CC BY
129
гомогенизация), но и естественными различиями в размерах анализируемых клещей, и, соответственно, в количестве содержащихся в их составе НК. С использованием Ма§ЫЛ Ъузег нами была выделена НК из 20 нена-питавшихся самок и 20 самцов I. репи1саШ$. Линейные размеры самцов и самок отличались примерно в два раза. Полученные значения О: мтДНК ожидаемо разделились на непересекающиеся группы, для самок значения С: в среднем отличались от значений С: для самцов на 1,8, вариация внутри групп была низкой (3,4% для самок и 1,6% для самцов). Следовательно, различия в значениях С: индивидуальных клещей близкого размера (всегда заключающиеся в смещении в большую сторону от ожидаемых) в значительной степени обусловлены именно ошибками анализа.
Таким образом, нами показано, что при анализе клещей недостаточная квалификация исполнителя или неоптимальный протокол анализа могут приводить к снижению эффективности анализа и повышенному риску получения ложноотрицательного результата. Значительная доля ошибок при анализе клеща связана
с эффективностью его измельчения, что в особенности актуально для ручной гомогенизации, которая является “узким местом” всего анализа и наиболее подвержена вариациям эффективности, связанным с человеческим фактором. Без применения эндогенного контроля (в качестве которого предложена амплификация фрагментов ДНК самого клеща) такие ошибки в принципе не могут быть выявлены. Подобный контроль может также служить полезным инструментом для оптимизации протоколов выделения НК из клещей. Однако современная методологическая база для внедрения подобных эндогенных контролей в клинико-диагностическую практику недостаточна. Прежде всего, неочевидны критерии выбора порогового цикла для “отсечки” (сМ-сф невалидных отрицательных результатов анализа. Поэтому на текущий момент при лабораторном анализе клещей для их надежного измельчения желательно отдавать предпочтение электромеханическим гомогенизаторам перед “ручными” методиками и уделять серьезное внимание обучению лаборантов, непосредственно выполняющих анализ.
ЛИТЕРАТУРА
1. Halos L., Jamal T., Vial L., et al. Determination of an efficient and reliable method for DNA extraction from ticks // Vet. Res. -2004. - Vol. 35 - P.709-713.
2. Hubbard M.J., Cann K.J., Wright D.J. Validation and rapid extraction of nucleic acids from alcohol-preserved ticks // Exp. Appl. Acarol. - 1995. - Vol. 19. - P.473-478.
3. Hill C.A., Gutierrez J.A. A method for extraction and analysis of high quality genomic DNA from ixodid ticks // Med. Vet. Entomol. - 2003. - Vol.17. - P.224-227.
4. Mauel M.J., Carlton S.J., Mather T.N. Polymerase chain
reaction detection efficiency of the human granulocytic ehrlichiosis agent (Rickettsiaceae: Ehrlichieae) in ticks (Acari: Ixodidae) is dependent on the DNA extraction method // J. Med. Entomol. - 1999. - Vol. 36. - P.649-652.
5. Tamura K., Dudley J., Nei M., et al. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA)Software Version 4.0 // Mol. Biol. Evol. - 2007. - Vol. 24. №8. P.1596-1599.
6. Schwartz I., Varde S., Nadelman R.B., et al. Inhibition of efficient polymerase chain reaction amplification of Borrelia burgdorferi DNA in blood-fed ticks // Am. J. Trop. Med. Hyg. -1997. - Vol. 56. - P.339-342.
Информация об авторах: Тимофеев Денис Игоревич - к.б.н., 630128, г.Новосибирск, ул. Пасечная, 3, тел. (383) 227-68-24, e-mail: timofeev@vector-best.ru; Фоменко Наталья Владимировна - к.б.н., e-mail: nataliyaf@ngs.ru; Иванов Михаил Константинович - к.б.н., e-mail: ivanovmk@vector-best.ru
© КОВАЛЕВ С.Ю., МУХАЧЕВА Т.А., КОКОРЕВ В.С., БЕЛЯЕВА И.В. - 2012 УДК 578.5
РЕФЕРЕНСНЫЙ ШТАММ СОФЬИН ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА И ПРОБЛЕМА ЕГО АУТЕНТИЧНОСТИ
Сергей Юрьевич Ковалев1, Татьяна Александровна Мухачева1,
Валерий Серафимович Кокорев2, Ирина Вениаминовна Беляева1 ^Уральский федеральный университет, ректор - проф. В.А. Кокшаров; ^Екатеринбургский НИИ вирусных инфекций, директор - д.м.н., проф. Н.П. Глинских)
Резюме. В GenBank зарегистрированы несколько последовательностей генома или его фрагментов референс-ного штамма вируса клещевого энцефалита Софьин с существенными отличиями между собой. Мы секвениро-вали геном штамма Софьин из коллекции вирусов, а также ген Е двух вакцинных штаммов. Филогенетическим анализом установлено, что последовательности из GenBank принадлежат трем независимым группам штаммов. Ретроспективный анализ показал аутентичность одной из них. Впервые нами была определена полная последовательность генома аутентичного штамма Софьин. Две другие группы, предположительно, появились в результате кросс-контаминации или лабораторной ошибки. Высокая вероятность контаминации требует введения нового стандарта работы вирусологических лабораторий с обязательной генетической идентификацией всех коллекционных штаммов.
