CC BY
37
БИОТЕХНОЛОГИЯ
УДК 581.527.4:57.085.2:58.086 DOI: 10.25684/NBG.boolt.129.2018.03
РЕГЕНЕРАЦИЯ LAMIUM GLABERRIMUM (K. KOCH) TALIEV ЧЕРЕЗ ПРЯМОЙ И НЕПРЯМОЙ ОРГАНОГЕНЕЗ IN VITRO
Ирина Вячеславовна Митрофанова, Ольга Владимировна Митрофанова,
Татьяна Николаевна Кузьмина, Александр Ростиславович Никифоров,
Наталия Николаевна Иванова, Нина Павловна Лесникова-Седошенко
Никитский ботанический сад - Национальный научный центр РАН 298648, Республика Крым, г. Ялта, пгт Никита, Никитский спуск, 52 E-mail: invitro_plant@mail.ru
В результате проведенных комплексных биотехнологических и гистологических исследований выявлены особенности морфогенеза in vitro реликтового эндемика флоры Горного Крыма Lamium glaberrimum (K. Koch) Taliev (Lamiaceae). Впервые показано, что в условиях in vitro морфогенез исследуемого вида реализуется двумя путями: через прямой и непрямой органогенез. Определены трофические, гормональные и физические факторы, влияющие на микроразмножение растений. Получены регенеранты для сохранения в генобанке in vitro.
Ключевые слова: редкий вид; морфогенез; питательная среда; регуляторы роста; регенерация микропобегов
Введение
Род Lamium из семейства Lamiaceae насчитывает около 30 видов. Некоторые виды рода Lamium являются природными источниками биологически активных веществ [4, 13, 19]. В Крыму произрастает 5 видов: Lamium album L., L. amplexsicaule L., L. glaberrimum (K. Koch) Taliev, L. maculatum (L.) L. и L. purpureum L. Среди этих видов L. glaberrimum является редким эндемиком флоры Горного Крыма и представляет собой облигатный гляреофит -«растение осыпей», двулетник, цветущий с первого года жизни [10, 11]. Распространение L. glaberrimum лимитировано узкой экологией облигатного гляреофита (рис. 1). Вид встречается в пяти локальных популяциях на осыпях южного склона Главной гряды Крымских гор и северном склоне Бабуган-Яйлы на высоте 1100-1400 м над уровнем моря [10, 12]. Способ диссеминации - барохория, в связи с этим сохранение L. glaberrimum в природных условиях путем семенного размножения малоэффективно и требует длительного времени. В условиях ex situ прорастающие семена дают мизерный процент проростков, при этом большинство выращиваемых растений гибнет в первый год развития [9, 10]. Длительное возобновление реликтовых эндемиков, трудности их размножения, влияние антропогенного фактора обедняют видовой состав флоры и сокращают ареалы распространения, прежде всего, L. glaberrimum. Вид внесен в Европейский Красный список животных и растений, которые находятся под угрозой исчезновения в мировом масштабе (1991) и Красную книгу Республики Крым и относится к 3 категории редкости [5]. Согласно «Global Strategy Plant Conservation: 2011-2020» виды растений необходимо сохранять в условиях in situ, ex situ и in vitro [16]. В последние годы для сохранения растительного биоразнообразия все чаще используются методы клеточной инженерии [7, 14, 17].
Цель данного исследования - изучить пути реализации морфогенетического потенциала Lamium glaberrimum в условиях in vitro.
Объекты и методы исследования
Исследования выполняли в лаборатории биотехнологии и вирусологии растений отдела биологии развития растений, биотехнологии и биобезопасности ФГБУН «НБС-
ННЦ» РАН. Объектом исследований служили проростки L. glaberrimum, полученные в условиях in vitro из семян, собранных с растений in situ. Семена с растений изучаемого вида собирали в июле-августе на осыпных склонах скалы Шаган-Кая [1200-1300 м над уровнем моря (Гурзуфская яйла)] Крымского природного заповедника.
