Научная статья на тему 'РЕГЕНЕРАЦИОННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ ПАРТЕНОГЕНЕТИЧЕСКИХ ЛИНИЙ КУКУРУЗЫ В КУЛЬТУРЕ ЗРЕЛЫХ ЗАРОДЫШЕЙ'

РЕГЕНЕРАЦИОННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ ПАРТЕНОГЕНЕТИЧЕСКИХ ЛИНИЙ КУКУРУЗЫ В КУЛЬТУРЕ ЗРЕЛЫХ ЗАРОДЫШЕЙ Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

CC BY
79
15
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
КЛОНАЛЬНОЕ МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ / КУЛЬТИВИРОВАНИЕ IN VITRO / КУЛЬТУРА ЗРЕЛЫХ ЗАРОДЫШЕЙ / ПРЯМОЙ ОРГАНОГЕНЕЗ / КУКУРУЗА / ZEA MAYS

Аннотация научной статьи по биологическим наукам, автор научной работы — Хумуд Бутхаина Мохаммед Хумуд, Юдакова Ольга Ивановна

Актуальность и цели. Выявление сортов и линий с высоким морфогенетическим потенциалом необходимо для эффективного использования технологий in vitro в селекции кукурузы. Целью исследования являлась оценка регенерационного потенциала партеногенетических линий кукурузы при клональном микроразмножении посредством прямого органогенеза в культуре зрелых зародышей. Материалы и методы. Объектом исследования послужили растения девяти гомозиготных линий с наследственной предрасположенностью к партеногенезу: АТ-3 (2n), АТ-3 (4n); АТТМ (bm, y, g), АТТМ (bm, y, g, В-тип ЦМС), АТТМ (lg, y, wx), АТТМ (lg, y, wx, В-тип ЦМС), АТТМ (bm, y, wx), АТТМ (lg, y) и АТТМ (bm, y). В качестве первичного экспланта использовали зрелые зародыши. Инициацию стерильной культуры осуществляли на среде Мурасиге - Скуга (MS) без гормонов, микроразмножение - на среде MS с 0,5 и 2,0 мг/л 6-бензиламинопурина (БАП), инициацию ризогенеза - на среде MS с уменьшенной вдвое концентрацией веществ и с добавлением 0,5 мг/л α-нафтилуксусной кислоты (НУК). Результаты. У изученных линий частота приживаемости эксплантов в стерильной культуре варьировала от 33,3 до 91,1 %. Различия по этому показателю установлены между линией АТ-3 (2n) и ее тетраплоидным аналогом АТ-3 (4n) ( р ≤ 0,01). Линии с одинаковым генотипом, но разной цитоплазмой характеризовались одинаковой частотой прижившихся эксплантов. Через 2 мес. от начала культивирования на среде с 0,5 мг/л БАП у всех линий на эксплантах развивалось по 1-2 пазушных побега, а на среде с 2,0 мг/л БАП - 6-7 побегов. На среде для индукции ризогенеза частота укоренившихся побегов варьировала от 48,3 до 100 %. Выводы. Генотип и плоидность растений влияли на приживаемость эксплантов в стерильной культуре и на процесс ризогенеза. Высоким регенерационным потенциалом характеризовались линии АТТМ (bm, y, wx), АТТМ (lg, y, wx), АТТМ (lg, y, wx, В-тип ЦМС), низким - линия АТ-3 (4n). Цитоплазматическая мужская стерильность не оказывала влияния на регенерационный потенциал линии. Количество пазушных побегов на эксплантах не зависело от генотипа растений и определялось только концентрацией БАП в среде.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по биологическим наукам , автор научной работы — Хумуд Бутхаина Мохаммед Хумуд, Юдакова Ольга Ивановна

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

THE REGENERATION POTENTIAL OF PARTENOGENETIC MAIZE LINES IN THE CULTURE OF MATURE EMBRYOS

Background. Identification of varieties and lines with high morphogenetic potential is necessary for effective use of in vitro technologies in maize selection. The purpose of the study is to assess the regenerative potential of parthenogenetic maize lines during clonal micropropagation through direct organogenesis in the culture of mature embryos. Materials and methods. The objects of the study were plants of 9 homozygous lines with a hereditary predisposition to parthenogenesis: AT-3 (2n), AT-3 (4n); ATTM (bm, y, g), ATTM (bm, y, g, B-type CMS), ATTM (lg, y, wx), ATTM (lg, y, wx, B-type CMS), ATTM (bm, y, wx), ATTM (lg, y) and ATTM (bm, y). Mature embryos were used as the primary explant. Sterile culture was initiated on Murashige - Skoog (MS) medium without hormones, micropropagation was performed on MS with 0.5 and 2.0 mg/l 6-benzylaminopurine (BAP), rhizogenesis was initiated on 1/2 MS with 0.5 mg/l α-naphthylacetic acid. Results. The frequency of survival explants on sterile culture varied from 33.3 to 91.1 % in the studied lines. The AT-3 (2n) line and its tetraploid analog AT-3 (4n) differed in this parameter ( p ≤ 0.01), while the lines with the same genotype and different cytoplasm did not differ. 1-2 axillaries shoots developed on explants in all lines 2 months after the start of cultivation on a medium with 0.5 mg/l BAP, while 6-7 shoots developed on a medium with 2.0 mg/l BAP. The frequency of rooted shoots varied from 48.3 to 100 % on the medium for rhizogenesis. Conclusions. The plant genotype and ploidy influenced the survival rate of explants in sterile culture and the process of rhizogenesis. The ATTM (bm, y, wx), ATTM (lg, y, wx), ATTM (lg, y, wx, B-type CMS) lines were characterized by a high regeneration potential, and the AT-3 (4n) line had a low potential. Cytoplasmic male sterility did not affect the line regeneration potentials. The number of axillary shoots on explants did not depend on the plant genotype and depend on only the BAP concentration in the medium.

