CC BY
44
2011
Известия ТИНРО
Том 165
УДК 575.174.015.3:597.553.2
Н.Ю. Шпигальская1, Вл.А. Брыков2, 3, А.Д. Кухлевский2, 3, О.Н. Сараванский1, А.В. Климов1, А.А. Четвертак1, Е.А. Шевляков1*
1 Камчатский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии, 683000, г. Петропавловск-Камчатский, ул. Набережная, 18;
2 Институт биологии моря им. A.B. Жирмунского ДВО РАН, 690041, г. Владивосток, ул. Пальчевского, 17; 3 Дальневосточный федеральный университет, 690600, г. Владивосток, ул. Суханова, 8
РЕГИОНАЛЬНАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ СМЕШАННЫХ МОРСКИХ СКОПЛЕНИЙ МОЛОДИ ГОРБУШИ (ONCORHYNCHUS GORBUSCHA) НА ОСНОВЕ ИЗМЕНЧИВОСТИ ФРАГМЕНТА СYTB/D-LOOP МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК
Выборки нерестовой горбуши проанализированы на значительной части северо-западной Пацифики. На основе анализа распределения частот 36 комбинированных гаплотипов митохондриальной ДНК горбуши линии четных лет произведена оценка межпопуляционной генетической дифференциации. Выявлен невысокий уровень генетической подразделенности между выборками внутри регионов, в то же время показана статистически значимая гетерогенность исследованных популяций на региональном уровне. С использованием нескольких статистических методов вычислены генетические расстояния и проведен кластерный анализ. На основании полученных данных выполнена оценка регионального состава смешанных морских выборок молоди горбуши в период нагула осенью 2009 г. Показано хорошее соответствие результатов идентификации региональной принадлежности по генетическим признакам с фактическими данными по вылову и нерестовым подходам горбуши в регионах в 2010 г. Дана перспективная оценка популяци-онно-генетическим исследованиям горбуши на основе изменчивости митохондри-ального генома.
Ключевые слова: горбуша, митохондриальная ДНК, полиморфизм мито-хондриального генома, популяционно-генетическая структура, дифференциация популяций, генетическая идентификация.
* Шпигальская Нина Юрьевна, кандидат биологических наук, заведующая лабораторией, e-mail: [email protected]; Брыков Владимир Алексеевич, доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией, заведующий кафедрой, e-mail: [email protected]; Кухлевский Андрей Данилович, кандидат химических наук, старший научный сотрудник, e-mail: [email protected]; Сараванский Олег Николаевич, инженер, e-mail: [email protected]; Климов Антон Владимирович, младший научный сотрудник, e-mail: [email protected]; Четвертак Анна Александровна, стажер-исследователь, e-mail: shpigalskaya.n.u@ kamniro.ru; Шевляков Евгений Александрович, кандидат биологических наук, заместитель директора, e-mail: [email protected].
Shpigalskaya N.Y., Brykov Vl.A., Kukhlevsky A.D., Saravansky O.N., Klimov A.V., Chetvertak A.A., Shevlyakov E.A. Regional identification of mixed aggregations of juvenile pink salmon Oncorhynchus gorbuscha in the sea on the base of mitochondrial DNA Cytb/D-loop fragment variety // Izv. TINRO. — 2011. — Vol. 165 . — P. 89-103.
Genetic variety of pink salmon is determined for nine local populations from Kamchatka and eight ones from Sakhalin Island and the Amur collected in even years in the period from 2004 to 2010 (980 specimens) on the base of the mtDNA Cytb/D-loop restriction fragments polymorphism. Genetic differentiation of the populations is assessed by frequency distribution of 36 combined mtDNA haplotypes. Genetic distances are calculated and the populations are clustered by several statistic methods. Genetic diversity within the regions is poor, but the regions are statistically heterogeneous. Taking these results into consideration, regional composition of juvenile pink salmon mixed aggregations in the sea is analyzed for trawl catches collected by RV Professor Kaganovsky in autumn 2009 (595 specimens). The results of genetic identification correspond well with the data on catches and runs of pink salmon in the regions in 2010, in particular for the populations from East Kamchatka and Sakhalin. The estimated portion of the population from West Kamchatka differed from the real data in 5.7 %. The maximal identification error was for the Amur population where the factual catch and total run were much less than estimations done from genetic analysis of juveniles in the period of their feeding. This error was possibly caused by insufficient sample size from this area for the genetic baseline or by underestimation of the spawners number.
Key words: pink salmon, mitochondrial DNA, mitochondrial genome polymorphism, population-genetic structure, differentiation of populations, genetic identification.
Введение
Горбуша Oncorhynchus gorbuscha (Walbaum) является самым многочисленным из тихоокеанских лососей видом, промысловое значение которого чрезвычайно велико на Дальнем Востоке России, где наибольший вклад в воспроизводство вносят локальные популяции п-ова Камчатка, о. Сахалин, Курильских островов и бассейна р. Амур. Среди представителей рода Oncorhynchus горбуша имеет самую простую возрастную структуру, скатываясь в море сеголетками, созревая и нерестясь на втором году жизни. Молодь после покатной миграции непродолжительное время обитает в прибрежных водах, затем откочевывает в открытые морские районы и далее — к местам зимнего нагула. Поколения горбуши представлены практически полностью репродуктивно изолированными линиями четных и нечетных лет.
Безусловно высокая промышленная значимость данного вида определяет необходимость не только стабильного мониторинга популяционных процессов, но и достаточно точного прогнозирования численности нерестовых популяций, что, в свою очередь, ставит задачи идентификации и оценки доли региональных комплексов и наиболее крупных популяционных систем в смешанных морских скоплениях в период нагула и преднерестовых миграций.
