CC BY
17
9. Jordan M., McHughen A. Transformed callus does not necessarily regenerate transformed shoots // Plant Cell Rep. - 1988. - V. 7. - P. 285-287.
10. Lane D.W. Influence of growth regulators on root and shoot initiation from flax meristem-tips and hypocotyls in vitro //Physiol. Plant. - 1979. - V. 45. - P. 260-264.
11. McHughen A. Agrobacterium-mediated gene transfer of chlorsulfuron resistance to commercial flax cultivars // Plant Cell Rep. - 1989. - V. 8. - P. 445-449.
12. McHughen A., Jordan M.C. Recovery of transgenic plants from "escape" shoots // Plant Cell Rep. - 1989. - V. 7. - P. 611-614.
13. High efficiency Agrobacterium-mediated gene transfer to flax / Mlynarova L., Beuer M., Nap J.-P., Pretova A. // Plant Cell Rep. - 1994. - V. 13. - P. 282-283.
14. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. - 1962. - V. 15. - P. 473-497.
15. Transformation plants of flax / Polyakov A.V., Chikrizova O.F., Kalyaeva М.А., Zacharchenko N.C., Balochina N.V., Buryanova Z.I. // Physiol. Plant. - 1998. - V. 45, N 6. -P. 882-887.
16. Sambrook J., Fritsch EF., Maniatis T. Molecular Cloning. Book 1. - New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. - P. 630-631.
17. Ueda K., Matsuyma T., Hashimoto T. Visualisation of microtubules in living cells of transgenic Arabidopsis thaliana L. // Protoplasma. - 1999. - V. 206 - P. 201-206.
18. The development of transformation vectors based upon modified plant a-tubulin gene as a selectable marker / Yemets A., Radchuk V., Bayer O., Bayer G., Baird V., Blume Ya. // Cell. Biol. Int. - 2008. - V. 32, N 5. - P. 566-570.
РЕГЕНЕРАЦ1Я УКРАШСЬКИХ СОРТ1В КАРТОПЛ1 ТА IX ГЕНЕТИЧНА ТРАНСФОРМАЦ1Я СИНТЕТИЧНИМИ СЯГ-ГЕНАМИ
1 о
В.П. ЖУК ; Т.М. ОЛШНИК , кандидат сгльськогосподарських наук;
Я.Б. БЛЮМ1, доктор бюлог1чних наук; A.I. СМЕЦЬ1, кандидат бюлог1чних наук Институт харчово'1 бютехнологи та геномши, Нащональна академiя наук Украши, Кш'в 1нститут картоплярства, Украшська академiя аграрних наук, Кш'в
Вступ
Картопля (Solanum tuberosum L.) е одшею з основних продовольчих сшьськогосподарських культур, як вирощують в Укршш, i стшко займае перше мюце в овочевому ращош жшешв нашо1 краши. Одшею з основних задач селекцiонерiв на сьогодшшнш день е тдвищення споживчих якостей картоплi на фош повного виключення хiмiчних засобiв захисту рослин, використання еколопчно безпечних методiв та засобiв пригшчення бур'яшв i комах-шкщниюв, як забезпечують запоб^ання забруднення навколишнього середовища та врожаю картопш токсичними речовинами. Найбiльш злiсними для картопш е комахи-шкiдники, якi можуть повшстю знищувати як наземну частину рослин, так i пiдземну, i призводити до повно'1 або значно'1 втрати врожаю данно'1 культури. Широко застосовують для боротьби з такими шкщниками ефективнi препарати на основi Bt-бiлкiв бактерп BасШus thuringiensis, як е активними iнсектицидними агентами [1, 7]. Перевагами бiопестицидiв на основi Bt-бiлкiв у порiвняннi з хiмiчними iнсектицидами е вiдсутнiсть забруднених залишюв, висока специфiчнiсть дп, що обумовлюе 1х нешкiдливiсть для нецiльових органiзмiв i вiдносно низька цiна [1, 2, 6].