Текст научной работы на тему «РЕГЕНЕРАЦИОННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ ПАРТЕНОГЕНЕТИЧЕСКИХ ЛИНИЙ КУКУРУЗЫ В КУЛЬТУРЕ ЗРЕЛЫХ ЗАРОДЫШЕЙ»

ФИЗИОЛОГИЯ И БИОХИМИЯ РАСТЕНИЙ

PHYSIOLOGY AND BIOCHEMISTRY OF PLANTS

УДК 575.1:581.143 doi:10.21685/2307-9150-2021-2-1

Регенерационный потенциал партеногенетических линий кукурузы в культуре зрелых зародышей

Хумуд Бутхаина Мохаммед Хумуд1, О. И. Юдакова2

1,2Саратовский национальный исследовательский государственный университет имени Н. Г. Чернышевского, Саратов, Россия

[email protected], 2yudakovaoi@info .sgu.ru

Аннотация. Актуальность и цели. Выявление сортов и линий с высоким морфогене-тическим потенциалом необходимо для эффективного использования технологий in vitro в селекции кукурузы. Целью исследования являлась оценка регенерационного потенциала партеногенетических линий кукурузы при клональном микроразмножении посредством прямого органогенеза в культуре зрелых зародышей. Материалы и методы. Объектом исследования послужили растения девяти гомозиготных линий с наследственной предрасположенностью к партеногенезу: АТ-3 (2n), АТ-3 (4n); АТТМ (bm, y, g), АТТМ (bm, y, g, В-тип ЦМС), АТТМ (lg, y, wx), АТТМ (lg, y, wx, В-тип ЦМС), АТТМ (bm, y, wx), АТТМ (lg, y) и АТТМ (bm, y). В качестве первичного экспланта использовали зрелые зародыши. Инициацию стерильной культуры осуществляли на среде Мурасиге - Скуга (MS) без гормонов, микроразмножение -на среде MS с 0,5 и 2,0 мг/л 6-бензиламинопурина (БАП), инициацию ризогенеза -на среде MS с уменьшенной вдвое концентрацией веществ и с добавлением 0,5 мг/л а-нафтилуксусной кислоты (НУК). Результаты. У изученных линий частота приживаемости эксплантов в стерильной культуре варьировала от 33,3 до 91,1 %. Различия по этому показателю установлены между линией АТ-3 (2n) и ее тетраплоидным аналогом АТ-3 (4n) (р < 0,01). Линии с одинаковым генотипом, но разной цитоплазмой характеризовались одинаковой частотой прижившихся эксплантов. Через 2 мес. от начала культивирования на среде с 0,5 мг/л БАП у всех линий на эксплантах развивалось по 1-2 пазушных побега, а на среде с 2,0 мг/л БАП - 6-7 побегов. На среде для индукции ризогенеза частота укоренившихся побегов варьировала от 48,3 до 100 %. Выводы. Генотип и плоидность растений влияли на приживаемость эксплантов в стерильной культуре и на процесс ризогенеза. Высоким регенерационным потенциалом характеризовались линии АТТМ (bm, y, wx), АТТМ (lg, y, wx), АТТМ (lg, y, wx, В-тип ЦМС), низким - линия АТ-3 (4n). Цитоплазматическая мужская стерильность не оказывала влияния на регенерационный потенциал линии. Количество пазушных побегов на эксплантах не зависело от генотипа растений и определялось только концентрацией БАП в среде.

© Хумуд Бутхаина Мохаммед Хумуд, Юдакова О. И., 2021. Контент доступен по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 License / This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.

Ключевые слова: клональное микроразмножение, культивирование in vitro, культура зрелых зародышей, прямой органогенез, кукуруза, Zea mays

Для цитирования: Хумуд Бутхаина Мохаммед Хумуд, Юдакова О. И. Регенераци-онный потенциал партеногенетических линий кукурузы в культуре зрелых зародышей // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Естественные науки. 2021. № 2. С. 3-13. doi:10.21685/2307-9150-2021-2-1

The regeneration potential of partenogenetic maize lines in the culture of mature embryos

Humood Buthaina Mohammed Humood1, O.I. Yudakova2

1,2Saratov State University, Saratov, Russia [email protected], [email protected]