Биотехнологические эксперименты проводили согласно методикам Р.Г. Бутенко [1], Ф.Л. Калинина с соавторами [3], И.В. Митрофановой [7]. В качестве первичных эксплантов при введении на питательные среды служили апикальные части, сегменты побега и листья проростков, полученных из семян в условиях in vitro. Семена стерилизовали растворами 70% этанола, 0,5% ДезТаб, 0,4% цефотаксима по ранее разработанной нами методике [8]. Для изучения процессов морфогенеза и регенерации микропобегов L. glaberrimum, в условиях in vitro применяли питательные среды на основе базовой среды Мурасиге и Скуга (1962) (МС) [18], дополненные регуляторами роста: 0,1-1,5 мг/л БАП (Sigma, США), 1,3 мг/л ТДЗ (Duchefa Biochemie, Голландия), 0,1-0,15 мг/л ИМК (Duchefa Biochemie, Голландия), 1,5 мг/л ИУК (Duchefa Biochemie, Голландия) и 0,1-0,15 мг/л гибберелловой кислоты (Duchefa Biochemie, Голландия) в различных концентрациях и сочетаниях. В среды вводили 30 г/л сахарозы и 9 г/л агара (Panreac, Испания). Контролем была среда без регуляторов роста. рН питательной среды 5,7-5,8. Автоклавирование осуществляли при 120°С в течение 5-15 минут в стерилизаторе LAC 5060S («DAIHAN LABTECH», Южная Корея). Регуляторы роста и витамины стерилизовали холодным фильтрованием через фильтры milleX®gp и добавляли в питательные среды в стерильных условиях бокса биологической безопасности SC2 («ESCO», Сингапур) после автоклавирования. Субкультивирование эксплантов проводили через 3-4 недели. Культуральные сосуды с эксплантами помещали в фитокапсулы Биотрона с температурой 22 ± 1°С, 16-часовым фотопериодом при интенсивности освещения 37,5-42,0 ^mol m-2s-1 люминесцентными лампами Philips TL (40W) с белым спектром света. Органогенез в тканях и высечках листа изучали под стереоскопическим микроскопом Nikon SMZ745T (Япония).
Для гистологического анализа каллусных структур готовили постоянные препараты. В качестве фиксатора использовали смесь F.A.A. (formalin:acetic acid:alcohol 70% в соотношении 7:7:100), в которой выдерживали объекты в течение 4 часов. После фиксации материал переводили в 70% водный раствор этилового спирта. Для обезвоживания применяли изопропиловый спирт и ксилол [6]. Инфильтрация каллусов парафином длилась в течение 7 суток. Серийные срезы толщиной 5-10 ^m делали на ротационном полуавтоматическом микротоме RMD-3000 (Россия). Окраску препаратов проводили гематоксилином и алциановым синим [2] Анализ гистологических препаратов осуществляли с помощью микроскопа AxioScope A.1 (Германия). Микрофотографии получены системой анализа изображения AxioCamERc5s (Германия) с использованием программного приложения AxioVision Rel. 4.8.2.
Опыты проводили трижды в десятикратной повторности. При этом учитывали морфометрические показатели развития эксплантов в процессе культивирования in vitro. Статистическую обработку полученных данных выполняли с использованием программы STATISTICA for Windows 10.0 (StatSoft, Inc.) и многорангового теста Дункана (Р<0,05).
Результаты и обсуждение
Известно, что индукция морфогенеза и пути реализации морфогенетического потенциала зависят от происхождения, типа исходного экспланта и условий культивирования [7, 15]. Проведенные нами исследования показывают, что реализация морфогенетического потенциала реликтового эндемика L. glaberrimum в условиях in vitro проходила двумя путями: 1) прямым органогенезом через адвентивное
побегообразование из пазушных почек и тканей листа; 2) непрямым - через каллусообразование из высечек листа и последующего геммогенеза.
Регенерация через прямой органогенез Результаты, полученные нами в опытах по прямой регенерации L. glaberrimum, показали, что среда МС, дополненная регуляторами роста, являлась оптимальной для субкультивирования и регенерации микропобегов. Инициация развития пазушных почек и микропобегов отмечена через 12-28 суток на среде МС с низкой концентрацией регуляторов роста: 0,1 мг/л БАП, 0,1 мг/л ИМК и 0,1 мг/л ГК3. По сравнению с контролем (среда без регуляторов роста) применение регуляторов роста индуцировало процессы морфогенеза и регенерации эксплантов (табл. 1). Скрининг регуляторов роста и их концентраций продемонстрировал высокую эффективность БАП в среде MC на этапе индукции морфогенеза in vitro. Выявлено, что 0,1-0,5 мг/л БАП и 0,1-0,15 мг/л ИМК активизировали адвентивное побегообразование L. glaberrimum (табл. 1, рис. 1). Показано, что после третьего субкультивирования (85-90 суток) частота регенерации у L. glaberrimum составила 90%.