Необхщно вiдмiтити, що протягом останшх десятилiть були устшно розвиненi рiзнi прийоми культивування та регенерацп картоплi в умовах in vitro. Для ще! сшьськогосподарсько! культури достатньо добре розроблеш ефективнi методи переносу
гешв за допомогою агробактерiальноi [12, 14, 17] та бюлютично'' трансформацп [11, 13].
Тому метою дано'' роботи була розробка протоколiв ефективно'' регенерацп рiзних сор^в картоплi украшсько'' селекцп, оцiнка ix регенерацшно'' здатностi в культурi in vitro та розробка протоколу трансформацп цих сор^в з використанням синтетичних Cry-гешв, що забезпечують стiйкiсть до рiзного роду комаx-шкiдникiв.
Об'екти та методи дослщження
Рослинний Mamepian. В експериментах використовували чотири висококрохмальш сорти картопш укра'нсько'' селекцп: Левада i Вернiсаж ('спвш сорти), Свiтанок i Зарево (теxнiчнi сорти) з сортово'' колекцп 1нституту картоплярства УААН. Стерильш рослини даних сорт1в розмножували in vitro на середовищ^ що мютило солi i вiтамiни MS [10].
Ыдукщя калюсогенезу з рослин картопл1 Для отримання первинного калюсу на експлантах картогш були протестоваш поживш сердовища, що Mi стили Taxi комбшацп регулятор!в росту: 1) 1 мг/л а-нафтилоцтово! кислоти (НОцК) i 1 мг/л транс-зеатину [8]; 2) 0,8 мг/л зеатин-рибозиду та 2 мг/л 2,4-дихлорфеноксюцтово' кислоти (2,4-Д) [3, 16]; 3)
1 мг/л транс-зеатину та 0,1 мг/л НОцК [5]; 4) 5 мг/л НОцК та 0,5 мг/л кшетину [16]. Вс середовища мютили мiнеральнi солi та в^амши MS, а також 3%-ну сахарозу, 8%-ний агар, рН середовищ дорiвнював 5,7. Калюс витримували на цих поживних середовищах протягом 6 тижшв, ефективнiсть кожного середовища оцiнювали за наявшстю калюсоутворення на експлантах картопш (тобто появи калюсних колонiй бшьше нiж 1-2 мм), розмiром та морфолопею отриманих калюсiв. Морфологiчно калюси розрiзняли за кольором, структурою поверхш, оводненiстю та щiльнiстю.
Ыдукщя регенерацп рослин картопль Для шдукцп регенерацп калюсно'' культури використовували поживнi середовища, що мютили солi та в^амши MS з додаванням рiзниx регуляторiв росту: 1) 1 мг/л транс -зеатину [8]; 2) 0,8 мг/л зеатин-рибозиду та 2 мг/л GA3 (пберелшу) [3]; 3) 1 мг/л трансзеатину [5]; 4) 0,1 мг/л НОцК i
2 мг/л бензиламшопурину (БАП) (табл. 1). Кожне середовище додатково мютило 2%-ну сахарозу та 8%-ний агар, при рН 5,7. Приблизно через 20 дiб калюс, що утворився на вщповщному середовищi для калюсогенезу, переносили на середовище для регенерацп пагошв та культивували на св^ль Отримаш регенероваш рослини переносили потiм на безгормональне середовище MS для 'х подальшого росту та розвитку.
КонструкцИ для трансформацп. Для генетично'' трансформацп було використано 5 штамiв A. tumefaciens, що мали бшарш векторш конструкцп з рiзними синтетичними Cry-генами - Cry1Ac, Cry1C i Cry2Aа2, якi перебувають пiд контролем d35S-промотору вiрусу моза'ки цв^но'' капусти, або тканиноспецифiчного промотору STLS (Solanum tuberosum leaf specific promoter) iз картопш, який забезпечуе експресiю гена штересу в листках. В якосп селективних маркерних генiв кожен з п'яти векторiв мiстив ген nptII, що забезпечуе стiйкiсть до канамщину. Штами були люб'язно наданi професором I. Альтасааром (Ушверситет Отави, Канада).