Abstract. Background. Identification of varieties and lines with high morphogenetic potential is necessary for effective use of in vitro technologies in maize selection. The purpose of the study is to assess the regenerative potential of parthenogenetic maize lines during clonal micropropagation through direct organogenesis in the culture of mature embryos. Materials and methods. The objects of the study were plants of 9 homozygous lines with a hereditary predisposition to parthenogenesis: AT-3 (2n), AT-3 (4n); ATTM (bm, y, g), ATTM (bm, y, g, B-type CMS), ATTM (lg, y, wx), ATTM (lg, y, wx, B-type CMS), ATTM (bm, y, wx), ATTM (lg, y) and ATTM (bm, y). Mature embryos were used as the primary explant. Sterile culture was initiated on Murashige - Skoog (MS) medium without hormones, micropropagation was performed on MS with 0.5 and 2.0 mg/l 6-benzylaminopurine (BAP), rhi-zogenesis was initiated on 1/2 MS with 0.5 mg/l a-naphthylacetic acid. Results. The frequency of survival explants on sterile culture varied from 33.3 to 91.1 % in the studied lines. The AT-3 (2n) line and its tetraploid analog AT-3 (4n) differed in this parameter (p < 0.01), while the lines with the same genotype and different cytoplasm did not differ. 1-2 axillaries shoots developed on explants in all lines 2 months after the start of cultivation on a medium with 0.5 mg/l BAP, while 6-7 shoots developed on a medium with 2.0 mg/l BAP. The frequency of rooted shoots varied from 48.3 to 100 % on the medium for rhizogenesis. Conclusions. The plant genotype and ploidy influenced the survival rate of explants in sterile culture and the process of rhizogenesis. The ATTM (bm, y, wx), ATTM (lg, y, wx), ATTM (lg, y, wx, B-type CMS) lines were characterized by a high regeneration potential, and the AT-3 (4n) line had a low potential. Cytoplasmic male sterility did not affect the line regeneration potentials. The number of axillary shoots on explants did not depend on the plant genotype and depend on only the BAP concentration in the medium.

Keywords: clonal micropropagation, in vitro cultivation, mature embryo culture, direct organogenesis, maize, Zea mays

For citation: Humood Buthaina Mohammed Humood, Yudakova O.I. The regeneration potential of partenogenetic maize lines in the culture of mature embryos. Izvestiya vysshikh uchebnykh zavedeniy. Povolzhskiy region. Estestvennye nauki = University proceedings. Volga region. Natural sciences. 2021;2:3-13. (In Russ.). doi:10.21685/2307-9150-2021-2-1

Введение

Для ускорения селекционного процесса на современном этапе используются такие методы, как клеточная и маркер-ассоциированная селекция, генетическая инженерия, гаплоидия и соматическая гибридизация. Практически все они включают этап культивирования растительного материала в условиях in vitro. Применение этих методов в селекции кукурузы ограничивается

тем, что для многих ее генотипов сложно, а иногда и невозможно добиться успешной регенерации растений в стерильной культуре [1-3]. В связи с этим актуальным является совершенствование технологии получения растений-регенерантов in vitro и выявление сортов и линий кукурузы с высоким мор-фогенетическим потенциалом.

В настоящее время наиболее эффективным способом получения у кукурузы растений-регенерантов является индукция непрямого соматического эмбриогенеза или непрямого органогенеза в культуре незрелых зародышей [1, 3-10]. Однако данные технологии имеют ряд недостатков. Так, использование 12-18-суточных зародышей в качестве первичных эксплантов ограничено коротким периодом цветения растений, а процедура их вычленения из завязей весьма трудоемка. Кроме того, наличие стадии каллусогенеза при непрямых типах морфогенеза создает риск сомаклональной изменчивости [11], которая нежелательна при клонировании уникальных генотипов, создании и поддержании коллекций in vitro и при проведении генно-инженерных экспериментов. Вероятность сомаклональной изменчивости снижается при прямом соматическом эмбриогенезе и прямом органогенезе, когда регенерация растений осуществляется непосредственно из клеток и тканей экспланта без образования каллуса. В отличие от многочисленных работ по получению у кукурузы регенерантов посредством непрямого соматического эмбриогенеза, возможность индукции прямого органогенеза изучена лишь для единичных генотипов [12-15].

Целью проведенного исследования явилась оценка регенерационного потенциала партеногенетических линий кукурузы при клональном микроразмножении посредством прямого органогенеза в культуре зрелых зародышей. У растений этих линий яйцеклетки способны развиваться без оплодотворения, что приводит к регулярному появлению в потомстве матроклинных гаплоидов с частотой около 10 % [16]. Такие линии представляют интерес как модельные объекты для изучения партеногенеза, как источники гаплоидов и исходный материал для создания форм с диплоидным апомиксисом. Разработка технологии клонального микроразмножения партеногенетических линий кукурузы будет способствовать реализации их селекционно-генетического потенциала.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи: ввести в стерильную культуру зрелые зародыши партеногенетических линий кукурузы; индуцировать прямой органогенез и регенерацию растений в культуре зрелых зародышей; оценить возможное влияние генотипа линий, цито-плазматической мужской стерильности и плоидности растений на регенера-ционный потенциал и эффективность микроразмножения посредством прямого органогенеза.

