепление клеток к субстрату. Клетки культивировали в среде ДМЕМ («ПанЭко», Россия) с добавлением 0,32 мг/мл глутамина («ПанЭко», Россия), 10% эмбриональной телячьей сыворотки («ПанЭко», Россия) и 1 мМ пировиног-радной кислоты (Sigma, США) в течение 30 дней.
Жизнеспособность первичных культур и постоянной клеточной линии поддерживали в условиях СО2-
оригинальные исследования
инкубатора MCO-18AIC (Sanyo, Япония) при температуре 35,5°С и газовой смеси, содержащей 5% СО2. Первичную морфологическую оценку развития первичных культур и клеток постоянной клеточной линии осуществляли при помощи широкопольной световой микроскопии с использованием инвертированного флюоресцентного микроскопа Axio Observer.AI (Carl Zeiss, Германия).
Наркотизация животного. Перед трансплантацией опухоли, а также перед проведением магнитно-резонансной томографии (МРТ) каждое животное проходило предоперационную наркотизацию. Для введения экспериментального животного в состояние хирургического наркоза использовали Золетил 1QQ (Virbac Sante Animale, Франция) в дозе 125 мг/кг массы тела внутрибрюшинно. Необходимым критерием хирургической стадии наркоза является отсутствие болевого рефлекса (отдергивание конечностей на щипок пинцетом). Далее экспериментальное животное было инъецировано 2% раствором анальгезирующего и миорелаксирующего препарата Рометар (Interchemie, Нидерланды) в дозе Q,2 мл/кг массы тела внутримышечно.
Трансплантация опухоли и определение сроков проведения эксперимента in vivo. Опухолевые клетки в количестве 1Q5-1Q6 в 1 мл раствора Хенкса вводили в правую теменную область (латеральнее от сагиттального шва на 2 мм и кзади от коронарного шва на 2 мм). В указанной области сначала формировали трепанационное отверстие в черепе диаметром 2 мм с помощью зубоврачебного бора, затем твердую мозговую оболочку вскрывали и в ткань головного мозга с помощью троакара вводили опухолевые клетки на глубину 2-4 мм.
Через 5-7 сут после трансплантации обычно появлялись первые симптомы неопластического процесса, которые клинически проявлялись в малоподвижности, неопрятности и отсутствии аппетита у животного.
К 9-11-м суткам после трансплантации клеток клиническая картина глиобластомы в основном зависела от характера роста опухоли. При ограниченном росте в теменной доле, но с прорастанием опухоли в кору больших полушарий и желудочек мозга у 65-8Q% животных наблюдались очаговые нарушения в виде ге-мипарезов.
На 11-13-е сутки после перевивки опухоль достигала больших размеров (~1,5-2,2 см3), что приводило к летальному исходу. Оптимальным временем для регистрации электрофизиологических параметров в данном эксперименте был выбран период с Ю-х по 12-е сутки после перевивки, когда опухоль полностью сформирована и достигает максимальных размеров. Клинически верифицировать точную локализацию опухоли и ее размеры при внутримозговом росте практически невозможно, поэтому определение местоположения опухоли и выбор оптимального периода проведения электрофизиологических экспериментов осуществляли на основании данных МРТ.
Магнитно-резонансная томография. Наркотизированное животное закрепляли в специальном фиксаторе за резцы на челюсти и помещали в сверхпроводящий магнитно-резонансный томограф туннельного типа Agilent DD2 NMR 400WB (Agilent Technologies, США) с рабочей частотой 400 МГц и величиной напряженности постоянного магнитного поля 9,4 Тл.
Для получения структурных Т2-взвешенных изображений была использована импульсная последовательность FSEMS (fast spin echo multi slice). Время повторения — 3000 мс, время эха — от 40 мс, размер матрицы — 256^192, количество срезов — 10, толщина срезов — 1 мм, поле обзора — 40*40 мм.
Регистрация электрофизиологической активности с помощью метода внеклеточной регистрации. Перед выполнением регистрации проводили ингаляционную наркотизацию животного 5% Изофлураном (Piramal Healthcare Limited, Индия). Краниотомию осуществляли с использованием бормашины «Унибор-МК» (ОАО «Сапфир», Россия) от верхнего сагиттального синуса до верхней височной линии, от верхней челюсти до поперечного синуса. Для предупреждения нагревания твердой мозговой оболочки проводили ирригацию бура холодным физиологическим раствором каждые 10 с.