Трансформаця та селекщя трансгених лШй. A. tumefaciens вирощували на середовищi LB [9] з додаванням 50 мг/л канамщину. Беспосередньо перед трансформащею бактер^ нарощували при 28°С протягом 24 год при постшному погойдуванш на орб^альному шейкерi у темрявь В якостi експлантiв використовували листковi диски i мiжвузля пагонiв розмiром 5-7 мм 4-6-тижневих рослин. Для здшснення ефективного переносу Cry-генiв агробактерiальну трансформацiю проводили згiдно з протоколами, описаними рашше [3, 5, 8].
Результати та обговорення
Спочатку нами були проведет експерименти з вивчення ефективносп калюсоутворення та здатностi до регенерацп рослин з експланпв листя та мiжвузлiв пагонiв
чотирьох сортГв картоплГ Левада, Вернюаж, СвГтанок i Зарево (табл.). Для цього використовували кшька типiв середовищ, запропонованих ранiше [3, 5, 8, 16]. Було встановлено, що найбшьш оптимальним поживним середовищем для шдукци структурованого та щшьного калюсу виявивлося те, що мютило комбiнацiю регуляторiв росту НОцК та кшетину у концентраци 5 мг/л та 0,5 мг/л, вщповщно [16]. За таких умов через чотири тижш спостерГгали iнтенсивне утворення добре розвинутого калюсу з ембрюгенними структурами на його поверхнГ На середовищi 2 (табл.), що мiстило 1 мг/л трансзеатину та 0,1 мг/л НОцК, новоутворений калюс, на вщмшу вiд iнших, на перших етапах мав яскраво-зелене забарвлення та достатньо щшьну структуру. Однак при подальшому культивуваннi спостерiгалося iнгiбування процесу калюсогенезу i калюс поступово гинув. Результати впливу шших двох середовищ наведено також у таблицГ
Таблиця
Оцшка ефективностi калюсоутворення та регенерацшноТ здатностi в культурi ш гкго рпних сортiв картоплi украУнськоУ селекцн
Середовище* Сорт
СвГтанок ВернГсаж Зарево Левада
Калюсоутв. Рег-щя Калюсоутв. Рег-щя Калюсоутв. Рег-щя Калюсоутв. Рег-щя
1 12,4% 7,% 14,6% 5,6% 12,0% 6,1% 10,7% 3,4%
2 19,0% 21,1% 13,0% 16,0% 17,3% 11,4% 8,4% 15,9%
3 2,1% 0% 1,3% 0% 1,4% 1,1% 1,5% 0%
4 33,4% - 30,5% - 30,1% - 29,4% -
5 - 42,1% - 40,1% - 43,0% - 38,0%
ПримГтка: *1 - Gustafson ^ а1. (2006), 2 - Beaujean ^ а1. (1998), 3 - Бе В1оск (1988), 4 - ТигЬап (2004), 5 - М8, з додаванням 0,1 мг/л НОцК Г 2 мг/л БАП. Скорочення: калюсоутв. -ефективнГсть калюсоутворення; рег-цГя ефективнГсть регенерацii рослин картоплГ
Наступним кроком було проведення ощнки регенерацшно!' здатносп отриманого калюса, показник яко'1 визначали за кшькютю пагонiв, що утворилися до загально'1 кiлькостi органогенного калюса (у %). Як видно з отриманих даних, на середовищi 3, що мютило 1 мг/л трансзеатину, регенеращя пагошв з калюсу майже уах сортiв не вiдбувалася, окрГм сорту Зарево, де рiвень регенерацп теж зберiгався на дуже низькому рiвнi (1,1%). На середовищi 1 рiвень регенерацп був вищий, але пагони розвивалися досить повшьно. Виходячи з цього, нами було зроблено висновок, що для збшьшення регенерацшно!' здатносп, необхiдно додавати у середовище ауксин, бо навiть у незначнш концентрацп цей регулятор росту тдвищуе здатнiсть калюсно'1 культури до диференщацп. Серед дослiджених середовищ найбiльшу ефективнГсть регенерацп спостерiгали на середовищi 5, запропонованному нами (табл.), яке мютило 0,1 мг/л НОцК г 2 мг/л БАП (рис. 1 А).