Характерное для данного вида генетическое различие смежных поколений было выявлено по всему ареалу (Салменкова и др., 1981; Beacham et al., 1985, 1988; Салменкова, 1989; Макоедов и др., 1993; Shaklee, Varnavskaya, 1994; Полякова и др., 1996; Brykov et al., 1996; Брыков и др., 1999; Чуриков, 2001; Churikov, Gharrett, 2002; Варнавская, 2006). В то же время на основе аллельной изменчивости аллозимных генов было показано, что для обеих линий горбуши — четных и нечетных лет — свойственна слабая пространственная дифференциация, минимальная среди видов тихоокеанских лососей (Алтухов и др., 1997). Количественные оценки степени генетической дивергенции у горбуши в два-пять раз ниже, чем у других видов рода Oncorhynchus (Животовский и др., 1989; Алтухов и др., 1997; Динамика ..., 2004). Оценки генетической дифференциации горбуши на основе полиморфизма микросателлитных локусов ядерной ДНК по-
казали, что представление о невысокой степени генетической дифференциации азиатской горбуши, сформировавшееся на основе изучения аллозимов, подтверждается и на уровне микросателлитной ДНК (Салменкова и др., 2006). Однако в ряде исследований было установлено, что, несмотря на относительно низкие оценки межпопуляционной генетической изменчивости, существует достаточно выраженная дифференциация на межрегиональном уровне (Gharrett et al., 1988; Животовский и др., 1989; Варнавская, 2006). При включении в анализ данных по 34-36 аллозимным генам удалось показать, что выборки кластеризуются в соответствии с их региональной принадлежностью (Варнавская, 2006).
Начатые ранее исследования популяционной дифференциации горбуши на основе полиморфизма митохондриальной ДНК, проведенные на примере четного поколения, позволили установить, что величина изменчивости, приходящаяся на межрегиональную компоненту, заметно превышает долю межпопуляционной дисперсии внутри региональных групп (Шпигальская и др., 2009). Необходимо отметить, что мтДНК имеет ряд преимуществ по сравнению с большинством других молекулярных маркеров: материнская наследуемость, высокая скорость накопления мутаций и отсутствие рекомбинаций. Эти свойства позволяют анализировать изменения, появляющиеся в частично или полностью изолированных популяциях в силу стохастических процессов на коротких интервалах времени (Gharrett et al., 2001a; Churikov, Gharrett, 2002).
Полученные к настоящему времени данные позволили определить цель исследования — выявление и оценка уровня полиморфизма мтДНК горбуши как маркера для идентификации региональной принадлежности смешанных морских скоплений.
Материалы и методы
Материалом для популяционного анализа послужили выборки горбуши четных лет возврата из 9 камчатских нерестовых рек, 8 локальностей о. Сахалин и из р. Амур. Всего исследовано 980 особей (20 выборок) (табл. 1, рис. 1).
Таблица 1
Локализация сбора и объем проанализированного материала из нерестовых рек горбуши
Table 1
Sample size and location of pink salmon sampling Год сбора Локализация выборок ПЦР и ПДРФ-анализ,
материала Район Река экз.
2004 Амур 78
оооооооооо ОООООООоООооо О. Сахалин Водопадная Бахура Бахура Фирсовка Фирсовка Поронай Айнская Очепуха Урюм Найба 37 49 50 50 50 49 49 49 50 38
2010 2008 2008 2008 Восточная Камчатка Навыринваям Дранка Апука Хайлюля 46 46 48 50
2008 2008 2008 2010 2010 Западная Камчатка Большая Палана Коль Утка Колпакова 47 48 48 48 50
Всего 980
136° 138° 140° 142° 144° 146° 148° 150° 152° 154° 156° 158° 160° 162° 164° 166°
Рис. 1. Локализация сбора материалов из нерестовых рек горбуши: 1 — Апука; 2 — Навыринваям; 3 — Дранка; 4 — Хайлюля; 5 — Большая; 6 — Утка; 7 — Коль; 8 — Колпакова; 9 — Палана; 10 — Поронай; 11 — Бахура; 12 — Найба; 13 — Фирсовка; 14 — Очепуха; 15 — Урюм; 16 — Айнская; 17 — Водопадная; 18 — Амур
Fig. 1. Rivers of pink salmon sampling: 1 — Apuka; 2 — Navyrinvayam; 3 — Dranka; 4 — Khailulya; 5 — Bolshaya; 6 — Utka; 7 — Kol'; 8 — Kolpakova; 9 — Palana; 10 — Poronai; 11 — Bakhura; 12 — Naiba; 13 — Firsovka; 14 — Ochepukha; 15 — Uryum; 16 — Ainskaya; 17 — Vodopadnaya; 18 — Amur
Материал для анализа регионального состава смешанных скоплений молоди горбуши был собран в период проведения осенней траловой съемки молоди горбуши в 2009 г. на НИС "Профессор Кагановский" в объеме 595 экз. (рис. 2).
Образцы ткани сердечной мышцы горбуши извлекали из свежевыловлен-ных рыб и фиксировали в этаноле. Тотальную ДНК выделяли стандартным способом с использованием метода протеиназного гидролиза в присутствии доде-цилсульфата натрия с последующим высаливанием белков, удалением их вместе с клеточными обломками центрифугированием и осаждением ДНК из суперна-танта изопропанолом (Sambrook et al., 1989).