Регистрацию параметров электрофизиологической активности (полевые возбуждающие постси-наптические потенциалы — пВПСП) осуществляли с использованием светового микроскопа Olympus BX51WI (Olympus, Япония), оснащенного автоматизированными манипуляторами и системой электродов для регистрации и стимуляции нервной ткани, и усилителя биологических сигналов MultiClamp 700B (Axon Instruments, США). Стимулирующий электрод представлял собой биполярный электрод из нержавеющей стали (FHC Inc., США), который устанавливали в разных областях трепанационного окна в зависимости от конкретной задачи. Регистрирующий электрод представлял собой микроэлектрод сопротивлением 4-7 МОм. Электроды вытягивались из стеклянных капилляров (Harvard Part No. 30-0053) при помощи пул-лера P-97 (Sutter Instruments, США). Для регистрации пВПСП данный электрод заполнялся внутриклеточным раствором в составе: 119 мМ NaCl; 2,5 мМ KCl; 1,3 мМ MgSO4; 1 мМ NaH2PO4; 26,2 мМ NaHCO3; 2 мМ CaCl2; 10 мМ D-глюкоза (pH=7,4; осмолярность — 298 мОсм). Значения пВПСП регистрировали в разных областях трепанационного окна в зависимости от конкретной задачи в режиме тока, равного нулю (/=0).
Полученные электрофизиологические данные были проанализированы с помощью программ WinWCP 4.7 (http://winscp.net), dampfit (Axon Instruments Inc.; США), Origin Pro 2016 (OriginLab, США).
Результаты
На первом этапе исследований была проведена оценка транспортерных токов глутамата для глиаль-
ных клеток в переживающих срезах гиппокампа мозга животного и клеток глиомы. Глутаматные токи возникают при регуляции синаптической передачи и могут иметь решающее значение при оценке функциональной активности астроцитов в головном мозге [14-15]. Возбуждение транспортерного тока астроцитов вызывали путем локальной аппликации глутамата посредством патч-пипетки. Установлено, что кинетика транспортерного тока глутамата в астроцитах переживающих срезов гиппокампа и в клетках глиомы не различима (рис. 1).
Таким образом, несмотря на существенные метаболические изменения, происходящие при злокачественной трансформации клеток, нами не зарегистрировано разницы в изменениях одного из основных электрофизиологических параметров астроцитов, что делает невозможным использование этого показателя для оценки границ глиальных опухолей.
В связи с этим на следующем этапе работы в качестве диагностического критерия были исследованы пВПСП. Эти потенциалы представляют собой суммарный потенциал, возникающий при активации группы нейронов (популяционный спайк) или группы возбуждающих синапсов (полевой возбуждающий постсинаптический потенциал) в ответ на электрическую стимуляцию близлежащих нейрональных отростков.
Полевой потенциал характеризуется амплитудой и углом наклона, отражающими количество активированных нейронов и отростков. Известно [16], что
Рис. 1. Электрофизиологическая запись транспортерного тока астроцитов:
а — возбуждение путем аппликации глутамата; б — запись в переживающем срезе гиппокампа мыши; в — в культуре глиомы
Рис. 2. Регистрация полевых потенциалов в культуре астроцитов
астроциты являются электрически не возбудимыми клетками, не способными в норме генерировать потенциалы действия. Можно предположить, что он-котрансформированные астроциты претерпевают изменения, позволяющие генерировать потенциалы, например пВПСП. Для проверки данной гипотезы была осуществлена попытка регистрации полевых потенциалов в культуре астроцитов. Обнаружено отсутствие пВПСП в культуре астроцитов в ответ на электрическую стимуляцию (рис. 2).
Таким образом, регистрация полевых потенциалов может выступать в качестве критерия, позволяющего отличать опухолевую ткань, сформированную онко-трансформированными астроцитами, от нормальной ткани, содержащей нейроны и нервные волокна.
Следующим шагом в исследовании пВПСП тканей мозга для определения границ глиальных опухолей стало исследование in vivo на крысах линии Wistar с перевитой глиомой 101.8. Верификацию точной локализации глиомы и ее размеров проводили по результатам МРТ экспериментальных животных (рис. 3).