За даними наших досшджень, серед тестованих експлантГв високу здатшсть до регенерацп рослин мали мГжвузля пагошв усГх чотирьох сортГв картоплГ, тодГ як листковГ експланти виявляли незначну здатшсть до утворення пагошв. Необхщно вщмГтити, що найбГльш успГшно регенерували сорти картоплГ СвГтанок, ВернГсаж Г Зарево (табл.).
Рис. 1. Результати трансформацп' картоплi конструкщею p2AST PRD: А - селекщя експланпв картоплi сорту Свгганок на середовищi з 100 мг/л канамщину; Б -вигляд регенерованоУ лшп картоплi сорту Зарево in vivo на середовищi з канамщином; В - трансгенна лiнiя сорту Свiтанок в умовах теплищ. Масштаб: в 1
см - 8,3 мм (А), 1,25 см (Б), 0,36 см (В)
Необхщно вщзначити, що на Bcix середовищах (окрiм 3) спостерiгався спонтанний ризогенез. На cередовищi 4 [16] взагалi не вiдбувалоcя регенерацп пагошв з екcплантiв картоплi вciх тестованих cортiв, а йшло лише штенсивне коренеутворення на ïx поверхнi.
На даний час розроблено рiзноманiтнi методи трансформацп картопш, якi характеризуються певними вщмшностями, що залежать саме вщ типу обраного експланта [15]. У наших дослщах в якоcтi експланпв були викориcтанi лиcтковi диски та мiжвузля картоплi. Для здiйcнення ефективно'1' агробактерiальноï трансформацп чотирьох cортiв картопш в основу було покладено декшька протоколiв [3, 5, 8]. Також додатково було проведено добiр умов для устшного переносу синтетичних Cry-гешв до картоплi. Так, згiдно з кшцевим протоколом, експланти занурювали в агробактерiальну cуcпензiю на 30 хв, потсм культивували на cередовищi для шдукци калюсу [16] з фотоперiодом 16 год. Пюля трьох дiб культивування експланпв проводили cелекцiю транcформантiв на cередовищi для шдукцп калюсу [16], що мютило 100 мг/л канамщину i 300 мг/л цефатоксиму. Протрансформоваш тканини пересаджували кожн два тижн на cвiже поживне середовище з селективним агентом. Для регенерацп рослин експланти переносили на розроблене нами середовище, яке мютило 0,1 мг/л НОцК i 2 мг/л БАП, з селективним агентом. Вщселектоваш рослини в подальшому висаджували на безгормональне середовище MS.
Пюля трансформацп за допомогою A. tumefaciens листкових дисюв i мiжвузля нами було отримано лшп рослин вcix cортiв картопш - Левада, Вернicаж, Свiтанок i Зарево, здатних зростати i розмножуватися на селективному cередовищi (рис. 1 Б). Вщселектоваш лшп, здатш до штенсивного коренеутворення, в подальшому були адаптоваш для вирощування у вщкритому грунтi (рис. 1 В). Хоча рют регенерантiв на середовищах з канамщином е опосередкованим доказом трансгенно'1' природи лшш, для пiдтвердження штеграцп перенесених генiв у геном трансформованих рослин буде проведено молекулярно-генетичний аналiз з використанням методу ПЛР для виявлення штеграцп селективного маркерного гена ntpII та CVj-гешв.
Висновки
Визначено оптимальну комбшащю регуляторiв росту для устшного калюсоутворення у сорпв картоплi Зарево, Левада, Св^анок i Вернicаж (5 мг/л НОцК i 0,5 мг/л кшетину), а також для регенерацп рослин картопш (0,1 мг/л НОцК i 2 мг/л БАП).
Оптимiзовано протокол агробактерiальноi трансформацп вищезазначених сортiв картоплi. Вщселектовано лшп рослин сортiв Зарево, Левада, Св^анок i Вернiсаж на селективному середовищi i перенесено ix для вирощування в теплицю для проведення подальших молекулярних та бiологiчниx аналiзiв.