Материалы и методы

Объектом исследования послужили растения девяти гомозиготных линий кукурузы (Zea mays L.) с наследственной предрасположенностью к партеногенезу: диплоидная линия АТ-3 (2n) и ее тетратраплоидный аналог АТ-3 (4n); линии АТТМ (bm, y, g) и АТТМ (lg, y, wx) и их аналоги с боливийским типом цитоплазматической мужской стерильности АТТМ (bm, y, g, В-тип ЦМС) и АТТМ (lg, y, wx, В-тип ЦМС), а также линии АТТМ (bm, y, wx), АТТМ (lg, y)

и АТТМ (bm, y). Все они были получены от одной исходной материнской линии АТ-1, характеризующейся повышенной частотой партеногенетическо-го развития яйцеклеток [17]. Линии серии АТТМ маркированы рецессивными генами, которые контролируют хорошо проявляемые фенотипические признаки: bm (brown midrib) - коричневая средняя жилка листа; lg (liguleless leaf) - безлигульный лист; y (yellow endosperm) - желтый эндосперм; g (golden) - золотистая окраска листьев и стеблей; wx (waxy endosperms) -восковидный эндосперм.

В качестве первичного экспланта использовали зрелые зародыши. Зерновки стерилизовали 70 % этиловым спиртом (1 мин) и 0,5 % раствором мертиолата (этилмеркуритиосалицилат натрия, > 97 %) в течение 5 мин. В условиях ламинар-бокса из зерновок вычленяли зародыши и пассировали на искусственную питательную среду.

Стерильную культуру инициировали на безгормональной среде Мура-сиге - Скуга (MS) [18] с добавлением витаминов по прописи среды, 20 мг/л сахарозы, 7 г/л агара (Panreac). Для непосредственного размножения использовали среды MS, дополненные 6-бензиламинопурином (БАП) в концентрации 0,5 и 2,0 мг/л. Среды автоклавировали 20 мин при 120 °С. Культуры выращивали в климатокамере Sanyo MLR-352 при температуре 24 °С при 16-часовом фотопериоде. Укоренение эксплантов осуществляли на среде, приготовленной по прописи Мурасиге и Скуга [18], в которой концентрация макро- и микроэлементов была уменьшена в 2 раза (1/2 MS). В качестве индуктора ризогенеза использовали а-нафтилуксусную кислоту (НУК) в концентрации 0,5 мг/л.

Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием программы AGROS. Для сравнения средних значений независимых выборок использовали тест Дункана (Duncan's Multiple Range Test) и одно- и двухфакторный дисперсионный анализ.

Результаты и обсуждение

Выделенные из стерильных зерновок зародыши культивировали на среде MS без гормонов (рис. 1,а). Частота их приживаемости для всех линий составила почти 100 %. Через 7 сут у развившихся проростков отсекали корень, а побег переносили на среду MS, дополненную БАП в концентрации 0,5 или 2,0 мг/л. Ранее в исследованиях культуры зрелых зародышей линии АТТМ (bm, wx, y) была выявлена эффективность применения БАП этих концентраций для мультипликации побегов [19].

При первом пассаже на среду для размножения приживаемость проростков с отсеченным корнем зависела как от генотипа линии (p < 0,01), так и от концентрации гормона в среде (p < 0,01). У большинства линий частота жизнеспособных эксплантов была более высокой на среде MS с 2,0 мг/л БАП. Приживаемость побегов варьировала от 33,3 % у линии АТ-3 (4n) и до 91,1 % у линии АТТМ (bm, y, wx). По данному показателю статистически достоверно (p < 0,01) различались линии АТ-3 (2n) и АТ-3 (4n), которые имеют одинаковый генотип, но разный уровень плоидности. В то же время линии с одинаковым генотипом, но разной цитоплазмой (АТТМ (bm, y, g), АТТМ (lg, y, wx) и их аналоги с В-типом ЦМС), характеризовались одинаковой частотой прижившихся эксплантов (табл. 1).

Рис. 1. Культура т уНго зрелых зародышей кукурузы: а - прорастание зрелых зародышей через 2 сут культивирования на среде МБ без гормонов; б - эксплант через 2 мес. культивирования на среде МБ с 2,0 мг/л БАП; в - эксплант через 4 мес. культивирования на среде МБ с 2,0 мг/л БАП; г - экспланты через 1 мес. субкультивирования на среде МБ с 0,2 мг/л БАП; д - адаптация корнесобственных регенерантов в пробирках с водопроводной водой; е - регенерант через 7 сут после переноса из пробирок с водопроводной водой

в почвенный субстрат

На средах для размножения у всех изученных линий морфогенетиче-ские процессы проходили одинаково (рис. 1). В зоне среза первичного побега каллус не формировался. Побег рос и через 30 сут от начала культивирования состоял из нескольких укороченных фитомеров. В узлах закладывалось по 2 или 4 вегетативные почки, которые прорастали в короткие пазушные побеги (рис. 1,б). Их количество на экспланте зависело от концентрации БАП в среде (р < 0,01) и не зависело от генотипа линии (табл. 2). Через 2 мес. от начала культивирования на среде с 0,5 мг/л БАП у всех исследованных линий на эксплантах развивалось по 1-2 пазушных побега, а на среде с 2,0 мг/л БАП - 6-7 побегов.

Постепенно эксплант превращался в пучок из многочисленных микропобегов длиной около 5 мм (рис. 1,в). Их разделение и пассирование на новую среду того же состава сопровождалось массовой гибелью. Для того чтобы устранить эту проблему, после 2 мес. культивирования на среде с 0,5 и 2,0 мг/л БАП экспланты переносили на среду МБ с 0,2 мг/л БАП (рис. 1,г).