Затем были изучены пВПСП различных областей головного мозга при экспериментальной неоплазии. Для оценки электрофизиологической активности ткани головного мозга in vivo проведены эксперименты с различным расположением стимулирующего и регистрирующего электродов. Расстояние между этими электродами всегда составляло 4 мм. Были определены области мозга, дающие физиологический ответ на электростимуляцию (неизмененная ткань), и области, являющиеся невозбудимыми (глиома). Отмечены различия пВПСП нормальной и злокачественно трансформированной тканей головного мозга (рис. 4).
При регистрации ответа с опухолевой ткани или в непосредственной близости от нее (перитуморальная зона) определяется существенное снижение амплитуды ответа (рис. 4, а, б), что может быть обусловлено разрушением волокон миелина, отвечающих за про-
Рис. 3. МРТ-изображения головного мозга крыс линии Wistar:
а — крыса из контрольной группы без развития опухоли головного мозга; б — крыса с развитой опухолью головного мозга; снятие изображения осуществляли на 11-й день после перевивки опухоли
Стимулирующий
электрод / #
Неизмененная ткань
Регистрирующий электрод Опухоль
Стимулирующий электрод
измененная кань
Регистрирующий электрод
Опухоль
0,1 мВ |_
3 мс
Стимул 9 мА, 200 мкс
0,1 мВ
1_
3 мс
Стимул 23 мА, 200 мкс б
Стимулирующий электрод
измененная ткань
Регистрирующий электрод
Опухоль
Стимулирующи электрод
измененная ткань
Регистрирующий электрод
Опухоль
щ^л
Стимул 30 мА, 200 мкс
0,1 мВ|_ 3 мс
Стимул 1,3 мА, 200 мкс
а
в
г
Рис. 4. Расположение стимулирующего и регистрирующего электродов в головном мозге животного и регистрируемые полевые потенциалы:
а — оба электрода расположены в опухоли; б — регистрирующий электрод расположен в опухоли, стимулирующий — в нормальной ткани; в — стимулирующий электрод расположен в опухоли, регистрирующий — в нормальной ткани; г — оба электрода расположены в нормальной ткани
ведение нервных сигналов, или нарушением структуры коры.
Внеклеточная электрическая стимуляция нервной ткани (см. рис. 4, а, б и рис. 4, в) способна оказывать воздействие как на близлежащие клетки,
Стимулирующий электрод
,Опухоль
Регистрирующий электрод Неизмененная ткань
1ЧЦ11
0,2 мВ|_ 1 мс
Стимул 1 мА, 200 мкс
0,1 мВ1__
1 мс
Стимул 300 мкА, 200 мкс б
1 мВ[_ 1 мс
Стимул 10 мА, 200 мкс г
Рис. 5. Регистрация пВПСП в неизмененной области головного мозга:
а — схематичное отображение электродов; б — пВПСП при амплитуде стимула 300 мкА, амплитуда ответа — 0,2 мВ; в — пВПСП при амплитуде стимула 1 мА, амплитуда ответа — 1,2 мВ; г — пВПСП при амплитуде стимула 10 мА, амплитуда ответа — 5 мВ
Стимулирующи электро
Опухоль
Регистрирующий электрод
Неизмененная ткань
0,2 мВ
1 мс
Стимул 1 мА, 200 мкс
Рис. 6. Регистрация пВПСП непосредственно в привитой глиобластоме 101.8:
а — схематичное отображение электродов; б — отсутствие ответа при амплитуде стимула 300 мкА; в — отсутствие ответа при амплитуде стимула 1 мА; г — отсутствие ответа при амплитуде стимула 10 мА
так и на достаточно отдаленные, поскольку генерируемое стимулирующим импульсом электрическое поле распространяется через межклеточную среду или через возбуждение частично сохранившихся нервных волокон. Несмотря на затухание при распространении, данное электрическое поле при достаточно больших амплитудах стимуляции способно создавать локальную деполяризацию клеточных мембран, что может приводить к генерации потенциалов действия нейронами. По этой причине на регистрирующем электроде, расположенном в неизмененной ткани, наблюдается пВПСП амплитудой до 1 мВ при стимуляции в области развития глиомы (см. рис. 4, в).
Поскольку величина полевого потенциала зависит от амплитуды стимуляции, установлено увеличение ответа при увеличении амплитуды стимула в случае расположения электродов в неизмененной ткани мозга (рис. 5) и отсутствие ответа при тех же значениях амплитуды стимула в случае расположения стимулирующего и регистрирующего электродов в опухоли (рис. 6).