Участок Cytb/D-loop мтДНК горбуши амплифицировали посредством поли-меразной цепной реакции (ПЦР) (PCR Technology, 1989) с использованием прай-мерных последовательностей, разработанных на других видах лососей (Zardoya et al., 1995; Gharrett et al., 2001a):
Cytb/D-loop 5' TGAA(G/A)ACCACCGTTGTTATTCAA 3'; 5' TAGGGCCTCTCGTATAACCG 3'.
Амплификацию проводили с использованием готовых лиофилизированных смесей для ПЦР GenePakPCR Core фирмы "ИзоГен" (Россия). Инкубационная смесь 20 мкл содержала буфер для ПЦР, 200 мкМ каждого дезоксирибонуклео-тида (dTTP, dCTP, dATP, dGTP), 1,5 мкМ MgCl2, 50 нг геномной ДНК и 100 нг специфического праймера. Реакцию начинали процессом денатурации в течение 3 мин при 95 оС, затем проводили 33 цикла, включающих 1 мин денатурации ДНК-матрицы при температуре 94 оС, 1 мин отжига праймеров при 48 оС и синтез новых цепей в течение 2 мин 30 с при 72 оС, затем следовала завершающая элонгация 5 мин при 68 оС.
162° 164° 166° 168° 17(1° 172° Г4" 176° 178° ¡80° ¡42° 144° 146° 148° 150° 152° 154° 156° 158° 160° 162°
Рис. 2. Локализация сбора проб для анализа регионального состава морских смешанных скоплений молоди горбуши в 2009 г.: А — в верхней эпипелагиали западной части Берингова моря; Б — в Охотском море, тихоокеанских водах Камчатки и северных Курильских островов; цифрами обозначен объем проанализированной выборки
Fig. 2. Location of sampling for analysis of regional composition of juvenile pink salmon mixed aggregations in the sea in 2009: A — in the western Bering Sea; Б — in the Okhotsk Sea and North-West Pacific; the numbers indicate the sample size
Изменчивость участка Cytb/D-loop исследовали на основе ПДРФ-анализа (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов), используя набор из 6 рест-риктных ферментов: Dde I, Hin6 I, Hinf I, Msp I, Rsa I, Sfr13 I. После реакции эндонуклеазного гидролиза аликвоты продуктов разделяли в горизонтальном блоке 2 %-ного агарозного геля (Маниатис и др., 1984). Для определения молекулярной массы образующихся фрагментов использовали маркерный набор фрагментов ДНК, кратных 100 парам оснований. Фрагменты ДНК в геле окрашивали этидиумбромидом и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете.
Результаты анализа изменчивости длины рестриктных фрагментов мтДНК каждой особи по всем рестрикционным сайтам объединяли, получая таким образом комбинированные гаплотипы.
Для оценки межпопуляционной генетической гетерогенности на уровне локальных стад и региональных популяционных комплексов применяли критерий X2 (Животовский, 1991). Нуклеотидную и гаплотипическую величины разнообразия рассчитывали по Нею (Nei, Tajima, 1983; Nei, 1987). Для оценки значимости межпопуляционных различий частот гаплотипов использовали методы F-статис-тики в пакете программ Arlequin2000 (Schneider et al., 2000). Оценку генетической изменчивости исследуемых популяций выполняли также в пакете программ Arlequin2000. Как мера количественных различий между популяциями были вычислены генетические расстояния с использованием хордового метода (Cavalli-Sforsa, Edwards, 1967) и метода Нея (Nei, 1987). Полученная матрица количественных значений дивергенции между популяциями была использована для кластерного анализа (пакет программ NTSYS) и построения дендрограмм (Rolf, 1990). Другим подходом к оценке генетического сходства популяций был метод многомерного шкалирования (Kruskal, 1964).
Для оценки вероятности идентификации региональной принадлежности смешанных выборок на основе полученных данных по генетической изменчивости использовали метод анализа симулированных смешанных выборок по нулевому сценарию в программе SPAM (Masuda et al., 1991; Pella et al., 1996). Программу
SPAM использовали также для идентификации регионального состава смешанных морских выборок молоди горбуши.
Результаты и их обсуждение
Длина фрагмента Cytb/D-loop составляет 2720 пар нуклеотидов, или около 15 % всего митохондриального генома горбуши (Gharrett et al., 2001b). Всего у 1575 исследованных особей было обнаружено 80 рестриктных сайтов, из которых 54 оказались полиморфными. Объединенные данные по всем сайтам рестрикции, полученные в результате анализа фрагмента Cytb/D-loop мтДНК с использованием 6 эндонуклеаз, позволили выявить 36 комбинированных гаплоти-пов у горбуши Камчатки, о. Сахалин, р. Амур и в смешанных морских выборках молоди.
Различия между выявленными вариантами гаплотипов по количеству, размеру и положению рестрикционных фрагментов мтДНК обусловлены мутационным замещением нуклеотидов (а также инсерциями, делециями или инверсиями) и образованием в указанных участках рестриктного сайта, опознаваемого соответствующей эндонуклеазой (Алтухов и др., 1997; Чуриков, 2001; Алтухов, Салменкова, 2002). Данные по изменчивости частот выявленных вариантов гап-лотипов являются основой для анализа популяционных различий и при условии одинаковой скорости накопления мутаций в рассматриваемых локальностях или регионах могут свидетельствовать о различном возрасте популяций, а при подтверждении достаточно значимой глубины межпопуляционной дивергенции указывать на принадлежность к различным потокам видового расселения.