Ключевые слова: вирус клещевого энцефалита, ретроспективный анализ, подлинность, коллекционный штамм, лабораторная ошибка.
TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS: REFERENCE STRAIN SOFJIN AND PROBLEM OF ITS AUTHENTICITY
S.Y. Kovalev1, T.A. Mukhacheva1, V.S. Kokorev2,1.V. Belyaeva1 ('Ural Federal University; Yekaterinburg Research Institute of Viral Infections)
Summary. GenBank has recorded several sequences associated with the reference TBEV Sofin strain with significant differences between each other. We have sequenced the complete genome of the Sofin strain from a virus collection and a gene E of the two vaccine Sofin strains. According to the phylogenetic analysis, we concluded that the GenBank sequences belong to three independent groups of Sofin strains. Retrospective analysis showed the authenticity of one of them. For the first time, we have determined a complete genome sequence of the authentic TBEV strain Sofin. Two other groups of strains named Sofin were probably the result of cross-contamination or laboratory error. The high probability of contamination
requires the introduction of a new standard for virological laboratories, with the obligatory genetic identification of all collection strains.
Key words: tick-borne encephalitis virus, retrospective analysis, authenticity, collection strain, laboratory error.
Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) был открыт в 1937 году на Дальнем Востоке России [1]. Данный вирус относится роду Flavivirus семейства Flaviviridae и широко распространен в Евразии. Согласно современной классификации, ВКЭ подразделяется на три субтипа - Европейский (ВКЭ-Ев), Сибирский (ВКЭ-Сиб) и Дальневосточный (ВКЭ-Дв) [5]. Первой научной экспедицией, возглавляемой проф. Л.А. Зильбером, было выделено 30 штаммов ВКЭ, однако сохранилось только два из них: Софьин и Обор-4 [3]. Штамм Софьин, выделенный недалеко от оз. Ханка (Приморский край) из головного мозга молодой женщины, погибшей от очаговой формы КЭ [15], многократно пассирован на мышах и в культурах клеток, а также депонирован во многие вирусные коллекции мира. Кроме того, этот штамм на протяжении десятков лет является основой производства инактивированной вакцины КЭ на территории России. По этим причинам Софьин стал первым штаммом ВКЭ, чей геном был секвенирован [2,10]. Фрагменты его нуклеотидной последовательности размещены в GenBank под номерами X03870 и X07755 [2,11,14]. Спустя 13 лет геном этого штамма был повторно секвенирован группой японских ученых, но из-за существенных генетических различий штамм был назван Sofin-HO AB062064 [7]. Наконец, в 2011 году еще одна полная геномная последовательность штамма Софьин была размещена в GenBank под названием Sofin-Ru JN229223. Помимо последовательностей генома независимыми научными группами были определены нуклеотидные последовательности отдельных фрагментов. Сравнительный генетический анализ этих последовательностей между собой на уровне целого генома или его фрагментов обнаружил существенные различия, которые могут превышать таковые, наблюдаемые между отдельными штаммами ВКЭ в пределах субтипа. Таким образом, сложилась парадоксальная ситуация, при которой сразу несколько штаммов претендуют на роль референсного.
Цель работы. разобраться в возникшей проблеме, понять причины ее появления и установить подлинность штамма Софьин.
Материалы и методы
Штаммы вирусов. В данном исследовании был взят следующий вирусологический материал: 1) штамм Софьин из вирусной коллекции Екатеринбургского НИИ вирусных инфекций (ЕНИИВИ), названный далее SofinKSY. Этот штамм был получен в 1974 году из Всесоюзной коллекции вирусов НИИ вирусологии им. Ивановского (Москва). 2) штамм Софьин из инактивированной вакцины КЭ (номер партии С45-7 К3354, год выпуска - 1999) производства ФГУП НПО «Вирион» (Томск, Россия), названный Sofin VT1999. 3) штамм Софьин из инактивированной вакцины КЭ (номер партии С705, год выпуска 2001) производства НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов (Москва), названный SofinVM2001.