Следующим этапом экспериментальных исследований стало исследование электрофизиологических параметров в условиях моделирования нейрохирургической процедуры удаления опухоли с получением ответа от «ложа» удаленной опухоли. Поскольку опухоли глиального ряда прорастают вдоль волокон белого вещества, задачей данной работы явилась регистрация пВПСП в подкорковых структурах головного мозга. При стимуляции в «ложе» экспериментальной опухоли обнаружено наличие пВПСП, амплитуда которого значительно меньше амплитуды полевого потенциала, зарегистрированного в неизмененной ткани коры головного мозга, но все же это говорит о наличии возбудимых клеток после хирургического удаления опухоли, которые имеют функциональную активность (рис. 7).
0,1 мВ
1 мс
Стимул 300 мкА, 200 мкс
б
1 мВ| 1 мс
Стимул 10 мА, 200 мкс
а
в
а
Рис. 7. Регистрация пВПСП после удаления привитой глиобластомы 101.8. (в «ложе» опухоли):
а — схематичное отображение электродов; б — ответ при амплитуде стимула 10 мА, амплитуда ответа — 0,2 мВ; в — ответ при амплитуде стимула 30 мА, амплитуда ответа — 0,5 мВ
Обсуждение
В результате проведенных исследований установлено, что электрофизиологическая активность, определяемая регистрацией пВПСП, в ответ на локальную электрическую стимуляцию в нормальной и онкотрансформированной ткани мозга значительно различается. Регистрация пВПСП, отражающих суммарную электрическую активность нервных клеток или отдельных волокон, показала, что в онкотранс-формированной ткани отсутствует ответ на электрическую стимуляцию, в то время как в неизмененной ткани возникает полевой потенциал, амплитуда которого увеличивается при увеличении амплитуды стимула. Кроме того, полевые потенциалы возникают также в ответ на стимуляцию в «ложе» удаленной опухоли, расположенной в подкорковых структурах мозга. Таким образом, различия в полевых потенциалах нормальной и онкотрансформированной тканей головного мозга могут быть использованы в качестве диагностического критерия при интраоперационном определении границ глиальных опухолей головного мозга. При определении типа ткани на основе регистрации полевых потенциалов установлена ключевая роль места расположения регистрирующего и стимулирующего электродов. Регистрация полевых потенциалов в ткани мозга крысы с перевитой глиомой 101.8 осуществлялась по четырем возможным вариантам расположения электродов: стимулирующий и регистрирующий электроды в одной области (в нормальной ткани или в области развития перевитой глиомы), а также в различных областях. При расположении регистрирующего электрода в нормальной ткани в результате стимуляции наблюдается полевой потенциал, амплитуда которого увеличивается при увеличении амплитуды стимула вне зависимости от того, где расположен стимулирующий электрод. Если регистрирующий электрод располагается в области развития опухоли, где отсутствуют электровозбудимые нервные клетки, полевые потенциалы не возникают. В «ложе» удаленной опухоли, формируемой подкорковыми структурами,
могут быть зарегистрированы полевые потенциалы от пролегающих там нервных волокон или их частичных остатков, возбуждаемых электрической стимуляцией. При этом амплитуда регистрируемых ответов оказывается ниже, чем амплитуда в кортикальных областях нормальной ткани, но различима в сравнении с областью развития опухоли. Это свидетельствует о наличии функционально активных нервных клеток, которые способны формировать отростки в области мозга после хирургического удаления опухоли.
Основными ограничениями для достижения максимальной резекции злокачественных глиом (95-98%) являются недостаточная визуализация границ опухоли вследствие ее инфильтративного роста и необходимость сохранения функционально значимых зон головного мозга. При традиционном удалении опухоли в белом свете микроскопа максимальная резекция достигается лишь в 23-50% случаев [9, 17], что стимулирует разработку новых методов интраоперационной диагностики границ злокачественных опухолей головного мозга.
В настоящее время существует множество методов, применяемых при удалении опухоли для достижения максимальной резекции с минимальным риском функциональных осложнений: интраопера-ционная КТ и/или МРТ [5, 18-21], УЗ-сканирование [22-24], нейронавигационные системы [25-27], флюоресцентная диагностика [28-36], интраоперационный нейрофизиологический мониторинг, краниотомия в сознании и различные комбинации этих методов. Работа перечисленных методов основана на нескольких подходах: первый — регистрация контрастных веществ, накапливающихся в опухолевой сосудистой сети (КТ, МРТ), второй — регистрация метаболических изменений в тканях (специальные режимы МРТ — МР-спектроскопия, DVI, флюоресцентная диагностика, лазерная спектроскопия), третий — регистрация изменений плотности тканей (ультразвуковая диагностика). Исключение составляют навигационные системы, в которых определение типа тканей основано на результатах дооперационного обследования больных
[1, 37]. В настоящее время проводятся исследования возможности применения в целях интраоперационной визуализации структур головного мозга конфокальной микроскопии и оптической когерентной томографии [38-42].
