CC BY
34
Новые научные разработки и технологии
УДК 616.127-005.8:612.014.481
РЕГЕНЕРАЦИЯ ПЕРИРУБЦОВОЙ ЗОНЫ МИОКАРДА ПРИ КОМБИНИРОВАННОЙ РЕВАСКУЛЯРИЗАЦИИ (ЛАЗЕР ПЛЮС КЛЕТКИ) НА МОДЕЛИ ХРОНИЧЕСКОЙ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ СЕРДЦА
П.М. Ларионов, А.М. Чернявский, В.И. Бондарь, А.В. Бочарова*, Д.В. Субботин, Д.С. Сергеевичев,
Р.Б. Новрузов, А.М. Караськов
ФГУ «Новосибирский НИИ патологии кровообращения им. акад. E.H. Мешалкина Росмедтехнологий»
* Городская клиническая больница № 5, Барнаул
cpsc@meshalkinclinic.ru
Ключевые слова: реваскуляризация миокарда, микроциркуляция, регенерация, кардиомиоцит.
На сегодняшний день, остается неясной возможность регенерации миокарда «взрослого сердца» вообще и в условиях улучшения микроциркуляторного русла. Сейчас считается, что кардиомиоциты (КМЦ) сердца человека после года от момента рождения не способны к гиперпластической регенерации, возможна только внутриклеточная регенерация. Более того, рядом авторов было показано, что число кардиомиоцитов в течение жизни не меняется [6, 11].
Однако ряд экспериментальных исследований последних лет и клинических наблюдений в области трансплантологии позволил предположить несколько гипотез клеточного обновления миокарда: регенерация миокарда может происходить за счет пролиферации резидентных (эндогенных) стволовых клеток миокарда при его повреждении; показана возможность трансдифференцировки клеток костномозгового происхождения в кардиоциты [5,
12, 14, 15].
Цель нашей работы - анализ репаративных процессов кардиоцитов перирубцовой зоны в условиях изменения микроциркуляции после комбинированного воздействия - лазерной реваскуля-ризации и имплантацией в лазерные каналы мононуклеарной фракции клеток костного мозга (МНФ ККМ).
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Работа выполнена на 14 беспородных собаках массой от 11 до 14 кг. Всем животным выполнялась моделирование острого инфаркта миокарда, спустя 3 месяца, 9 животным проводилась комбинированная реваскуляризация миокарда перирубцовой области. В 8-12 лазерных каналов имплантировались аутологичные клетки МНФ КМ. Суммарное количество имплантируемых клеток 5 х 106. Детальное описание методики реваскуля-ризации и клеточного процессинга представлены в следующих публикациях [1, 2, 4]. Для профилактики эктопической оссификации был обязательным этап сепарации МНФ ККМ на пластике 30 мин [2,
3]. Через месяц после комбинированной реваску-ляризации животные выводились из эксперимента. Пять животных с постинфарктным рубцом были использованы в качестве контроля время экспозиции ишемии 3 месяца.
Для морфологической оценки использованы фрагменты миокарда левых желудочков миокарда перирубцовой области.
Плотность артериол оценивалась по позитивной реакции на выявление щелочной фосфатазы ЩФ. Среда для демонстрации ЩФ - 25 мг нафтола AS-BI фосфата растворяли в 0,5 мл Ы,Ы-диме-тилформамида, затем добавляли 50 мл 0,1 М трис-HCl буфера pH 9,2. Реакцию оценивали визуально, только на поперечных срезах сосудов.
Для оценки микроциркуляторного русла срезы окрашивались изолектином GS-IB4 меченным флюорофором AlexaFluor 594 (Invitrogen Lot. 404250) (рис. 1) в концентрации 1:100 на 0,1 МФСБ с использованием Multi-Shaker PSU-20 на протяжении 11 ч при комнатной температуре. При подсчете капилляров миокарда учитывались волокна миокарда с поперечным профилем, которые включались в анализируемые площади при их выделении. Для анализа изображений использовали программноаппаратный комплекс на базе микроскопа Axioskop FL-40 c камерой AxioCam MRc, Carl Zeiss, программный пакет AxioVision 3.1, его программные модули ручных измерений и для получения изображений модуль Multichannel, объектив Plan-Neofluar х 40 с конечным увеличением 460 крат, блоками фильтров (filter set 00 BR 530-585, FT 600, LP615 и filter set 09 BR 450-490, FT 510, LP515 Carl Zeiss).