Список л1тератури
1. Разработка биопестицидов против колорадского жука / Добрица А.П., Корецкая Н.Г., Гайтан В.И., Коломбет Л.В., Дербышев В.В., Жиглецова С.К. // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева). - 2001. - Т. XIV. - С. 5-6.
2. The biotechnology of Bacillus thuringiensis / Andrews R.E., Jr., Faust R.M., Wabiko H., Raymond K.C., Bulla L A. // Crit. Rev. Biotechnol. - 1987. - V. 6, № 2. - Р. 163-232.
3. Agrobacterium-mediated transformation of three economically important potato cultivars using sliced intermodal explants: an efficient protocol of transformation / Beaujean A., Sangwan R.S., Lecardonnel A., Sangwan-Norreel B.S. // J. Exp. Bot. - 1998. - V. 49. - Р. 1589-1595.
4. Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis / Crickmore N., Zeigler D.R., Feitelson J., Schnepf E., van Rie J., Lereclus D., Baum J., Dean D.H. // Mol. Biol. Rev. -1998. - V. 62. - Р. 807-813.
5. De Block M. Genotype-independent leaf disc transformation of potato (Solanum tuberosum) using Agrobacterium tumefaciens // Theor. Appl. Genet. - 1988. - V. 76 - P. 767-774.
6. Federici B.A., Maddox J.V. Host specificity in microbe-insect interactions // Bioscience. - 1996. - V. 46, № 6. - P. 410-421.
7. Feitelson J.S., Payne J., Kim I CryV has been proposed to designate a class of toxin genes that are nematode-specific // BioTech. - 1992. - V. 10 - P. 271-275.
8. Transformation and plant regeneration from leaf explants of Solanum / Gustafson V., Mallubhotla S., MacDonnell J., Sanyal-Bagchi M., Chakravarty B., Wang-Pruski G., Rothwell1 C., Audy P., DeKoeyer D., Siahbazi M., Flinn B., Regan S. // Plant Cell Tiss. Org. Cult. - 2006. - V. 85. - P. 361-366.
9. Miller J.H. Experiments in molecular genetics // Cold Spring Ш^к Laboratory. -Cold Spring Harbor: N.Y., 1972. - 466 р.
10. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. - 1962. - V. 15. - P. 473-497.
11. Nguyen T.T., Nugent G., Dix P. Biolistic transformation of potato (Solanum tuberosum L.) // Plant Biotechnology: 10th IAPTC&B Congress. Orlando, June 2002. -Orlando, Florida, 2002. - Р. 127.
12. Plant regeneration from leaf tissues of four North Dakota genotypes of potato (Solanum tuberosum L.) / Park Y.D., Ronis D.H., Boe A.A., Cheng Z.M. // Am. Potato J. -1995. - V. 72. - P. 329-338.
13. Transformation of potato (Solanum tuberosum) using particle bombardment / Romano A., Raemakers K., Visser R., Mooibroek H. // Plant Cell Rep. - 2001. - V. 20. - P. 198-204.
14. One-step transformation to two Andean potato cultivars (Solanum tuberosum L. subsp. andigena) / Trujillo C., Rodriguez-Arango E., Jaramillo S., Hoyos R., Orduz S., Arango R. // Plant Cell Rep. - 2001. - V. 20. - P. 637-641.
15. Stable chloroplast transformation in potato: use of green fluorescent protein as a plastid marker / Sidorov V.A., Kasten D., Pang S.Z., Hajdukiewicz P.T.J., Staub J., Nehra N. // Plant J. - 1999. - V. 19. - P. 209-216.
16. Turhan H. Callus induction and growth in transgenic potato genotypes // Afr. J. Biotech. - 2004. - V. 3, N 8. - P. 375- 78.
17. Visser R.G.F. Regeneration and transformation of potato by Agrobacterium tumefaciens // Plant Tissue Culture Manual. - Dordrecht; Boston; London: Kluwer Academic Publ., 1991. - V. B5. - P. 1-9.