Выделение РНК, обратная транскрипция, амплификация и секвенирова-
ние генома. Вирусная РНК была выделена при помощи набора реагентов Рибо-преп (Интерлабсервис, Москва). Обратная транскрипция проводилась с помощью наборов Реверта (Интерлабсервис) и Mint RACE cDNA (Евроген, Москва), согласно протоколу производителя. Для амплификации полного генома SofinKSY и гена Е на основе множественного выравнивания геномных последовательностей ВКЭ-Дв было разработано 13 и 2 пары вырожденных праймеров (нуклеотидные последовательности доступны по запросу). Продукты амплификации были очищены с помощью набора DNA-sorb (Интерлабсервис) и секвенированы на генетическом анализаторе ABI PRISM 310 (Applied Biosystems, США). Последовательности полного генома штамма SofinKSY и гена Е вакцинных штаммов были депонированы в GenBank под следующими номерами: JF819648, JF819650 и JF81965.
Филогенетический анализ. Полная впервые определенная последовательность генома штамма Софьин (чьи фрагменты представлены в GenBank под номерами X03870 и X07755) была взята из статьи и названа далее Sofin-P Выравнивание, филогенетический анализ и построение древ проводили с помощью программы Mega v.5.0.
Результаты и обсуждение
Мы провели полногеномное секвенирование штамма Софьин из коллекции Екатеринбургского НИИ ви-
Рис. 1. Филогенетическое древо штаммов ВКЭ-Дв, построенное на основе нуклеотидной последовательности, кодирующей полипротеин (метод Maximum Likelihood).
русных инфекций (SofinKSY). Геном штамма SofinKSY состоит из 131 н.п. 5’-нетранслируе-мого региона (5’-НТР), 10,245 н.п. открытой рамки считывания (ОРС), содержащей 10 вирусных белок-кодирующих участков и 327 н.п. 3’-НТР.
Сравнение нуклеотидных и аминокислотных последовательностей полипротеина штамма SofinKSY со штаммами Sofin-HO и Sofin-P выявило идентичность 97,2% (98,9% по а.о.) и 97,2% (98,3%), соответственно. Так как различия между штаммами Софьин сравнимы с таковыми между отдельными штаммами ВКЭ-Дв (рис. 1), мы пришли к заключению, что штамм SofinKSY является уникальным и не родственен другим штаммам Софьин. В то же время, 99,5% (99,3%) идентичность последовательностей штаммов Sofin-P и Sofin-Ru указывает на их общее происхождение, поэтому эти два штамма будут именоваться далее Sofin-P/Sofin-Ru.
Филогенетический анализ (рис. 1) показал, что SofiinKSY, Sofin-P/Sofin-Ru и Sofin-HO являются неродственными штаммами ВКЭ-Дв. Филогенетические древа, построенные для генов трех структурных и семи неструктурных белков, подтверждают вышесказанное (данные не приведены).
Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей гена Е штамма SofinKSY и двух вакцинных штаммов с последовательностями ВКЭ-Дв, представленных в GenBank, обнаружил три филогенетически обособленные группы, включающие штаммы Софьин (рис. 2А). Штаммы SofinKGG, SofinKSY, SofinVT1999 и SofinVT2001 образуют первую группу штаммов Софьин, связанных общим происхождением. Вторая группа представлена только одним штаммом Sofin-HO. Наконец, третья группа включает штамм Sofin-P, его производный штамм - химера ВКЭ/Денге вирус FJ828987 (в дальнейшем Sofin-P-Chimera) и Sofin-Ru. Сравнительный анализ последовательностей гена Е штаммов, принадлежащих различным группам, показал значительные генетические различия (рис. 2А, Б).
В анализ фрагмента гена №5 (1026 н.п.), помимо вышеназванных штаммов, был включен Sofin AF013399 (в дальнейшем SofinCDC), хранящийся в коллекции арбовирусов Центра по контролю и предупреждению заболеваний (США). SofinCDC был идентичен на 99,9% штамму SofinKSY, что говорит о его принадлежности первой группе штаммов Софьин. Идентичность фрагмента гена №5 штаммов Sofin-HO, Sofin-P и SofinKSY (SofinCDC) составила около 97,9%.