Семь редких гаплотипических вариантов с минимальной частотой обнаружены только в морских выборках молоди и, вероятно, свойственны горбуше не исследованных нами регионов воспроизводства. Общими для речных и морских выборок являются 19 комбинированных гаплотипов.
Наибольшее число гаплотипических вариантов — 12 — выявлено у сахалинской горбуши 2008 года возврата — р. Бахура и в р. Амур (2004 г.). В выборках из рек п-ова Камчатка число гаплотипов ниже — от 4 (р. Навыринва-ям) до 9 (реки Коль и Апука).
В результате анализа распределения частот комбинированных гаплотипов удалось обнаружить, что только три из них являются общими для всех исследованных выборок — G1, G3 и G4. Гаплотип G4, который можно охарактеризовать как доминирующий, представлен во всех исследованных популяциях со средней частотой 0,423. Данный показатель варьировал от 0,271 (р. Апука, 2008 г.) до 0,580 (р. Хай-люля, 2008 г.). С наиболее высокой для рассматриваемых регионов средней частотой (0,482) гаплотип G4 обнаружен в выборках камчатской горбуши.
Вторым по встречаемости является гаплотип G1, его средняя частота — 0,247, диапазон варьирования от 0,021 (р. Коль, 2008 г.) до 0,440 (р. Урюм, 2010), причем у горбуши о. Сахалин популяционные частоты данного гаплотипа заметно выше.
Частота третьего общего для всех локальностей гаплотипа изменялась от 0,020 (р. Очепуха, 2009 г.) до 0,298 (р. Большая, 2008 г.) и в среднем составила 0,109. В наибольшей степени данный гаплотип представлен у камчатской горбуши.
Тринадцать гаплотипов обнаружены только в какой-либо одной из 20 речных выборок, причем 6 из них оказались свойственны популяциям о. Сахалин, а 4 — камчатской горбуше. Три гаплотипа с малой частотой выявлены только у особей из р. Амур. Вероятно, вышеуказанные редкие гаплотипы можно охарактеризовать как уникальные молекулярные маркеры, хотя в данном случае необходимо учитывать относительно небольшие объемы исследованных выборок, особенно с позиций поставленных задач популяционных исследований. Следует принимать во внимание, что редкие гаплотипы, являясь дискриминирующими, могут служить основой для идентификации особей соответствующих локальностей, что
определяет необходимость продолжения и расширения поисковых исследований в данной области.
Значения гаплотипического и нуклеотидного разнообразия в популяциях приводятся в табл. 2. Из представленных данных видно, что в целом для горбуши о. Сахалин характерны большее число полиморфных рестриктных сайтов и соответственно вариантов гаплотипов, а также более высокие показатели гапло-типического и нуклеотидного разнообразия, чем для камчатских популяций. Исключением являются выборки из рек Коль и Апука, в исследуемом фрагменте мтДНК которых, так же как и в большинстве сахалинских выборок, выявлены редкие гаплотипы, с малой частотой встречающиеся только в этих локальностях.
Таблица 2
Гаплотипическое и нуклеотидное разнообразие в популяциях горбуши п-ова Камчатка, о. Сахалин и р. Амур
Table 2
Haplotype and nucleotide diversity of pink salmon populations from Kamchatka,
Sakhalin and the Amur
Район, река, год N гапло-типов N полиморфных рестриктных сайтов Гаплотипическое разнообразие Нуклеотидное разнообразие
0. Сахалин
Водопадная, 2008 10 23 0,773+0,0489 0,06137+0,033991
Фирсовка, 2008, 2010 12 30 0,727+0,0295 0,05776+0,031655
Бахура, 2008, 2010 13 30 0,790+0,0262 0,06602+0,035629
Найба, 2010 9 23 0,787+0,0409 0,07235+0,039324
Поронай, 2010 9 22 0,698+0,0590 0,06084+0,033496
Айнская, 2010 11 27 0,804+0,0431 0,07785+0,041743
Очепуха, 2010 9 24 0,824+0,0326 0,08382+0,044634
Урюм, 2010 5 15 0,622+0,0396 0,04688+0,026696
П-ов Камчатка
Коль, 2008 9 22 0,706+0,0584 0,04669+0,026616
Утка, 2010 6 17 0,635+0,0509 0,04560+0,026086
Колпакова, 2010 7 26 0,651+0,0526 0,05039+0,028398
Большая, 2008 6 15 0,726+0,0373 0,03927+0,022995
Палана, 2008 6 16 0,633+0,0621 0,04384+0,025224
Хайлюля, 2008 6 15 0,609+0,0608 0,03744+0,022067
Дранка, 2008 7 17 0,766+0,0438 0,05952+0,032898
Навыринваям, 2010 4 12 0,637+0,0559 0,04141+0,024059
Апука, 2008 9 19 0,836+0,0240 0,05508+0,030707
Амур, 2004 12 25 0,718+0,0482 0,06024+0,032943
В табл. 3 приводятся результаты оценки гетерогенности включенных в анализ выборок из различных регионов, а также совокупности смешанных морских выборок. Наибольшее значение теста х2 было получено при общем анализе всех речных выборок. На уровне регионов вероятность гомогенности оказалась равной нулю во всех случаях, за исключением о. Сахалин, где р > 0,05. Выявлена статистически значимая неоднородность совокупности морских смешанных выборок молоди.