Через 2 мес. субкультивирования на среде с пониженной концентрацией фитогормона микропобеги достигали размеров 20-25 мм. Это позволяло разъединять их и переносить на среды с повышенным содержанием БАП для повторения этапа микроразмножения или на среды с ауксинами для укоренения. При втором и третьем пассажах генотип линии также влиял ^ < 0,5) на приживаемость эксплантов (табл. 1). При субкультивировании с циклическим изменением концентрации БАП в среде (2,0-0,2 мг/л) культуру проростков удалось поддерживать в течение года (7-8 пассажей) без потери жизнеспособности эксплантов.

Таблица 1

Приживаемость проростков кукурузы на средах для размножения

Линия (фактор А) Количество прижившихся эксплантов, %

через 2 мес. культивирования на среде MS, дополненной БАП (фактор B)1 через 1 мес. субкультивировании2

0,5 мг 2,0 мг/л среднее по фактору А на среде MS с 0,2 мг/л БАП (второй пассаж) на среде MS с 2,0 м/л БАП (третий пассаж)

1. АТТМ (bm, y, wx) 80,0hl 91,1n 85,5h 75,0s 65,0k

2. АТТМ (lg, y) 42,1cd 88,3lm 65,2f 60,0d 50,0defghi

3. АТТМ (bm, y) 46,2e 44,1de 45,2d 45,0b 42,0cde

4. АТТМ (bm, y, g) 42,1cd 40,2bc 41,1c 40,0ab 38,0c

5. АТТМ (bm, y, g, В-тип ЦМС) 40,0c 37,3b 38,6b 40,0ab 40,0c

6. АТТМ (lg, y, wx) 84,1jk 88,3mk 86,2h 70,0fg 55,0ij

7. АТТМ (lg, y, wx, В-тип ЦМС) 82,1ijk 84,1k 83,1s 74,7fg 52,0ighij

8. АТ-3 (2n) 62,1fg 64,1g 63,1e 59,7cd 37,7be

9. АТ-3 (4n) 40,0c 33,3a 36,5a 32,7a 25,0a

Среднее по фактору В 57,6a 63,4b

F F(A) 1501,707*** F(B) 258,381*** F(A x B) 220,437*** 27,166* 33,871*

Примечание. 1 Статистическую обработку данных, полученных при первом пассаже, проводили с использованием двухфакторного дисперсионного анализа. 2Статистическую обработку данных, полученных при втором и третьем пассажах, осуществляли с использованием однофакторного дисперсионного анализа. В каждом варианте изучали три повторности по 15 эксплантов. Данные, обозначенные разными буквенными верхними индексами в одном столбце, достоверно различаются друг от друга по критерию Дункана (Duncan's Multiple Range Test) при ***р < 0,01; *р < 0,5.

Таблица 2

Развитие пазушных побегов у проростков кукурузы через 2 мес. культивирования на среде М8, дополненной 0,5 и 2,0 мг/л БАП

Среднее количество пазушных побегов,

Линия (фактор А) развившихся на эксплантах при культивировании на среде М8 (фактор В), %

0,5 мг/л БАП 2,0 мг/л БАП среднее по фактору А

1. АТТМ (bm, y, wx) 1,0a 7,01J 4,0а

2. АТТМ (lg, y) 1,3a 5 6cdefgh4 3,5а

3. АТТМ (bm, y) 1,3a 6 0defghlJ 3,7а

4. АТТМ (bm, y, g) 1,7a 6,3ghlJ 4,0а

5. АТТМ (bm, y, g, В-тип ЦМС) 2,0a 7,0hlJ 4,5а

6. АТТМ (lg, y, wx) 1,3a 5 7bcdefghij 3,5а

7. АТТМ (lg, y, wx, В-тип ЦМС) 1,3a 6,0fglhJ 3,7а

8. АТ-3 (2n) 1,6a 6,0efghlj 3,8а

9. АТ-3 (4n) 1,6a 7,3j 4,5а

Среднее по фактору В 1,5a 6,3b

F(A) 0,665ns; F(B) 240,311***; F(A x B) 0,0ns

Примечание. В каждом варианте изучены три повторности по 15 эксплантов. Данные, обозначенные разными буквенными верхними индексами в одном столбце, достоверно различаются друг от друга по критерию Дункана по результатам двух-факторного дисперсионного анализа (Duncan's Multiple Range Test); **p < 0,01, ns - нет достоверных различий.

Укоренение разделенных пазушных побегов проводили на среде MS с уменьшенной вдвое концентрацией минеральных солей (1/2 MS) и дополненной 0,5 мг/л НУК. Ризогенез начинался через 10-14 сут после переноса побегов на среду для укоренения. Да данном этапе культивирования выявлено влияние генотипа на такие показатели, как число укоренившихся побегов, длина корней и их количество на экспланте (табл. 3).

После 30 сут культивирования на среде для укоренения регенеранты переносили в нестерильные условия, сначала в отдельные пробирки с водопроводной водой (см. рис. 1,д), а спустя 5-7 сут в пластиковые стаканчики (50 мл), заполненные на 2/3 объема почвенным субстратом (см. рис. 1,е). У всех линий приживаемость эксплантов ex vitro через 30 сут составила около 90 %.