Таким образом, на основе сравнительного анализа различных участков генома мы приходим к однозначному выводу о том, что последовательности штамма Софьин, размещенные в GenBank, принадлежат трем самостоятельным группам штаммов ВКЭ-Дв. Столь выраженная генетическая дивергенция могла возникнуть вследствие двух причин. Первая - они происходят от одного штамма Софьин, выделенного в 1937 году, а их генетические различия вызваны микроэволюци-онными процессами вследствие многочисленных пассажей. Вторая причина - они не имеют общего происхождения, а являются самостоятельными штаммами, ошибочно отнесенными к штамму Софьин вследствие кроссконтаминации или в результате лабораторной ошибки.
Sofjin-P
99,9% (1)
Sofjin-Ru
100%
Sofjin-P-Chimera
Рис. 2. Филогенетический анализ гена Е штаммов ВКЭ-Дв.
А. Филогенетическое древо (метод Maximum Likelihood). Б. Попарные значения идентичности последовательностей штаммов Софьин в процентах, в скобках - число нуклеотидных замен.
Для проверки первого предположения мы исследовали последовательности гена Е штаммов SofinVT1999 и Sofin VM2001 из вакцины КЭ. Несмотря на высокую генетическую вариабельность вследствие многочисленных пассажей (14 и 19 замен по сравнению со штаммом SofinKGG), вакцинные штаммы сохраняют равноуда-ленность по числу нуклеотидных замен от штаммов Sofin-P/Sofin-Ru и Sofin-HO, как и исходный штамм SofinKGG. Таким образом, длительное пассирование не приводит к значительным изменениям филогенетических отношений между штаммами ВКЭ.
Согласно второй гипотезе, наиболее вероятным объяснением является контаминация аутентичного штамма Софьин посторонним штаммом ВКЭ-Дв с последующим вытеснением первого (кросс-контаминация). Кроме того, лабораторная ошибка, т.е. случайная подмена одного штамма другим, не может быть исключена. Подобные случаи в отношении вирусов комплекса клещевого энцефалита описаны в литературе.
Естественно, возникает важный вопрос о подлинности одного из трех штаммов Софьин, выделенного в 1937 году.
К сожалению, нам не удалось проследить начальный этап истории штамма Sofin-HO. Филогенетический анализ нуклеотидной последовательности гена Е показывает, что штамм Sofin-HO идентичен на 99,7% штамму Khabarovsk-Obor-4 FJ214111 (рис. 2А). Khabarovsk-Obor-4 (Обор-4) был выделен экспедицией Зильбера в 1937 году, долгое время наряду со штаммом Софьин имел статус прототипного и активно использовался в вирусологических исследованиях и производстве вакцины. Таким образом, штамм Sofin-HO является штаммом Khabarovsk-Obor-4, ошибочно отнесенным к штамму Софьин.
Sofin-P является первым из всех штаммов ВКЭ, фрагмент генома которого был определен. Важно отметить, что он был взят для секвенирования как лабораторный, а не коллекционный штамм, т.е. не был получен по официальному запросу из коллекции вирусов. Фрагмент генома ВКЭ штамма Sofin-P-Chimera почти полностью идентичен Sofin-P (рис. 2б). Принимая во
ЛИТЕРАТУРА
1. Зильбер Л.А. Весенний (весенне-летний) эндемический клещевой энцефалит // Арх. биол. наук. - 1939. - T. 56. Вып.2.
- C.9-37.
2. Плетнев А.Г., Ямщиков В.Ф., Блинов В.М. Нуклеотидная последовательность генома и полная аминокислотная последовательность полипротеина вируса клещевого энцефалита // Биорган. химия. - 1989. - T. 15. №11. - C.1504-1521.
3. Погодина В.В., Карань С.В., Колясникова Л.С. и др. Эволюция клещевого энцефалита и проблема эволюции возбудителя // Вопр. вирусологии. - 2007. - T. 5. - C.16-21.
4. Clarke D.H. Further Studies on Antigenic Relationships among the Viruses of the Group B Tick-Borne Complex // Bull. World Health Organ. - 1964. - Vol. 31. - P.45-56.
5. Ecker M., Allison S.L., Meixner T., et al. Sequence analysis and genetic classification of tick-borne encephalitis viruses from Europe and Asia // J. Gen. Virol. - 1999. - Vol. 80 (Pt 1). - P179-185.