Однако вместе с тем наличие у каждого метода ограничений в определении границ опухолевой инвазии оставляет актуальной проблему поиска новых технологий интраоперационной диагностики границ опухолей. Данная работа показала возможности использования нового метода для определения границ глиальной опухоли — на основе оценки полевых потенциалов ткани мозга в опухоли и в близлежащих участках.
Заключение
Полученные результаты позволяют предложить новый диагностический критерий для определения границ глиальных опухолей головного мозга, основанный на регистрации полевых потенциалов ткани в ответ на электрическую стимуляцию. Этот критерий является уникальным для нейрохирургии, поскольку основывается на оценке функциональной активности ткани, а не ее морфологии. Полученные данные крайне важны для современной нейрохирургии, что обусловлено необходимостью предотвращения развития неврологических (функциональных) нарушений в постоперационном периоде у пациентов. При этом точность оценки границ опухоли, которая достигается лишь взаимным расположением стимулирующего и регистрирующего электродов, может теоретически достигать субмиллиметровых значений.
Благодарности. Авторы выражают благодарность Тюриковой Ольге Валерьевне и Дембицкой Юлии Владимировне за помощь в дизайне экспериментов, важные указания и критический взгляд на данную работу.
Финансирование исследования. Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект 16-3160080 мол_а_дк), государственного задания (проекты 17.3335.2017/4.6 и 6.6659.2017/6.7), гранта Президента Российской Федерации МД-2634.2017.4 и стипендии Президента Российской Федерации СП-2458.2018.5.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Литература/References
1. Mahboob S.O., Eljamel M. Intraoperative image-guided surgery in neuro-oncology with specific focus on high-grade gliomas. Future Oncol 2017; 13(26): 2349-2361, https://doi. org/10.2217/fon-2017-0195.
2. Cohen A.L., Colman H. Glioma biology and molecular markers. Cancer Treat Res 2015; 163: 15-30, https://doi. org/10.1007/978-3-319-12048-5_2.
3. Смолин А.В., Бекяшев А.Х., Кобяков Г.Л., Шара-бура Т.М., Муфазалов Ф.Ф., Канищева Н.В., Бумагина В.О.
Первые результаты Российского многоцентрового исследования по эпидемиологии злокачественных глиом. Современная онкология 2014; 16(2): 50-55. Smolin A.V., Bekyashev A.H., Kobyakov G.L., Sharabura T.M., Mufazalov F.F., Kanischeva N.V., Bumagina V.O. First results of the Russian multicenter epidemiology project on the malignant gliomas. Sovremennaya onkologiya 2014; 16(2): 50-55.
4. de Paula L.B., Primo F.L., Tedesco A.C. Nanomedicine associated with photodynamic therapy for glioblastoma treatment. Biophys Rev 2017; 9(5): 761-773, https://doi. org/10.1007/s12551-017-0293-3.
5. Eljamel M.S., Mahboob S.O. The effectiveness and cost-effectiveness of intraoperative imaging in high-grade glioma resection; a comparative review of intraoperative ALA, fluorescein, ultrasound and MRI. Photodiagnosis Photodyn Ther 2016; 16: 35-43, https://doi.org/10.1016/j. pdpdt.2016.07.012.
6. Абсалямова О.В., Аникеева О.Ю., Голанов А.В., Кобяков Г.Л., Коновалов А.Н., Корниенко В.Н., Криво-шапкин А.Л., Лошаков В.А., Олюшин В.Е., Потапов А.А., Рыжова М.В., Таняшин С.В., Трунин Ю.Ю., Улитин А.Ю., Шишкина Л.В. Клинические рекомендации по лечению первичных опухолей центральной нервной системы. Н. Новгород; 2013. Absalyamova O.V., Anikeeva O.Yu., Golanov A.V., Kobyakov G.L., Konovalov A.N., Kornienko V.N., Krivoshapkin A.L., Loshakov V.A., Olyushin V.E., Potapov A.A., Ryzhova M.V., Tanyashin S.V., Trunin Yu.Yu., Ulitin A.Yu., Shishkina L.V. Klinicheskie rekomendatsii po lecheniyu pervichnykh opukholey tsentralnoy nervnoy sistemy [Clinical guidelines for the treatment of primary central nervous system tumors]. Nizhny Novgorod; 2013.