Генотип является одним из важных факторов, определяющих способность растений к регенерации в условиях in vitro. Как показало проведенное исследование, у изученных партеногенетических линий генотип оказывал влияние на приживаемость эксплантов в стерильной культуре и на процесс ризогенеза. Особенно значимо частота приживаемости зависела от генотипа при первом пассаже эксплантов на среду для размножения (p < 0,01). При последующих пассажах зависимость сохранялась, но была менее выражена (p < 0,5).

Таблица 3

Характеристики эксплантов на этапе ризогенеза на среде 1/2 MS с 0,5 мг/л НУК

Линия Количество Длина корней, мм

укоренившихся побегов, % корней на экспланте, шт.

1. АТТМ (bm, y, wx) 75,0op 2 0abcde 21,0g

2. АТТМ (lg, y) 100,0st 1,6a 11 ^bcde

3. АТТМ (bm, y) 75,0p 4 0hijkl 9 2abcde

4. АТТМ (bm, y, g) 66,2ghijkl 2 3abcdef 5,0a

5. АТТМ (bm, y, g, В-тип ЦМС) 50,0f 2 0abcde 11,2cde

6. АТТМ (lg, y, wx) 66,2hM 2 3abcdef 9 3abcde

7. АТТМ (lg, y, wx, В-тип ЦМС) 66,2jkl 5,0l 9 2abcde

8. АТ-3 (2n) 48,3def 2 0abcde 10 0abcde

9. АТ-3 (4n) 50,0f 1,6a 9 0abcde

F 116,213** 20,384* 7,462*

Примечание. В каждом варианте изучены три повторности по 15 эксплантов. Данные, обозначенные разными буквенными верхними индексами в одном столбце, достоверно различаются друг от друга по результатам однофакторного дисперсионного анализа (Duncan's Multiple Range Test); *p < 0,5; **p < 0,05.

Различия по приживаемости эксплантов и по количеству укоренившихся регенерантов, обнаруженные между линией АТ-3 (2n) и ее тетраплоидным аналогом, дают основания утверждать, что регенерационный потенциал растений определяется не только их генотипом, но и плоидностью. Вместе с тем цитоплазматическая мужская стерильность не оказывала влияния на способность к регенерации, о чем свидетельствует отсутствие достоверных различий по частотам прижившихся эксплантов и укоренившихся регенерантов между линиями АТТМ (bm, y, g), АТТМ (lg, y, wx) и их аналогами с В-типом ЦМС. Следует отметить, что при индукции непрямого соматического эмбриогенеза стерильная цитоплазма снижала эмбриогенный потенциал растений [20], на основании чего был сделан вывод о локализации фактора, инги-бирующего непрямой соматический эмбриогенез, в митохондриальном геноме [20].

Ранее при индукции прямого органогенеза у инбредных линий кукурузы было установлено влияние генотипа не только на приживаемость эксплан-тов в культуре in vitro, но и на процесс мультипликации побегов [13, 15]. В экспериментах Ахмада с соавторами [13] из девяти протестированных генотипов лучшие результаты (11,0 побегов на эксплант) были получены при культивировании проростков линии ЕН-6 на среде MS с добавлением 0,7 мг/л БАП, 0,2 мг/л ИУК и 0,5 мг/л гиббереллина. Из 10 линий кукурузы, изученных Олавейем с соавторами [15], на эксплантах линий EV99QPM и DTSR-WCO развивалось больше пазушных побегов (в среднем 1,3), чем у остальных, а наиболее эффективной средой оказалась среда MS, дополненная 3,0 мг/л БАП и 0,3 мг/л НУК.

У изученных авторами партеногенетических линий кукурузы количество пазушных побегов на эксплантах не зависело от генотипа растений и

определялось только концентрацией гормона. У всех линий максимальную мультипликацию побегов (6-7 на эксплант) обеспечивало присутствие в среде MS 2,0 мг/л БАП.

Результаты данного исследования и ранее выполненных работ [12-15, 19] позволяют отнести индукцию прямого органогенеза в культуре in vitro зрелых зародышей и проростков к числу перспективных способов клонального микроразмножения сортов и линий кукурузы.

Заключение

В результате проведенного исследования у девяти партеногенетических линий кукурузы был успешно индуцирован прямой органогенез в культуре зрелых зародышей. Процесс мультипликации побегов не зависел от генотипа растений и определялся только концентрацией БАП в питательной среде. У всех линий через 2 мес. культивирования на среде MS с 2,0 мг/л БАП на эксплантах развивалось по 6-7 пазушных побегов, а на среде с 0,5 мг/л БАП -только 1-2 побега. От генотипа и плоидности растений зависели приживаемость эксплантов в стерильной культуре и процесс ризогенеза. Цитоплазма-тическая мужская стерильность не оказывала влияния на регенерационный потенциал линий кукурузы. Наиболее высоким регенерационным потенциалом характеризовались линии АТТМ (bm, y, wx), АТТМ (lg, y, wx), АТТМ (lg, y, wx, В-тип ЦМС), самым низким - линия АТ-3 (4n).