С использованием AMOVA (Analysis of Molecular Variance, пакет программ Arlequin2000) были получены оценки генетической изменчивости популяций горбуши (табл. 4). В первом варианте анализировали всю совокупность выборок. Расчеты показали, что на долю внутрипопуляционной генетической дисперсии приходится 97,19 %, на долю межпопуляционной — 2,81 %. В другом варианте расчетов популяции объединяли в три группы в соответствии с географической принадлежностью — п-ов Камчатка, о. Сахалин и р. Амур. При таком объединении было выявлено, что величина изменчивости, приходящаяся на межгрупповую компоненту, составляет 3,02 % и заметно превышает долю межпопуляцион-
Таблица 3
Оценки уровня гетерогенности региональных комплексов горбуши (df — число степеней свободы, р — уровень значимости)
Table 3
Heterogeneity of pink salmon regional complexes (df — number of degrees of freedom, p — significance level)
Вариант анализа N х2 df Р
Все выборки 18 812,1 476 Р < 0,001
О. Сахалин 8 145,0 126 Р > 0,050
П-ов Камчатка 9 213,2 112 Р < 0,001
Западная Камчатка 5 71,3 44 Р < 0,010
Восточная Камчатка 4 82,3 33 Р < 0,001
Смешанные морские выбо рки 12 343,4 275 Р < 0,010
Таблица 4
Оценки генетической изменчивости популяций горбуш и
Table 4
Heterogeneity of pink salmon populations
Вариант анализа Источник изменчивости Доля изменчивости, %
Межпопуляционная 2,81
Внутрипопуляционная 97,19
3 группы: Межгрупповая 3,02
п-ов Камчатка, о. Сахалин, Межпопуляционная 0,95
р. Амур Внутрипопуляционная 96,03
4 группы: Межгрупповая 2,44
западная Камчатка, восточная Межпопуляционная 1,07
Камчатка, о. Сахалин, р. Амур Внутрипопуляционная 96,49
ной дисперсии внутри групп, которая составляет 0,95 %. Доля внутрипопуляци-онной изменчивости (96,03 %) незначительно уменьшается по сравнению с предыдущим вариантом анализа. Несколько меньшее значение межгрупповой изменчивости наблюдалось при варианте анализа, когда были выделены 4 группы популяций (западная и восточная Камчатка, о. Сахалин и р. Амур), и составило 2,44 %, тогда как доли межпопуляционной дисперсии внутри групп и внутрипо-пуляционной изменчивости незначительно увеличились — соответственно 1,06 и 96,49 %.
Таким образом, полученные данные подтверждают значительную неоднородность азиатской горбуши на изучаемой части ареала по структуре мтДНК, а оценки межпопуляционной дифференциации в пределах регионов свидетельствуют о гораздо менее выраженной внутрирегиональной изменчивости, чем межрегиональной.
В результате применения методов ^-статистики для оценки уровня межпо-пуляционной изменчивости на основе изменчивости числа нуклеотидных замен обнаружено, что из 153 вариантов попарного сравнения выборок значимые различия были выявлены в 68 случаях, из которых большую часть составляют варианты попарного сравнения камчатских и сахалинских популяций (48 пар). От всех популяций п-ова Камчатка оказались отличны выборки горбуши из двух рек о. Сахалин — Очепуха и Найба, а выборки из рек Айнская, Водопадная, Урюм и Бахура значимо отличаются не от всех, но от большей части исследованных выборок камчатской горбуши. Среди камчатских популяций наиболее дифференцированы выборки рек Коль, Апука, Хайлюля и Навыринваям, причем выборка из р. Апука отлична от всех, кроме рек Колпакова и Утка. Основной вклад в гетерогенность исследуемой совокупности вносят выборки о. Сахалин, в заметно меньшей степени — рек п-ова Камчатка. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о значительной межпопуляционной дивергенции горбуши, ста-
тистические оценки которой достигают значимого уровня в 44 % случаев попарных сравнений.
Между всеми выборками были вычислены стандартные генетические расстояния по Нею (Nei, 1987) и в соответствии с хордовым методом (Cavalli-Sforsa, Edwards, 1967) проведен кластерный анализ. При представлении полученных результатов в виде UPGMA-дендрограммы (рис. 3) выборки из популяций горбуши п-ова Камчатка и о. Сахалин формируют достаточно четко выраженные кластеры, что в очередной раз свидетельствует о региональной подразделенности видового ареала. В кластере камчатских популяций подразделенность в соответствии с географической принадлежностью к западному или восточному побережью отсутствует. Наиболее обособленное положение при кластеризации заняли выборки рек Апука и Коль. Выборка из р. Амур оказалась в составе группы сахалинских популяций, имея наибольшее сходство с выборкой из р. Поронай (рис. 3). Таким образом, можно заключить, что расположение камчатских популяций на дендрограмме не показывает четкой картины дифференциации горбуши западной и восточной Камчатки на основе гаплотипической изменчивости мтДНК, а популяции о. Сахалин занимают относительно обособленное положение, подтверждая достаточно выраженный уровень региональной дивергенции.