7. Reitman Z.J., Winkler F., Elia A.E.H. New directions in the treatment of glioblastoma. Semin Neurol 2018; 38(1): 5061, https://doi.org/10.1055/s-0038-1623534.
8. Улитин А.Ю., Мацко Д.Е., Олюшин В.Е. Нейро-эпителиальные опухоли головного мозга. СПб: Изд-во ФГБУ «РНХИ им. проф. А.Л. Поленова»; 2014. Ulitin A.Yu., Matsko D.E., Olyushin V.E. Neyroepitelialnye opukholigolovnogo mozga [Neuroepithelial brain tumors]. Saint Petersburg: Izd-vo FGBU "RNKHI im. prof. A.L. Polenova"; 2014.
9. Анохина Ю.Е., Гайдар Б.В., Мартынов Б.В., Свистов Д.В., Папаян Г.В., Григорьевский Д.И. Прогностическая значимость объема хирургического вмешательства в условиях применения интраоперационной флуоресцентной диагностики у пациентов со злокачественными глиомами головного мозга. Вестник Российской военно-медицинской академии 2014; 1(45): 19-24. Anokhina Yu.E., Gaidar B.V., Martynov B.V., Svistov D.V., Papayan G.V., Grigorievsky D.I. Prognostic significance of surgery volume under fluorescent intraoperative diagnostic applications in patients with malignant brain gliomas. Vestnik Rossijskoj voenno-medicinskoj akademii 2014; 1(45): 19-24.
10. Sanai N., Chang S., Berger M.S. Low-grade gliomas in adults: a review. J Neurosurg 2011; 115(5): 948-965, https:// doi.org/10.3171/2011.7jns10238.
11. Kuhnt D., Becker A., Ganslandt O., Bauer M., Buchfelder M., Nimsky C. Correlation of the extent of tumor volume resection and patient survival in surgery of glioblastoma multiforme with high-field intraoperative MRI guidance. Neuro Oncol 2011; 13(12): 1339-1348, https://doi. org/10.1093/neuonc/nor133.
12. Robert S.M., Sontheimer H. Glutamate transporters in the biology of malignant gliomas. Cell Mol Life Sci
2014; 71(10): 1839-1854, https://doi.org/10.1007/s00018-013-1521-z.
13. Халанский А.С., Кондакова Л.И. Перевиваемый штамм глиомы крысы 101.8 I. Биологическая характеристика. Клиническая и экспериментальная морфология 2013; 4(8): 63-69. Khalansky A.S., Kondakova L.I. Transplanted rat glioma 101.8. I. Biological characteristics. Klinicheskaya i eksperimentalnaya morfologiya 2013; 4(8): 63-69.
14. Lebedeva A.V., Dembitskaya Y.V., Pimashkin A.S., Zhuravleva Z.D., Shishkova E.A., Semyanov A.V. The role of energy substrates in astrocyte calcium activity of rat hippocampus in early postnatal ontogenesis. Sovremennye tehnologii v medicine 2015; 7(3): 14-19, https://doi. org/10.17691/stm2015.7.3.02.
15. Lebedeva A., Plata A., Nosova O., Tyurikova O., Semyanov A. Activity-dependent changes in transporter and potassium currents in hippocampal astrocytes. Brain Res Bull 2018; 136: 37-43, https://doi.org/10.1016/j. brainresbull.2017.08.015.
16. Sofroniew M.V., Vinters H.V. Astrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol 2010; 119(1): 7-35, https://doi. org/10.1007/s00401-009-0619-8.
17. Vogelbaum M.A. Does extent of resection of a glioblastoma matter? Clin Neurosurg 2012; 59: 79-81, https:// doi.org/10.1227/neu.0b013e31826b2e75.
18. Li P., Qian R., Niu C., Fu X. Impact of intraoperative MRI-guided resection on resection and survival in patient with gliomas: a meta-analysis. Curr Med Res Opin 2017; 33(4): 621-630, https://doi.org/10.1080/03007995.2016.1275935.