Список литературы

1. Aguado-Santacruz G. A., Garcia-Moya E., Aguilar-Acuna J. L. [et al.]. In vitro plant regeneration from quality protein maize // In Vitro Cellular and Developmental Biology Plant. 2007. Vol. 43. P. 215-224.

2. Altpeter F., Springer N. M., Bartley L. E. [et al.]. Advancing crop transformation in the era of genome editing // Plant Cell. 2016. Vol. 28. P. 1510-1520.

3. De Vasconcelos M. J. V., Antunes M. S., De Oliveira M. F. [et al.]. Callus induction and plant regeneration from immature embryos culture of tropical maize // Revista Brasileira de Milho e Sorgo. 2018. Vol. 17, № 3. P. 359-368.

4. Armstrong C. L., Green C. E. Establishment and maintenance of friable, embryogenic maize callus and the involvement of L-proline // Planta. 1985. Vol. 164. P. 207-214.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

5. Gordon-Kamm W. J., Spencer T. M., Manganno M. L. [et al.]. Transformation of maize cells and regeneration of fertile transgenic plants // Plant Cell. 1990. Vol. 2. P. 603-608.

6. Carvalho C. H. S., Bohorova N., Bordallo P. N. [et al.]. Type II callus production and plant regeneration in tropical maize genotypes // Plant Cell Reports. 1997. Vol. 17, № 1. P. 73-76.

7. Matthys-Rochon E., Piola F., Le Deunff E. [et al.]. In vitro development of maize immature embryos: a tool for embryogenesis analysis // Journal of Experimental Botany. 1998. Vol. 49, № 322. P. 839-845.

8. El-Itriby H. A., Assem S. K., Hussein E. H. A. [et al.]. Regeneration and transformation of Egyptian maize inbred lines via immature embryo culture and a biolistic particle delivery system // In Vitro Cell Dev Biol Plant. 2003. Vol. 39. P. 524-531.

9. Petrillo C. P., Carneiro N. P., Purcino A. A. C. [et al.]. Optimization of particle bombardment parameters for the genetic transformation of Brazilian maize inbred lines // Pesquisa Agropecuaria Brasileira. 2008. Vol. 43, № 3. P. 371-378.

10. Rakshit S., Rashid Z., Sekhar J. C. [et al.]. Callus induction and whole plant regeneration in elite Indian maize (Zea mays L.) inbreds // Plant cell Tiss Organ Cult. 2010. Vol. 100, № 1. P. 31-37.

11. Кунах В. А. Геномная изменчивость соматических клеток растений. 3. Каллусо-образование in vitro // Биополимеры и клетка. 1997. Т. 13, № 5. С. 362-371.

12. Mushke R., Yarra R., Bulle M. Efficient in vitro direct shoot organogenesis from seedling derived split node explants of maize (Zea mays L.) // Journal of Genetic Engineering and Biotechnology. 2016. Vol. 14. P. 49-53.

13. Ahmad M. Z., Hussain I., Ahmed S. [et al.]. Direct in vitro multiple shoot regeneration in maize (Zea mays) inbred lines // J. Innov Bio-Res. 2017. Vol. 1, № 1. P. 24-29.

14. Ovchinnikova V. N., Varlamova N. V., Rodionova M. A. [et al.]. Susceptibility of maize mesocotyl culture to Agrobacterium transformation and its in vitro regeneration // Applied biochemistry and microbiology. 2018. Vol. 54, № 8. Р. 808-815.

15. Olawuyi O. J., Dalamu O., Olowe O. M. In vitro regeneration and proliferation of maize (Zea mays L.) genotypes through direct organogenesis // Journal of Natural Sciences Research. 2019. Vol. 9, № 6. P. 65-73.

16. Апанасова Н. В., Гуторова О. В., Юдакова О. И., Смолькина Ю. В. Особенности строения и развития женских генеративных структур у линий кукурузы с наследуемым и индуцированным типами партеногенеза // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2017. Т. 19, № 2-2. С. 216-219.

17. Тырнов В. С., Еналеева Н. Х. Автономное развитие зародыша и эндосперма у кукурузы // Доклады Академии наук СССР. 1983. Т. 272, № 3. С. 722-725.

18. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Plant Physiology. 1962. Vol. 15. P. 473-497.

19. Хумуд Б. М. Х., Юдакова О. И. Гормональная регуляция морфогенеза в культуре зрелых зародышей партеногенетической линии кукурузы АТТМ (bm, wx, y) // Известия Саратовского университета. Новая серия. Сер.: Химия. Биология. Экология. 2020. Т. 20, № 3. С. 315-323.

20. Чернышева В. Г., Шамина З. Б. Влияние ЦМС на индукцию эмбриогенной кал-лусной ткани кукурузы // Генетика. 1990. Т. 26, № 8. С. 1435-1439.

References

1. Aguado-Santacruz G.A., Garcia-Moya E., Aguilar-Acuna J.L. [et al.]. In vitro plant regeneration from quality protein maize. In Vitro Cellular and Developmental Biology Plant. 2007;43:215-224.

2. Altpeter F., Springer N.M., Bartley L.E. [et al.]. Advancing crop transformation in the era of genome editing. Plant Cell. 2016;28:1510-1520.