Таблица 1
Регенерационный потенциал Lamium glaberrimum в условиях in vitro при различных сроках культивирования на питательной среде МС, дополненной регуляторами роста
Регулятор роста и его концентрация, мг/л Количество микропобегов/эксплант Длина микропобега, см Количество листьев/микропобег, шт.
1* 3 6 1 3 6 1 3 6
0 (контроль) 1,0 e 1,4 f 2,7 e 0,8 e 2,1 d 2,7 e 1,8 e 1,9 e 2,0 e
БАП 0,1 1,2 cd 4,5 e 15,4 ab 1,3 b 2,7 b 5,1 cd 2,1 cd 4,5 de 8,0 b
БАП 0,5 1,7 b 5,0 de 14,6 bc 1,2 b 2,8 b 4,9 d 2,0 d 4,8 d 6,8cd
БАП 1,0 2,1 ab 7,4 cd 12,2 d 1,0 cd 2,6 bc 5,0 cd 2,2 cd 4,8 d 6,9 cd
БАП 0,1 + 1,8 b 8,9 ab 15,4 ab 1,9 ab 3,0 ab 6,0 ab 3,0 b 5,7 ab 8,3 ab
ИМК 0,1
БАП 0,5 + 2,2 ab 9,0 ab 12,5 cd 1,9 ab 3,1 ab 6,2 ab 2,8 b 5,4 bc 8,1 b
ИМК 0,1
БАП 0,1 + 2,4 a 10,1 a 25,5 a 2,3 a 3,7 a 6,8 a 4,2 a 6,2 a 10,8 a
ИМК 0,1 +
ГК3 0,1
Примечание:
* количество субкультивирований.
Рис. 1 Прямая регенерация Ьитшт glaberrimum: А - из семени; Б - из пазушных почек; В - адвентивное побегообразование из основания побегов (масштаб 1 см)
В процессе изучения особенностей регенерации микропобегов из листа Ь. glaberrimum было отмечено, что на варианте питательной среды МС, дополненной 1,3 мг/л ТДЗ (ЯО 7), регенерационный потенциал реализовывался через прямой
органогенез рис. (2 А-Г). При этом были выявлены зоны меристематической активности, из которых формировались адвентивные почки и микропобеги (рис. 2Г).
А
Б
В
Г
Рис. 2 Прямая регенерация микропобегов из листа Lamium glaberrimum на питательной среде МС с
1,3 мг/л ТДЗ (масштаб: А-В - 1 см, Г - 1 цm)
Регенерацию 2-3 микропобегов из тканей листа наблюдали на 20-27 сутки культивирования. После первого субкультивирования количество микропобегов составило 7-10 штук на эксплант. Частота регенерации микропобегов зависела от количества субкультивирований и к восьмому пассажу достигала 100% (рис. 3).
3 4 5
Количество субкультивирований
120
а 100
80
60
40
20
0
1
2
6
7
8
Рис. 3 Зависимость регенерации микропобегов из тканей листа Lamium glaberrimum от количества
субкультивирований
Регенерация через непрямой органогенез
Исследования по изучению регенерационного потенциала морфогенного каллуса Ь. glaberrimum были проведены нами впервые. Так, эффективным путем реализации морфогенеза оказался непрямой органогенез, индуцированный из высечек листа ювенильных растений изучаемого вида. В контрольном варианте опыта на питательной среде МС без регуляторов роста каллус не формировался. Индукцию морфогенного каллуса отмечали из высечек листа на питательной среде, дополненной 1,5 мг/л БАП и 1,5 мг/л ИУК (ЯД 2) через 20-28 суток культивирования. После дедифференциации тканей высечек листа и образования каллуса морфогенетический потенциал исследуемого вида реализовался через непрямой органогенез (геммогенез) (рис. 4А). Частота каллусообразования составила 62,4% и увеличивалась до шестого субкультивирования (72,8%), затем постепенно снижалась и к восьмому пассажу составила 69,9%.