19. Scherer M., Jungk C., Younsi A., Kickingereder P., Müller S., Unterberg A. Factors triggering an additional resection and determining residual tumor volume on intraoperative MRI: analysis from a prospective single-center registry of supratentorial gliomas. Neurosurg Focus 2016; 40(3): E4, https://doi.org/10.3171/2015.11.focus15542.
20. Kubben P.L., Scholtes F., Schijns O.E., Ter Laak-Poort M.P., Teernstra O.P., Kessels A.G., van Overbeeke J.J., Martin D.H., van Santbrink H. Intraoperative magnetic resonance imaging versus standard neuronavigation for the neurosurgical treatment of glioblastoma: a randomized controlled trial. Surg Neurol Int 2014; 5: 70, https://doi. org/10.4103/2152-7806.132572.
21. Senft C., Bink A., Franz K., Vatter H., Gasser T., Seifert V. Intraoperative MRI guidance and extent of resection in glioma surgery: a randomised, controlled trial. Lancet Oncol 2011; 12(11): 997-1003, https://doi.org/10.1016/s1470-2045(11)70196-6.
22. Enchev Y., Bozinov O., Miller D., Tirakotai W., Heinze S., Benes L., Bertalanffy H., Sure U. Image-guided ultrasonography for recurrent cystic gliomas. Acta Neurochir (Wien) 2006; 148(10): 1053-1063, https://doi.org/10.1007/ s00701-006-0858-6.
23. Cheng L.G., He W., Zhang H.X., Song Q., Ning B., Li H.Z., He Y., Lin S. Intraoperative contrast enhanced ultrasound evaluates the grade of glioma. Biomed Res Int 2016; 2016: 2643862, https://doi.org/10.1155/2016/2643862.
24. Prada F., Mattei L., Del Bene M., Aiani L., Saini M., Casali C., Filippini A., Legnani F.G., Perin A., Saladino A., Vetrano I.G., Solbiati L., Martegani A., DiMeco F. Intraoperative cerebral glioma characterization with contrast enhanced ultrasound. Biomed Res Int 2014; 2014: 484261, https://doi. org/10.1155/2014/484261.
25. Wirtz C.R., Albert F.K., Schwaderer M., Heuer C., Staubert A., Tronnier V.M., Knauth M., Kunze S. The benefit
of neuronavigation for neurosurgery analyzed by its impact on glioblastoma surgery. Neurol Res 2000; 22(4): 354-360, https://doi.org/10.1080/01616412.2000.11740684.
26. Tursynov N., Grigolashvili M., Kauynbekova S., Grigolashvili S. Evaluating the efficacy of neuronavigation in surgical treatment of glial tumors. Georgian Med News 2017; 262: 14-20.
27. Gerard I.J., Kersten-Oertel M., Petrecca K., Sirhan D., Hall J.A., Collins D.L. Brain shift in neuronavigation of brain tumors: a review. Med Image Anal 2017; 35: 403-420, https:// doi.org/10.1016/j.media.2016.08.007.
28. Suero Molina E., Schipmann S., Stummer W. Maximizing safe resections: the roles of 5-aminolevulinic acid and intraoperative MR imaging in glioma surgery-review of the literature. Neurosurg Rev 2017, https://doi.org/10.1007/ s10143-017-0907-z.
29. Xie Y., Thom M., Ebner M., Wykes V., Desjardins A., Miserocchi A., Ourselin S., McEvoy A.W., Vercauteren T. Wide-field spectrally resolved quantitative fluorescence imaging system: toward neurosurgical guidance in glioma resection. J Biomed Opt 2017; 22(11): 1-14, https://doi.org/10.1117/1. jbo.22.11.116006.
30. Eljamel S. 5-ALA fluorescence image guided resection of glioblastoma multiforme: a meta-analysis of the literature. Int J Mol Sci 2015; 16(5): 10443-10456, https://doi.org/10.3390/ ijms160510443.
31. Acerbi F., Cavallo C., Schebesch K.M., Akgakaya M.O., de Laurentis C., Hamamcioglu M.K., Broggi M., Brawanski A., Falco J., Cordella R., Ferroli P., Kiris T., Höhne J. Fluorescein-guided resection of intramedullary spinal cord tumors: results from a preliminary, multicentric, retrospective study. World Neurosurg 2017; 108: 603-609, https://doi.org/10.1016/j. wneu.2017.09.061.