р. Водопадная, 2008 р. Бахура, 2008 р. Фирсовка, 2010 р. Найба, 2010 р. Фирсовка, 2008 р. Бахура, 2010 р. Очепуха, 2010 р. Айнская, 2010 р. Амур, 2004 р. Поронай, 2010 р. Урюм, 2010 р. Большая, 2008 р. Палана, 2008 р. Навыринваям, 2010 р. Хайлюля, 2008 р. Колпакова, 2010 р. Утка, 2010 р. Дранка, 2008 р. Коль, 2008 р. Апука, 2008
]-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1
112,06 112,29 112,51 112,74 112,97
Коэффициент
Рис. 3. UPGMA-дендрограмма, построенная на основе хордовых генетических расстояний (Cavalli-Sforsa, Edwards, 1967), вычисленных по частотам комбинированных гаплотипов горбуши различных регионов
Fig. 3. UPGMA dendrogram built on the base of genetic chordal distances (Cavalli-Sforsa, Edwards, 1967) calculated from the frequencies of pink salmon combined haplotypes for different regions
Наряду с кластерным анализом было проанализировано расположение выборок в пространстве главных компонент (рис. 4). Все исследованные выборки поколения четных лет образовали две неперекрывающиеся области в соответствии с региональной принадлежностью — п-ов Камчатка и о. Сахалин, выборка из р. Амур заняла относительно обособленное положение, которое отражает большее ее сходство с сахалинскими популяциями.
Необходимо отметить, что во всех вариантах представления полученных результатов расположение выборок из одних и тех же локальностей разных лет
Рис. 4. Расположение выборок горбуши в пространстве главных компонент на основе изменчивости частот комбинированных гаплотипов мтДНК (I — первый главный фактор, II — второй главный фактор)
Fig. 4. Location of pink salmon samples on the diagram of two principle components calculated on the base of combined mtDNA haplotype frequency (I — PC-1, II — PC-2)
сбора (р. Бахура, 2008 и 2010 гг., р. Фирсовка, 2008 и 2010 гг.) указывает на их генетическое сходство. Данный факт свидетельствует о временной устойчивости использованных в данной работе маркеров популяционно-генетической изменчивости и их долговременной пригодности при создании базы генетических данных с целью последующей региональной идентификации смешанных морских скоплений горбуши.
Для решения практических задач исследования необходимо было оценить возможность популяционной и региональной идентификации горбуши на основании полученных данных по межпопуляционной изменчивости. Был проведен си-муляционный анализ выборок по нулевому сценарию. Вероятность популяцион-ной идентификации камчатской горбуши в целом невысока, точность ее находится в пределах 46,1-78,8 %. Для популяций о. Сахалин, точность идентификации которых несколько ниже, данный показатель варьировал в больших пределах — от 41,1 до 84,1 %. Можно отметить, что почти для всех исследуемых выборок большая часть "недостающих" процентов выпадает на генетически сходные локальности того же региона. Горбушу бассейна р. Амур возможно идентифицировать с точностью 64,2 %.
При оценке состава симулированных выборок на региональном уровне выявлено, что точность идентификации в данном случае повышается до 98,6 % для п-ова Камчатка и до 85,3 % для горбуши о. Сахалин (табл. 5, I вариант анализа). При раздельном выявлении групп популяций западного и восточного побережий Камчатки точность их идентификации снижается по сравнению с объединенным вариантом расчетов (табл. 5, II вариант анализа), хотя и остается на достаточно высоком уровне.
Полученные в настоящем исследовании результаты оценки популяционно-генетической дифференциации горбуши позволили на их основе провести иден-
Таблица 5
Оценка регионального состава симулированных смешанных выборок горбуши поколения четных лет, %
Table 5
Regional composition of simulated mixed samples for pink salmon generations in even years, %
I вариант анализа
Регион 1 2 3
1. О. Сахалин 85,35 0,81 22,12
2. П-ов Камчатка 13,20 98,61 12,85
3. Р. Амур 1,19 0,22 64,21
Неизвестные 0,26 0,36 0,82
X 100 100 100
II вариант анализа
Регион 1 2 3 4
1. О. Сахалин 85,35 0,51 1,55 22,12
2. Западная Камчатка 7,51 72,34 30,95 5,11
3. Восточная Камчатка 5,70 26,60 67,07 7,74
4. Р. Амур 1,19 0,05 0,29 64,21
Неизвестные 0,25 0,50 0,14 0,82
X 100 100 100 100
тификацию состава морских смешанных выборок молоди только на уровне регионов. Поскольку в охотоморских скоплениях молоди маловероятно присутствие особей из рек восточной Камчатки, для идентификации охотоморских выборок данные по восточнокамчатским популяциям были исключены из общей реперной базы. Как видно на рис. 5, состав смешанных выборок молоди горбуши, нагуливающейся в Охотском море в период с 23.10 по 15.11.2009 г., заметно различается в зависимости от района и, вероятно, от сроков сбора материала. Доли особей с генетическими признаками горбуши основных охотоморских районов в морских выборках изменяются в широких пределах. Так, доля горбуши западнокам-чатских стад в выборках варьирует от 9,8 до 80,3 %, сахалинских — от 13,7 до 80,4 % и амурских — от 0 до 43,8 %.
Следует отметить, что соотношение региональных группировок в каждой отдельно взятой морской выборке весьма условно в силу следующих обстоятельств.
Во-первых, в реперной базе данных пока представлены не все регионы Охо-томорского бассейна, и, во-вторых, объемы смешанных выборок не превышают 45-50 экз. (выборки с указанным на рис. 2 объемом 15 и 30 экз. были объединены в одну), что увеличивает погрешность статистических оценок.
Результаты региональной идентификации всей совокупности охотоморских и беринговоморских выборок, когда в анализ включены все 595 экз. молоди, показали, что соотношение региональных группировок в смешанных морских скоплениях следующее: западная Камчатка — 52,4 %, восточная Камчатка — 7,2, о. Сахалин — 27,1, р. Амур — 11,9, неизвестные — 1,4 % общей численности сеголеток.
