CC BY
55
Регенерация Daucus sativus (Hoffm.) Roehl.
УДК 581.085
H.A. Вечернина, O.K. Таварткиладзе Регенерация Daucus sativus (Hoffm.) Roehl. сорта Parmex в культуре in vitro
В настоящее время очень актуальны как фундаментальные, так и прикладные аспекты использования культуры клеток и тканей растений. Прикладные аспекты приобрели очень большое значение в связи с широким привлечением биотехнологии в селекционные программы, проводимые со многими сельскохозяйственным растениями. Биотехнологические подходы используют как для создания, так и для ускоренного внедрения в производство новых форм и сортов. В некоторых случаях такие подходы оказываются единственно приемлемыми для сохранения и поддержания имеющихся ценных форм, широко привлекаемых в процессы гибридизации.
Материалы и методы исследований
В качестве объекта исследования использовали морковь сорта Parmex, характеризующуюся округлым корнеплодом. На основе этого сорта создаются гибриды с укороченным корнеплодом, которые значительно меньше повреждаются при механизированной уборке. Однако недостатком сорта Parmex является низкая устойчивость к бактериальным заболеваниям, поэтому селекционеры часто теряют его. Для сохранения этого сорта были предприняты попытки введения в культуру in vitro и регенерации оздоровленных растений, а также хранения тканей в культуре in vitro.
Исходный материал был взят от единственного экземпляра, растущего на селекционном участке Западно-Сибирской овощной станции. В качестве первичного экспланта использовали фрагменты черешка листа. Поверхностную стерилизацию листа проводили 0,1% раствором сулемы в течение 20 минут с последующим промыванием в четырех порциях стерильной ди-
стиллированной воды. Культивирование осуществляли на агаризованной питательной.среде. В качестве минеральной основы использовали среды по прописи Мурасиге и Скуга (МС), а также пропись макросолей по Стоуну и Смиту (СС) [1]. Среды дополняли регуляторами роста ки-нетином (К), 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой (2,4-Д), индолил-3-масляной кислотой (ИМК), pH среды доводили до 5,65,8. Питательные среды стерилизовали в автоклаве при давлении 0,9+0,1 атм в течение 15 минут. Все операции,требующие асептических условий, проводили в лами-нар-боксе. Индукцию роста каллуса изучали в условиях темноты, а процессы регенерации - в условиях фотопериода 16-8 часов. Культивирование проводили при температуре 24+1° С. Для наблюдения ранних стадий развития соматических эмбриоидов (СЭ) использовали стереомикроскоп МБС-9.
Результаты и обсуждение
Регенерация моркови путем соматического эмбриоидогенеза впервые была осуществлена в 1958 г. За этот перид с морковью проведено большое число исследований, и она стала модельным объектом для изучения различных процессов роста и развития культивируемых in vitro клеток и тканей. Однако большинство исследований проведено с суспензионной культурой дикой моркови (Daucus carota L.), а использование различных сортов Daucus sativus (Hoffm.) Roechl. проводилось реже. Имеющиеся данные позволяют сделать вывод, что индуцированные каллус-ные ткани моркови характеризуются различным морфогенетическим потенциалом. По критерию интенсивности морфогенетического потенциала клеточные линии моркови можно подразделить на три
основные группы: неморфогенные, с нормальным морфогенезом, высокоморфогенные.
Как правило, в имеющихся публикациях вся информация по соматическому эм-бриоидогенезу относится к каллусным линиям второй группы. В тех случаях, когда линии являются высокоморфогенными, их рекомендуют так же, как и линии первой группы не использовать в дальнейшей работе, потому что из них практически невозможно получить нормальные растения-регенеранты [2]. Ограниченное количество исходного первичного материала (один черешок листа) привело к необходимости использовать жесткий режим поверхностной стерилизации. Однако из-за сильной зараженности материала микрофлорой удалось ввести в культуру in vitro только один из стерилизуемых фрагментов черешка. Остальные оказались инфицированными.
Каллус индуцировали на среде, содержащей 2 мкМ 2,4-Д и 2мкМ К, которую использует большинство исследователей, работающих с морковью [3; 4]. Начало развития каллуса наблюдали через 4 недели культивирования, чему предшествовало увеличение экспланта в размерах и уменьшение интенсивности зеленой окраски фрагмента черешка. Через два месяца после введения в культуру in vitro каллус достиг размеров, пригодных для деления и пересадки. Сырая масса его составляла около 450 мг.
Полученный каллус разделили на 10 частей и субкультивировали его на свежую питательную среду того же состава для дальнейшего роста. Затем полученный каллус делили и переносили на безгормо-нальную среду МС для индукции развития СЭ. В среднем на каллус весом около 60 мг приходилось 58 штук СЭ. На безгор-мональной среде СЭ образовывались по всей поверхности каллуса. Вначале они формировались в верхних его слоях, более старых во временном отношении. Затем образование СЭ перемещалось постепенно в более нижние слои. Наблюдали вариабельность СЭ по количеству семядолей (табл. 1).
Таблица 1 Вариабельность СЭ моркови сорта Parmex по числу семядолей
Количество семядолей, шт. Количество регенерировавших СЭ, шт.%
1 27/15,88
2 91/53,53
3 8/4,71
4 38/22,35
5-10 6/3,53
Данные, представленные в таблице 1, показывают, что около половины (46,47%) СЭ имело число семядолей, отличных от нормального. Важной особенностью соматического эмбриоидогенеза является его пластичность, чувствительность к внешним воздействиям. Поэтому наблюдается такая большая частота аномалий in vitro, как формирование множественных семядолей, а также вторичных СЭ на самих СЭ. Довольно часто такие аномалии были замечены в культуре in vitro и у других видов растений, например, у люцерны [5].