32. Acerbi F., Broggi M., Eoli M., Anghileri E., Cavallo C., Boffano C., Cordella R., Cuppini L., Pollo B., Schiariti M., Visintini S., Orsi C., La Corte E., Broggi G., Ferroli P. Is fluorescein-guided technique able to help in resection of highgrade gliomas? Neurosurg Focus 2014; 36(2): E5, https://doi. org/10.3171/2013.11.focus13487.
33. Barone D.G., Lawrie T.A., Hart M.G. Image guided surgery for the resection of brain tumours. Cochrane Database Syst Rev 2014; 1: CD009685, https://doi. org/10.1002/14651858.cd009685.pub2.
34. Li Y., Rey-Dios R., Roberts D.W., Valdes P.A., Cohen-Gadol A.A. Intraoperative fluorescence-guided resection of high-grade gliomas: a comparison of the present techniques and evolution of future strategies. World Neurosurg 2014; 82(1-2): 175-185, https://doi.org/10.1016/j. wneu.2013.06.014.
35. Jenkinson M.D., Barone D.G., Bryant A., Vale L., Bulbeck H., Lawrie T.A., Hart M.G., Watts C. Intraoperative imaging technology to maximise extent of resection for glioma. Cochrane Database Syst Rev 2018; 1: CD012788, https://doi. org/10.1002/14651858.cd012788.pub2.
36. Горяйнов С.А., Потапов А.А., Пицхелаури Д.И., Ко-бяков Г.Л., Охлопков В.А., Гаврилов А.Г., Шурхай В.А., Жуков В.Ю., Шишкина Л.В., Лощенов В.Б., Савельева Т.А., Кузьмин С.Г., Чумакова А.П., Spallone A. Интраоперацион-ная флуоресцентная диагностика и лазерная спектроскопия при повторных операциях по поводу глиом головного мозга. Вопросы нейрохирургии им. Н.Н. Бурденко 2014; 78(2): 22-31. Goriainov S.A., Potapov A.A., Pitskhelauri D.I., Kobiakov G.L., Okhlopkov V.A., Gavrilov A.G., Shurkhai V.A.,
Zhukov V.Iu., Shishkina L.V., Loshchenov V.B., Savel'eva T.A., Kuz'min S.G., Chumakova A.P., Spallone A. Intraoperative fluorescence diagnostics upon recurrent operations for brain gliomas. Voprosy neyrokhirurgii im. N.N. Burdenko 2014; 78(2): 22-31.
37. Tyurikova O., Dembitskaya Y., Yashin K., Mishchenko M., Vedunova M., Medyanik I., Kazantsev V. Perspectives in intraoperative diagnostics of human gliomas. Comput Math Methods Med 2015; 2015: 1-9, https://doi. org/10.1155/2015/479014.
38. Banc A., Stan C., Florian I.S. Optical coherence tomography as a marker of vision in children with optic pathway gliomas. Childs Nerv Syst 2018; 34(1): 51-60, https:// doi.org/10.1007/s00381-017-3578-8.
39. Garzon-Muvdi T., Kut C., Li X., Chaichana K.L. Intraoperative imaging techniques for glioma surgery. Future Oncol 2017; 13(19): 1731-1745, https://doi.org/10.2217/fon-2017-0092.
40. Gempt J., Bette S., Ryang Y.M., Buchmann N., Peschke P., Pyka T., Wester H.J., Förster S., Meyer B., Ringel F. 18F-fluoro-ethyl-tyrosine positron emission tomography for grading and estimation of prognosis in patients with intracranial gliomas. Eur J Radiol 2015; 84(5): 955-962, https://doi.org/10.1016/jejrad.2015.01.022.
41. Zehri A.H., Ramey W., Georges J.F., Mooney M.A., Martirosyan N.L., Preul M.C., Nakaji P. Neurosurgical confocal endomicroscopy: a review of contrast agents, confocal systems, and future imaging modalities. Surg Neurol Int 2014; 5(1): 60, https://doi.org/10.4103/2152-7806.131638.
42. Kiseleva E.B., Yashin K.S., Moiseev A.A., Snopova L.B., Gelikonov G.V., Medyanik I.A., Kravets L.Ya., Karyakin N.N., Vitkin I.A., Gladkova N.D. Quantitative cross-polarization optical coherence tomography detection of infiltrative tumor margin in a rat glioma model: a pilot study. Sovremennye tehnologii v medicine 2018; 10(1): 6, https://doi.org/10.17691/ stm2018.10.1.01.