Поскольку в октябре-ноябре молодь горбуши различных регионов воспроизводства уже миновала критическую адаптационную стадию раннего морского нагула, характеризующуюся наибольшей смертностью, можно предположить, что наблюдаемое в районах смешения соотношение разных региональных комплексов горбуши при условии равной морской смертности сохранится и к моменту возврата производителей на нерест в регионы.
Для того чтобы понять, насколько результаты идентификации по генетическим признакам объективны и соответствуют реальности, необходимо было срав-
142° 144° 146° 148° 1500 152° 154° 1560 158° 160° 162°
Рис. 5. Региональный состав смешанных морских скоплений молоди горбуши в Охотском море в период с 23.10 по 15.11.2009 г.
Fig. 5. Régional composition of mixed marine aggregation of juvenile pink salmon in the Okhotsk Sea for the period from October 23 to November 15, 2009
нить полученные в настоящем исследовании оценки с региональным соотношением подходов (фактический вылов и заполнение нерестилищ) горбуши в год возврата анализируемой молоди на нерест в регионы воспроизводства. Были использованы официальные данные по фактическому вылову горбуши в дальневосточном бассейне в 2010 г. и оценки бассейновых институтов по подходам производителей в регионы (рис. 6). Сравнение расчетных оценок и фактических данных позволяет сделать вывод об их достаточно высоком соответствии. Наиболее близки к реальности оказались доли восточнокамчатской и сахалинской горбуши. Расчетная оценка горбуши западной Камчатки всего на 5,7 % отличалась от фактической. Наибольшая погрешность выявлена для бассейна р. Амур, где нерестовые подходы были значительно ниже оценки доли молоди в период нагула по генетическим признакам, что может объясняться как недостаточным объе-
О -К..........................................................,..................................................................,.................................................................,...........
Западная Восточная о.Сахалин р.Амур
Камчатка Камчатка
Рис. 6. Региональное соотношение молоди из морских нагульных скоплений (осень 2009 г.), уловов и нерестовых подходов горбуши в 2010 г.: I — результаты идентификации по генетическим данным; II — подход производителей (фактический вылов и заполнение нерестилищ)
Fig. 6. Regional ratios for juvenile pink salmon in feeding aggregations in fall 2009 and in catches and spawning runs in 2010: I — identified from genetic data; II — catch and escapement
мом материала из данного региона в реперной базе генетических данных, так и возможным недоучетом вылова производителей и заполнения нерестилищ в этой крупной и труднодоступной речной системе.
Заключение
На основании представленных результатов возможность использования полиморфизма фрагмента Cytb/D-loop мтДНК в качестве информативного регионального маркера для анализа смешанных уловов горбуши представляется достаточно перспективной. Дифференциация горбуши на уровне регионов не вызывает сомнений, что же касается внутрирегиональной подразделенности, то этот вопрос требует продолжения исследований с подключением в анализ максимально возможного количества выборок из наиболее значимых нерестовых водоемов и увеличения их объемов до 90-100 экз. Существует необходимость расширения района исследований и обязательного анализа таких значимых регионов воспроизводства, как южные Курильские острова, материковое побережье Охотского моря и Японские острова.
Авторы выражают, искреннюю признательность сотрудникам ФГУП "КамчатНИРО" Н.М. Кинас, И.В. Шатило, А.Н. Ходько, И.Н. Кирееву, И.Н. Сиротенко, Д.С. Курносову, а также сотрудникам ХоТИНРО С.Ф. Золотухину, В.И. Островскому и др. за неоценимую помощь в сборе генетических проб.
Список литературы
Алтухов Ю.П., Салменкова Е.А. Полиморфизм ДНК в популяционной генетике // Генетика. — 2002. — Т. 38, № 9. — С. 1173-1195.
Алтухов Ю.П., Салменкова Е.А., Омельченко В.Т. Популяционная генетика лососевых рыб : монография. — М. : Наука, 1997. — 287 с.
Брыков В.А., Полякова Н.Е., Скурихина Л.А. и др. Популяционно-генетичес-кая структура у горбуши Oncorhynchus gorbuscha (Walbaum) по результатам рестрик-тазного анализа митохондриальной ДНК: динамика изменчивости в поколениях // Генетика. — 1999. — Т. 35, № 5. — С. 657-665.
Варнавская Н.В. Генетическая дифференциация популяций тихоокеанских лососей : монография. — Петропавловск-Камчатский : КамчатНИРО, 2006. — 488 с.
Динамика популяционных генофондов при антропогенных воздействиях :
монография / под ред. Ю.П. Алтухова. — М. : Наука, 2004. — 619 с.
Животовский Л.А. Популяционная биометрия : монография. — М. : Наука, 1991. — 267 с.
Животовский Л.А., Глубоковский М.К., Викторовский P.M. и др. Генетическая дифференциация горбуши // Генетика. — 1989. — Т. 25, № 7. — С. 1261-1274.
Макоедов А.Н., Пустовойт С.П., Ермоленко Л.Н. и др. Популяционно-генети-ческое исследование горбуши, размножающейся в реках Северо-Востока России // Генетика. — 1993. — Т. 29, № 8. — С. 1366-1374.
Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование : монография. — М. : Мир, 1984. — 479 с. (Пер. с англ.)
Полякова Н.Е., Скурихина Л.А., Кухлевский А.Д. и др. Популяционно-гене-тическая структура у горбуши Oncorhynchus gorbuscha (Walbaum) по результатам рес-триктазного анализа митохондриальной ДНК. Сравнение неперекрывающихся поколений четных и нечетных лет // Генетика. — 1996. — Т. 32, № 9. — С. 1256-1262.