3. De Vasconcelos M.J.V., Antunes M.S., De Oliveira M.F. [et al.]. Callus induction and plant regeneration from immature embryos culture of tropical maize. Revista Brasileira de Milho e Sorgo. 2018;17(3):359-368.

4. Armstrong C.L., Green C.E. Establishment and maintenance of friable, embryogenic maize callus and the involvement of L-proline. Planta. 1985;164:207-214.

5. Gordon-Kamm W.J., Spencer T.M., Manganno M.L. [et al.]. Transformation of maize cells and regeneration of fertile transgenic plants. Plant Cell. 1990;2:603-608.

6. Carvalho C.H.S., Bohorova N., Bordallo P.N. [et al.]. Type II callus production and plant regeneration in tropical maize genotypes. Plant Cell Reports. 1997;17(1):73-76.

7. Matthys-Rochon E., Piola F., Le Deunff E. [et al.]. In vitro development of maize immature embryos: a tool for embryogenesis analysis. Journal of Experimental Botany. 1998;49(322):839-845.

8. El-Itriby H.A., Assem S.K., Hussein E.H.A. [et al.]. Regeneration and transformation of Egyptian maize inbred lines via immature embryo culture and a biolistic particle delivery system. In Vitro Cell Dev Biol Plant. 2003;39:524-531.

9. Petrillo C.P., Carneiro N.P., Purcino A.A.C. [et al.]. Optimization of particle bombardment parameters for the genetic transformation of Brazilian maize inbred lines. Pesquisa Agropecuaria Brasileira. 2008;43(3):371-378.

10. Rakshit S., Rashid Z., Sekhar J.C. [et al.]. Callus induction and whole plant regeneration in elite Indian maize (Zea mays L.) inbreds. Plant cell Tiss Organ Cult. 2010;100(1):31-37.

11. Kunakh V.A. Genomic variability of plant somatic cells. 3. Callus education in vitro. Biopolimery i kletka = Biopolymers and cells. 1997;13(5):362-371. (In Russ.)

12. Mushke R., Yarra R., Bulle M. Efficient in vitro direct shoot organogenesis from seedling derived split node explants of maize (Zea mays L.). Journal of Genetic Engineering and Biotechnology. 2016;14:49-53.

13. Ahmad M.Z., Hussain I., Ahmed S. [et al.]. Direct in vitro multiple shoot regeneration in maize (Zea mays) inbred lines. J. Innov Bio-Res. 2017;1(1):24-29.

14. Ovchinnikova V.N., Varlamova N.V., Rodionova M.A. [et al.]. Susceptibility of maize mesocotyl culture to Agrobacterium transformation and its in vitro regeneration. Applied biochemistry and microbiology. 2018;54(8):808-815.

15. Olawuyi O.J., Dalamu O., Olowe O.M. In vitro regeneration and proliferation of maize (Zea mays L.) genotypes through direct organogenesis. Journal of Natural Sciences Research. 2019;9(6):65-73.

16. Apanasova N.V., Gutorova O.V., Yudakova O.I., Smol'kina Yu.V. The features of the structure and development of female generative structures and lines of maize with inherited and induced types of parthenogenesis. Izvestiya Samarskogo nauchnogo tsentra Rossiyskoy akademii nauk = Proceedings of the Samara Scientific Center of the Russian Academy of Sciences. 2017;19(2-2):216-219. (In Russ.)

17. Tyrnov V.S., Enaleeva N.Kh. Autonomous development of the embryo and endosperm in maize. Doklady Akademii nauk SSSR = Reports of the USSR Academy of Sciences. 1983;272(3):722-725. (In Russ.)

18. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Plant Physiology. 1962;15:473-497.

19. Khumud B.M.Kh., Yudakova O.I. Hormonal regulation of morphogenesis in the culture of mature embryos of the parthenogenetic line of maize ATTM (bm, wx, y). Izvestiya Saratovskogo universiteta. Novaya seriya. Ser.: Khimiya. Biologiya. Ekologiya = Proceedings of Samara University. New series. Series: Chemistry. Biology. Ecology. 2020; 20(3):315-323. (In Russ.)

20. Chernysheva V.G., Shamina Z.B. The CMS effect on the induction of embryogenic callus tissue in maize. Genetika = Genetics. 1990;26(8):1435-1439. (In Russ.)

Информация об авторах / Information about the authors

Хумуд Бутхаина Мохаммед Хумуд аспирант, Саратовский национальный исследовательский государственный университет имени Н. Г. Чернышевского (Россия, г. Саратов, ул. Астраханская, 83)

E-mail: [email protected]

Humood Buthaina Mohammed Humood Postgraduate student, Saratov State University (83 Astrakhanskaya street, Saratov, Russia)

Ольга Ивановна Юдакова

доктор биологических наук, доцент, заведующий кафедрой генетики, Саратовский национальный исследовательский государственный университет имени Н. Г. Чернышевского (Россия, г. Саратов, ул. Астраханская, 83)

E-mail: [email protected]

Olga I. Yudakova

Doctor of biological sciences, associate professor, head of the sub-department of genetics, Saratov State University (83 Astrakhanskaya street, Saratov, Russia)

Поступила в редакцию / Received 29.03.2021

Поступила после рецензирования и доработки / Revised 05.04.2021 Принята к публикации / Accepted 15.04.2021

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.