Микропобеги регенерировали через 10-14 суток непосредственно из адвентивных почек, сформировавшихся в каллусе. При субкультивированиях количество микропобегов увеличивалось и после шестого пассажа достигло более 74,5 шт./эксплант (рис. 4Б). Таким
образом, наши опыты показали, что использование цитокинина БАП в концентрации 1,5 мг/л в сочетании с ауксином ИУК в концентрации 1,5 мг/л являлось триггером формирования каллуса. Каллусы Ь. glaberrimum имели все признаки морфогенетической активности (рис. 5А, Б).
А
Рис. 4 Геммогенез (А) (формирующиеся адвентивные почки указаны стрелками) и регенерация адвентивных почек и микропобегов из каллуса после 6 субкультивирования (Б) L. glaberrimum in vitro
ЛУЧ,;' ШЧ^О*
ШмшШШ
ШяьлъГ \«ЛЛ ,1 Vit
mi\:Ш
Рис. 5 Фрагменты срезов каллусных структур L. glaberrimum: А - паренхимные клетки (пк) с очагами сосудистых элементов (сэ); Б, В - перифическая область каллуса с меристематическими клетками (мк); Г - область закладки меристемы; Д - апикальная меристема (м) с примордиальными листьями (пл); Е - апикальная область микропобега с примордиальными листьями
Гистологический анализ показал, что каллусные структуры, полученные при культивировании на питательной среде МС высечек листа L. glaberrimum, образованы крупными паренхимными клетками и небольшими очагами проводящих элементов, локализованными в толще паренхимы (рис. 5А). Периферические слои каллусов были сформированы более мелкими клетками, имеющими густую цитоплазму и относительно крупные ядра, что свойственно для меристематически активных клеток. За счет этих групп клеток происходило разрастание структуры (рис. 5Б, В).
Отдельные участки клеток, обладающих пролиферативной активностью, формировали апикальные меристемы с примордиальными листьями (рис. 5Г), из которых затем развивались микропобеги (рис. 5Д, Е), что позволяет рассматривать непрямой органогенез как один из эффективных путей реализации морфогенеза L. glaberrimum.
Выводы
Таким образом, наши исследования продемонстрировали, что в качестве эксплантов могут быть использованы сегменты побега, листья и другие органы, полученные из проростков и микропобегов Lamium glaberrimum, культивируемых в условиях in vitro. Впервые показано, что морфогенетический потенциал изучаемого вида реализуется путем прямой и непрямой регенерации, что обеспечивает высокую эффективность микроразмножения. Оптимальной питательной средой для прямой регенерации микропобегов L. glaberrimum из тканей листа является среда Мурасиге и Скуга, дополненная 1,3 мг/л ТДЗ; для регенерации из сегментов побегов и микроразмножения - среда МС, дополненная 0,1 мг/л БАП и 0,1 мг/л ИМК совместно с 0,1 мг/л ГК3.Непрямой органогенез индуцирован из высечек листа через каллусогенез на питательной среде МС, дополненной 1,5 мг/л БАП и 1,5 мг/л ИУК, что значительно повышает частоту регенерации L. glaberrimum в культуре in vitro. Оба пути реализации морфогенеза как повышают степень сохранения данного вида в культуре in vitro, так и обеспечивают возможность дальнейшей репатриации их в природные условия обитания.
Список литературы
1. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. - М.: Наука, 1964. - 272 с.
2. Жинкина Н.А., Воронова О.Н. К методике окраски эмбриологических препаратов // Ботан. журн. - 2000. - Т. 85, № 6. - С. 168-171.
3. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. - Киев: Наукова думка, 1980. - 488 с.
4. Колесник Я.С., Ковалева А.М., Ильина Т.В. Исследование компонентного состава эфирного масла листьев Lamium album // GISAP. Medical science, pharmacology. - 2013. - N 1. - P. 80-82 https://nbuv.gov.ua/UJRN/msph_2013_1_27
5. Красная книга Республики Крым. Растения, водоросли и грибы / Отв. ред. А.В. Ена и А.В. Фатерыга. - Симферополь: ООО «ИТ «АРИАЛ», 2016. - 480 с.
6. Кузьмина Т. Н. Генезис микроспорангия Jasminum officinale L. (Oleaceae). // Бюллетень Государственного Никитского ботанического сада. - 2017. - Вып. 124. - С. 103-109.
7. Митрофанова И.В. Соматический эмбриогенез и органогенез как основа биотехнологии получения и сохранения многолетних садовых культур. - К.: Аграрна наука, 2011. - 344 с.