Проводилась флюоресцентная кардиометрия миокарда (рис. 2). Срезы окрашивались в водном растворе, содержащим 10^G/mL ethidium bromide, 9 мин при комнатной температуре. Анализировались следующие параметры: средняя численная плотность ядер на тестовую площадь (M±m), средняя сумма площадей ядер на тестовую площадь M±m (мкм2), средний процент площади ядер на 100% тестовой площади миокарда (M±m) (%), сред-
Патология кровообращения и кардиохирургия • № 3 • 2009
Рис. 1. Флюоpecцeнтнaя мютка Alex-flu на изолєкти-нє B4, опрєдєляются капилляры миокарда - красно-оpaнжeвыe. Kонтpacтep-ayтофлюоpecцeнция. Oбъeк-тив x 40.
Рис. 2. Окрашиван^ этидиумом бромидом, на ядpax дєнситомєтричєскиє покaзaтeли. Oбъeктив x бЗ.
няя площадь ядра M±m (мкм2), средний «идеальный» диаметр ядра исходя из средней площади миокарда M±m (мкм2). Денситометрический максимум ядер кардиоцитов и денситометрический минимум был одного уровня для изучаемых групп. Аналитическое увеличение 630 крат, тестовая площадь одного изображения 39437 мкм2.
Для получения изображений и их анализа использовался микроскоп M200 c камерой AxioCam HRc, Carl Zeiss, программный пакет AxioVision 4.7,
программный модуль автоматических измерений, объектив Neofluar х 63, блоком фильтров (filter set 00 BR 530-585, FT 600, LP615).
Статистический анализ результатов, выполнен с помощью программных пакетов Microsoft Excel и OriginPro 7.0. с использованием критериев ANOVA в доверительном интервале P<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Средняя численная плотность артериол миокарда перирубцовой области в экспериментальной группе с реваскуляризацией, составила 124±4,7/мм2 против 95±0,4/мм2 в контроле (P<0,05).
Наши результаты, показывающие увеличение численной плотности артериол в области комбинированной реваскуляризации, близки к результатам полученным авторами при выполнении ТМЛР, так же использовавшим модель хронической ишемии у крупных животных [7, 8].
Средняя численная плотность капилляров миокарда перирубцовой области в экспериментальной группе составила 2938±68,8/мм2 против 2144±93,6/мм2, в контроле ХИБС, (P<0,05). В близком эксперименте, на модели хронической ишемии миокарда у свиней, изучая эффекты имплантации в миокард клеток МНФ КК, через 12 недель после инъекции, нашли увеличение плотности капилляров до 1132±69/мм2, против 903±44/мм2 в контроле, что в процентом выражении показывают увеличение плотности капилляров на 25%, у нас же на 37% [13].
Результаты, представленные в табл. 1, показывают практически двукратное увеличение средней суммы площадей ядер и среднего процента площади ядер кардиоцитов, а также значимое увеличение численной плотности ядер, в группе с воздействием на миокард перирубцовой области «лазер плюс клетки», при сравнении с аналогичными показателями в контроле. Более того, размеры самих ядер при оценке таких параметров как средний «идеальный» диаметр и средняя площадь ядра также увеличиваются в группе с комбинированной реваскуляризацией (табл. 2).
Таблица 1
Средняя сумма площади ядер на тестовую площадь 39437 мкм2, средний процент площади ядер на 100% тестовой площади миокарда, средняя численная плотность ядер на тестовую площадь
39437 мкм2
Миокард перирубцовой области Средняя сумма площадей ядер на тестовую площадь, мкм2 Средний процент площади ядер на 100% тестовой площади миокарда, (%) Средняя численная плотность ядер на тестовую площадь
Контроль ХИБС 465,6±37,1 1,18±0,094 22,0±1,52
Лазер+клетки 972,3±98,2* 2,19±0,122* 29,7±1,32*
* P<0,05 при сравнении данных контроля с воздействием «лазер плюс клетки» по критериям ANOVA one way
Новые научные разработки и технологии
Таблица 2
Средняя площадь ядра кардиоцита, средний «идеальный» диаметр ядра по предварительным расчетам средней площади ядра
Миокард перирубцовой Средняя площадь ядра, Средний «идеальный» диаметр ядр^ исходя области мкм2 из его средней площади, мкм
Контроль ХИБС 21,0±0,38 5,02±0,04
Лазер+клетки 32,6±0,64* 6,04±0,04*
* P<0,05 при сравнении данных контроля с воздействием «лазер плюс клетки» по критериям ANOVA one way
Привлекательно в проекции наших данных, выглядят результаты, полученные Н. Lim с соавторами [10], которые при использовании модели хронической ишемии у свиней с трехмесячной эк-спланацией ишемии, обнаружили регионарную потерю ядер кардиоцитов (35%) за счет включения механизмов апоптоза. Эта была первая работа, показавшая связь между хронической регионарной ишемией и ишемической кардиомиопатией.