Салменкова Е.А. Основные результаты и задачи популяционно-генетических исследований лососевых рыб // Генетика в аквакультуре. — Л. : Наука, 1989. — С. 7-29.
Салменкова Е.А., Гордеева Н.В., Омельченко В.Т. и др. Генетическая дифференциация горбуши Oncorhynchus gorbuscha (Walbaum) в азиатской части ареала // Генетика. — 2006. — Т. 42, № 10. — С. 1371-1387.
Салменкова Е.А., Омельченко В.Т., Малинина Т.В. и др. Популяционно-гене-тические различия между смежными поколениями у горбуши, размножающейся в реках азиатского побережья Северной Пацифики // Генетика и размножение морских животных. — Владивосток : ДВНЦ АН СССР, 1981. — Вып. 2. — С. 95-104.
Чуриков Д.Ю. Генеалогия гаплотипов митохондриальной ДНК у нескольких видов тихоокеанских лососей : автореф. дис. ... канд. биол. наук — СПб. : СПбГУ, 2001. — 17 с.
Шпигальская Н.Ю., Брыков В.А., Кухлевский А.Д. Полиморфизм мтДНК горбуши Камчатки и о. Сахалин // Исследования водных биологических ресурсов Камчатки и северо-западной части Тихого океана : сб. науч. тр. КамчатНИРО. — 2009. — Вып. 13. — С. 74-87.
Beacham T.D., Withler R.E., Gould A.P. Biochemical genetic stock identification of pink salmon (Oncorhynchus gorbuscha) in southern British Columbia and Puget Sound // Can. J. Fish. Aquat. Sci. — 1985. — Vol. 42, № 9. — P. 1474-1483.
Beacham T.D., Withler R.E., Murray C.B., Barner L.W. Variation in body size, morphology, egg size, and biochemical genetic of pink salmon in British Columbia // Trans. Amer. Fish. Soc. — 1988. — Vol. 117, № 2. — P. 109-126.
Brykov V.A., Polyakova N.E., Skurikhina L.A., Kukhlevsky A.D. Geographical and temporal mitochondrial DNA variability in populations of pink salmon // J. Fish. Biol. — 1996. — Vol. 48. — P. 899-909.
Cavalli-Sforsa L.L., Edwards A.W.E. Phylogenetic analysis: models and estimation procedures // Am. J. Hum. Genet. — 1967. — Vol. 19. — P. 233-257.
Churikov D.U., Gharrett A.J. Comparative phylogeography of the two pink salmon brodlines: An analysis based on a mitochondrial DNA genealogy // Mol. Ecol. — 2002. — Vol. 11. — P. 1077-1101.
Gharrett A.J., Gray A.K., Brykov V.A. Phylogeographical analysis of mitochondrial DNA variation in Alaskan coho salmon, Oncorhynchus kisutch // Fish. Bull. — 2001a. — Vol. 99. — P. 528-544.
Gharrett A.J., Lane S., McGregor A.J., Taylor S.G. Use the genetic marker to examine genetic interaction among subpopulations of pink salmon (Oncorhynchus gorbuscha) // Genetica (Niderl.). — 2001b. — Vol. 111. — P. 259-267.
Gharrett A.J., Smoot С., McGregor A.J., Holmes P.B. Genetic relationships of even-year nothwestern Alaskan pink salmon // Trans. Amer. Fish. Soc. — 1988. — Vol. 117, № 2. — P. 536-545.
Kruskal J.B. Nonmetric multidimensional scaling: a numerical method // Psychometri-ka. — 1964. — Vol. 29. — P. 28-42.
Masuda M., Nelson S., Pella J. The computer programs for computing conditional maximum likely estimates of stock composition from discrete characters : USA-Doc-NOAA NMFS Rep. — Auke Bay Laboratory, US-Canada Salmon Program, Juneau, AK, 1991. — 72 p.
Nei M. Molecular evolutionary genetics. — N.Y. : Columbia Univ. Press, 1987. — 512 p.
Nei M., Tajima F. Maximum likelihood of the number of nucleotide substitution from restriction sites data // Genetics. — 1983. — Vol. 105. — P. 207-217.
PCR Technology. Principles and Applications for DNA Amplification / ed. H.A. Erlich. — N.Y. : Stockton Press, 1989. — 246 p.
Pella J., Masuda M., Nelson S. Search algorithms for computing stock composition of mixture from traits of individuals by maximum likelihood : USA-Doc-NOAA-NMFS-61 Tech. Memo. — Washington, 1996. — 68 p.
Rolf F.J. NTSYS-ps: Numerical taxonomy and multivariate analysis system. Version. 1.60. — N.Y. : Exter publishing, Ltd, 1990.
Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. — N.Y. : Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989. — 1626 p.
Schneider S., Roessli D., Excoffier L. Arlequin ver. 2.000: A software for population genetics data analysis. — Geneva, Switzerland : Genetics and Biometry Laboratory, Univ., 2000.
Shaklee J.B., Varnavskaya N.V. Electrophoretic characterizations of odd-year pink salmon (Oncorhynchus gorbuscha) population from the Pasific coast of Russia, and comparison with selected North American population // Can. J. Fish. Aquat. Sci. — 1994. — Vol. 51. — P. 158-170.
Zardoya R., Garrido-Pertierra A., Bautista J.M. The complete nucleotide sequence of the mitochondrial DNA genome of the rainbow trout, Oncorhynchus mykiss // J. Mol. Evol. — 1995. — Vol. 41. — P. 942-951.
Поступила в редакцию 10.02.11 г.