Характерной особенностью образования СЭ являлась его асинхронность. На 35-е сутки культивирования 354 полученных СЭ находились на разных стадиях развития: 7,06% на стадии торпеды, 43,5% - на стадии формирования семядолей, 48,03 - на стадии начала прорастания. На глобулярной и сердцевидной стадиях находилось менее 2% СЭ, что можно объяснить затруднениями визуального наблюдения из-за их малых размеров. Среди эмбриоидов, находящихся на стадии прорастания, было обнаружено 27 штук (7,6%), у которых отношение длины к ширине составляло 15:1, тогда как у остальных это соотношение не превышало 7:1.
При изучении прорастания СЭ выявлено достоверное влияние на данный процесс размера пересаживаемого эмбриоида. Большинство СЭ размером менее 2 мм при пересадке погибало (78,8%, п = 52). Аналогичные результаты получены у СЭ арбуза [6]. Это можно объяснить тем, что около СЭ на ранних стадиях возникает большая группа крупных клеток, способных выполнять трофические функции. В
Регенерация Daucus sativus (Hoffm.) Roehl.
вакуолях крупных клеток происходит накопление запасных белков, т. е. небольшие по размерам СЭ отличались лишь относительной обособленностью от неморфогенной части клеток, слагающих каллус, и это не позволило им самостоятельно развиваться дальше. Изучение условий индукции СЭ показало, что важное значение имеет гормональный состав сред, при этом разные генотипы предъявляют разные требования к концентрации в среде регуляторов роста. СЭ, индуцированные на без-гормональной среде, далее переносили на свежие безгормональные среды, а также на среду, где 2,4-Д был заменен менее активным ауксином (ИМК), и среду, содержащую только К. Данные этого эксперимента представлены в таблице 2.
Таблица 2
Влияние регуляторов роста на прорастание СЭ моркови сорта Рагтех
Питательная Коли- ■v Количество
среда чество растений-
СЭ, ретенеран-
шт. тов,
шт. %
МС-контроль 111 10/9,01
МС+2мкМ К 83 6,9/8,31
МС+ 2мкМ ИМК 108 8/7,80 >
Наибольшее число СЭ было получено на среде с регулятором роста К. Растения-регенеранты, полученные на среде с 2мкМ ИМК, были способны к прямому соматическому эмбриогенезу: СЭ регенерировали на гипокотиле в большом количестве, и этот процесс прямой регенерации СЭ подавлял дальнейшее развитие самого ре-генеранта. Были предприняты попытки изменить состав и концентрацию регуляторов роста в среде, однако это не препятствовало прямому соматическому эмбриоидогенезу на растениях-регенеран-тах.
Только использование минеральной основы на прописи СС позволило получить полноценные растения-регенеранты моркови сорта Рагтех. В отличие от состава микросолей по прописи МС, которая относительно богата азотом, макросоли по
прописи СС содержат относительно большее количество фосфора и бедны азотом. Однако, как было установлено в эксперименте, на среде СС прорастающие соматические эмбриоиды должны находиться не более 8-10 суток, а далее они пассируются на безгормональную среду МС. Такой прием культивирования позволяет получить растения-регенеранты нормальной морфологии из 100% СЭ, имеющих размеры не менее 2 мм.
Полученные регенеранты моркови в генетическом отношении, вероятно, идентичны генотипу донорского растения сорта Рагтех, так как относительно небольшой срок культивирования (2 пассажа) не способствовал накоплению каких-либо генетических измененеий. В течение 0~2 пассажей в основном происходит физиологическая адаптация каллусной ткани к росту в изолированных условиях, и в это время частота мутаций очень низка [7]. Поэтому данный путь получения растений-регенерантов можно считать идентичным клональному микроразмножению. Несколько десятков растений-регенерантов, адаптированных к условиям выращивания in vitro, были переданы селекционерам Западно-Сибирской овощной станции для восстановления утраченной коллекции.
Выводы
1. Каллусная культура моркови сорта Рагтех относится к высокоморфогенному типу.
2. Индукция развития морфогенного каллуса происходит на среде МС + 2мкМ К + 2мкМ 2,4-Д, а развитие СЭ - на без-» гормональной среде МС.
3. СЭ развиваются в каллусной культуре асинхронно, и около половины из них (46,47%) имеют число семядолей, отличное от двух (1, 3-10).
4. Для получения нормальных растений-регенерантов моркови сорта Рагтех необходимо СЭ размером не менее 2 мм в течение 8-10 суток культивировать на без-гормональной среде СС, а затем вновь пе-репассировать на среду МС.
Литература
1. Калинин Ф.М., Сарнацкая В.В., Полищук Е.В. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев, 1980.
2. Steward F.S. Growth and orgaoezed development of cultured cells. III. Interpretations of the growth from free cell to carrot plant // Amer. J.Bot. 1958. Vol. 45.
3. Смит M.B., Моисеева H.A. Капсулиро-вание соматических эмбриоидов и регенерация растений моркови // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. М., 1991.
4. Тюкавин Г.Б., Тимин Н.И., Буракова И.А. Использование методов культуры тканей растений in vitro в селекции моркови
// Бюл. ВИР. 1989. №2.
5. Денейко Е.В., Цевелева О.H., Пель-тек C.E., Бабенко В.H., Сидорчук Ю.В., Шумный В.К. Сомаклональная изменчивость морфологических и биохимических признаков у растенеий-регенерантов люцерны // Физиология растений. Т. 44. 1997. №5.
6. Шривастова Д.К., Андрианов В.И., Пи-рузян Э.С. Органогенез и регенерация в культуре тканей арбуза // Физиология растений. Т. 35. 1988. №6.
7. Кунах В.А., Изменчивость и отбор в популяциях культивируемых клеток растений // Генетика и селекция. 1985. №5.