В этом смысле увеличение размеров самих ядер, в группе с комбинированной реваскуляризацией, прямо говорит об участии антиапоптоти-ческих механизмов клеточной терапии, и включении регенерации кардиоцитов перирубцовой зоны в большей степени за счет паракринных эффектов [9].
Заключая можно с определенной долей уверенности говорить о возможности восстановления функций кардиоцитов в области комбинированного воздействия лазер плюс клетки в условиях восстановления микроциркуляторного русла.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Караськов А.М., Ларионов П.М., Чернявский А.М. и др. // Патология кровообращения и кардиохирургия. 2007. № 4. С. 75-81.
2. Ларионов П.М., Чернявский А.М., Боярских У.А. и др. // Мед. консульт. 2004. Т. 45. № 4. С. 2-6.
3. Ларионов П.М., Сергеевичев Д.С., Чернявский А.М. и др. Бюлл. экспер. биол. и медицины. 2009. Т. 147. № 5. С. 576-583.
4. Чернявский А.М., Ларионов П.М., Фомичев А.В. и др. // Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2007. № 6. С. 30-36.
5. Beltrami A.P., Urbanek K., Kajstura J. et al. // N. Engl. J. Med. 2001. V. 344. P. 1750-1757.
6. Chien K.R., Olson E.N. // Cell. 2002. V. 110. P. 1 53-162.
7. Hughes G.C., Kypson A.P., Annex B.H. et al. // Ann.
Thorac. Surg. 2000. V.70. P. 504-509.
8. Hughes G.C., Lowe J.E., Kypson A.P. et al. // Ann.
Thorac. Surg. 1998. V. 66. P. 2029-2036.
9. Li T.S., Mikamo A., Takahashi M. et al. // Cell. Transplant. 2007. V. 16 (4). P. 365-374.
10. Lim H., Fallavollita J.A., Hard R., Kerr C.W., Canty J.M. // Circulation. 1999. V. 100. P. 2380-2386.
11. MacLellan W.R., Schneider M.D. // Ann. Rev. Physiol. 2000. V. 62. P. 289-319.
12. Muller P., Peter P., Jurg K. et al. // Circulation. 2002. V. 106. P. 31-35.
13. Tse H.F., Siu C.W., Zhu S.G. et al. //Eur. J. Heart Fail. 2007. V. 9. № 8. P. 747-753.
14. Urbanek K., Quaini F., Bolli R. et al. // Prac. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. Suppl. 24. P. 86928697.
15. Varma J., Prabhu S., Anversa P.A., Bolli R. // Prac. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. Suppl. 10. P. 3766-3771.
REGENERATION OF MYOCARDIUM PERICICATRICAL ZONE WHEN PERFORMING REVASCULARIZATION (LASER + CELLS) ON A MODEL OF CORONARY HEART DISEASE
P.M. Larionov, A.M. Cherniavsky, V.I. Bondar,
A.V. Bocharova, D.V. Subbotin, D.S. Sergeyevitchev, R.V. Novruzov, A.M. Karaskov Combined revascularization, laser + cells of the peri-cicatrical zone, was performed on a postinfarction model of chronical ischemia in dogs in three-month time. Use was made of mononuclear bone marrow cells with final concentration equal to 5x106, which were implanted in laser channels. In a month after revascularization of the pericicatrical zone myocardium an increase of 124±4.7/ mml in number density of arterioles as compared to 95±0.4/mml in the control group ((P<0.05) and in number density of capillaries 2938±68.8/mml as compared to 2144±93.6/mml in the control group (P<0.05). Karyometric analysis showed an increase of 29.7±1.32 in the density of cardiocyte nuclei per test area in the vascularization zones as compared to 22.0±1.52 in the control group (P<0.05), a double increase of 972.3±98.2 of sums of cardiocyte nucleus areas per test area as compared to 465.6±37.1 in the control group (P<0.05), as well as an increase of 32.6±0.64 |jl in the size of nuclei on the assumption of their mean area as compared to 21.0±0.38 jl in the control group (P<0.05). Combined revascularization enhances microcirculation of the myocardium pericicatrical area and restores regeneration of car-dyocytes.
Key words: myocardium revascularization, microcirculation, regeneration, cardiomyocyte.