8. Митрофанова И.В, Митрофанова О.В., Никифоров А.Р., Лесникова-Седошенко Н.П., Иванова Н.Н., Челомбит С.В., Жданова И.В. Особенности введения в
условия in vitro некоторых реликтовых эндемиков флоры горного Крыма // Бюллетень ГНБС. - 2016. - Вып. 121. - С. 62-69.
9. Митрофанова И.В, Митрофанова О.В., Никифоров А.Р., Лесникова-Седошенко Н.П., Челомбит С.В. Биотехнологические подходы в размножении редкого эндемика флоры Горного Крыма Scrophularia exilis Popl. // Бюллетень Государственного Никитского ботанического сада. - 2018. - Вып. 127. - С. 59-67 http://dx.doi.org/10.25684/NBG.boolt.127.2018.08
10. Никифоров А.Р. Реликтовые эндемики флоры Горного Крыма в составе петрофитона и гляреофитона // Ботан. журн. - 2016. - Т. 101, № 9. - С. 1008-1024.
11. Никифоров А.Р., Корженевский В.В. Типы побегообразования у растений в составе гляреофитона верхнего пояса Горного Крыма // Сборник научных трудов Государственного Никитского ботанического сада. - 2014. - Т. 139. - С. 67 - 72.
12. Рыфф Л.Э. Редкие растения осыпей Крыма // Сборник научных трудов Государственного Никитского ботанического сада.- 2001. - Т. 120. - С. 58-63.
13. Chipeva V.A., Petrova D.C., Geneva M.E., Dimitrova M.A., Moncheva P.A., Kapchina-Toteva V.M. Antimicrobial activity of extracts from in vivo and in vitro propagated Lamium album L. plants // Afr J Tradit Complement Altern Med. - 2013. - Vol. 10, N 6. -P. 559-562 http://dx.doi.org/10.4314/ajtcam.v10i6.30
14. Engelmann F. Use Biotechnologies and Conserving Plant Biodiversity // Acta Horticulturae. - 2009. - Vol. 122. - P. 63-82 http://dx.doi.org/10.17660/ActaHortic.2009.812.3
15. George E.F., HallM.A., De Klerk G.-J. (eds.) Plant Propagation by Tissue Culture. 3rd edition. - Dordrecht, The Netherlands: Springer. - 2008. - Vol. 1. - P. 50.
16. Global Strategy Plant Conservation - www.botanicgardens/ie/gspc/pdfs/gspc.pdf
17. Mitrofanova I., Lesnikova-Sedoshenko N., Mitrofanova O. In Vitro Somatic Embryogenesis of Relict Endemic Species Heracleum ligusticifolium // In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant. - 2018. - Vol. 54, N 1. - P. 44 https://doi.org/10.1007/s11627-018-9927-9
18. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture // Physiologia Plantarum. - 1962. - Vol. 15, N 3. - P. 473-497 http://dx.doi.org/10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x
19. Nugroho A., Choi J.-K., Park J.-H., Lee K.-T., Cha B. Ch., Park H.-J. Two new flavonol glycosides from Lamium amplexicaule L. and their in vitro free radical scavenging and tyrosinase inhibitory activities // Planta Med. - 2009. - Vol. 75. - P. 364-366 https://dx.doi.org/10.1055/s-0028-1112216
Статья поступила в редакцию 20.09.2018 г.
Mitrofanova I.V., Mitrofanova O.V., Kuzmina T.N., Nikiforov A.R., Ivanova N.N., Lesnikova-Sedoshenko N.P. Regeneration of the Lamium glaberrimum (K. Koch.) via direct and indirect organogenesis in vitro // Bull. Of the State Nikit. Botan. Gard. - 2018. - № 129. - Р. 23-29.
As a result of complex biotechnological and histological studies, the in vitro morphogenesis features of the relict endemic species of the Mountain Crimea Lamium glaberrimum (Koch) Taliev (Lamiaceae) have been revealed. It has been shown for the first time that in vitro morphogenesis of the studied species is realized in two ways: through direct and indirect organogenesis. Trophic, hormonal and physical factors affecting micromultiplication of plants have been determined. The regenerants for conservation in in vitro gene bank have been obtained.
Key words: rare species; morphogenesis; culture medium; plant growth regulators; microshoot regeneration