6. Gorev N.E., Smorodincev A.A. The serological differentiation of viruses in the tick-borne encephalitis subgroup by the geldiffusion method // Bull. World Health Organ. - 1968. - Vol. 38. №3. - P.389-399.
7. Hayasaka D., Suzuki Y., Kariwa H., et al. Phylogenetic and virulence analysis of tick-borne encephalitis viruses from Japan and far-Eastern Russia // J. Gen. Virol. - 1999. - Vol. 80 (Pt 12).
- P3127-3135.
8. Mandl C.W., Iacono-Connors L., Wallner G., et al. Sequence of the genes encoding the structural proteins of the low-virulence
внимание филогенетическую близость (рис. 1), одно и то же место хранения и секвенирования генома штаммов Sofin-P и Sofin-Ru, мы сделали заключение, что Sofin-Ru является штаммом Sofin-P, чей геном был ре-секвенирован через 25 лет.
Особого внимания заслуживает первая группа штаммов Софьин. Прежде всего, важно отметить надежность источников получения этих штаммов перед секвенированием. Так, штамм SofinCDC был передан в коллекцию арбовирусов CDC в 1985 году участниками первой экспедиции на Дальний Восток М.П. Чумаковым и Е.Н. Левкович. Штамм SofinKSY был получен из Всесоюзной коллекции вирусов НИИ вирусологии им. Ивановского в 1974 году по официальному запросу Екатеринбургского НИИ вирусных инфекций. И, наконец, штамм SofinKGG был получен в 70-е годы из коллекции вирусов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов. Все эти штаммы имели минимальное количество пассажей и до секвенирования хранились в жидком азоте или в лиофилизированном виде. Кроме того, вакцинные штаммы от двух независимых производителей вакцин КЭ также принадлежат этой группе штаммов. Важно отметить, что нуклеотидные последовательности фрагментов генома этих штаммов были получены тремя независимыми научными группами. Подводя итог вышесказанному, мы пришли к заключению, что группа штаммов SofinCDC, SofinKGG и SofinKSY, включая два вакцинных штамма, ведет свое происхождение от подлинного (аутентичного) штамма Софьин. Таким образом, полная нуклеотидная последовательность генома штамма Софьин, выделенного первой Дальневосточной экспедицией в 1937 году, только сейчас стала известна.
Настоящей работой поднимается общая проблема, связанная с необходимостью обязательного подтверждения молекулярно-генетическими методами соответствия лабораторных штаммов аутентичным коллекционным образцам.
Даннаяработа была поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (№ 10-04-96062).
tick-borne flaviviruses Langat TP21 and Yelantsev // Virology. -1991. - Vol. 185. №2. - P891-895.
9. Mehla R., Kumar S.R., Yadav P., et al. Recent ancestry of Kyasanur Forest disease virus // Emerg. Infect. Dis. - 2009. - Vol. 15. №9. - P1431-1437.
10. Pletnev A.G., Yamshchikov V.F., Blinov V.M. Nucleotide sequence of the genome and complete amino acid sequence of the polyprotein of tick-borne encephalitis virus // Virology. - 1990. -Vol. 174. №1. - P250-263.
11. Pletnev A.G., Yamshchikov V.F., Blinov V.M. Tick-borne encephalitis virus genome. The nucleotide sequence coding for virion structural proteins // FEBS Lett. - 1986. - Vol. 200. №2.
- P.317-321.
12. Ruzek D., Sterba J., Kopecky J., et al. The supposedly attenuated hy-HK variant of highly virulent Hypr strain of tick-borne encephalitis virus is obviously a strain of Langat virus // Acta Virol. - 2006. - Vol. 50. №4. - P277-278.
13. Tamura K., Dudley J., Nei M., et al. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0 // Mol. Biol. Evol. - 2007. - Vol. 24. №8. - P1596-1599.
14. Yamshchikov V.F., Pletnev A.G. Nucleotide sequence of the genome region encoding the structural proteins and the NS1 protein of the tick borne encephalitis virus // Nucleic Acids Res. -1988. - Vol. 16. №15. - P7750.
15. Chumakov M.P., Levkovich E.N. Russian Spring Summer Encephalitis. The International Catalog of Arboviruses Including Certain Other Viruses of Vertebrates 1985; http://wwwn.cdc.gov/ arbocat/catalog-listing.asp?VirusID=404&SI=1.
Информация об авторах: 620000 Екатеринбург, пр-т Ленина, 51, УрФУ Ковалев Сергей Юрьевич - доцент, к.б.н., тел 8 (343) 261-68-26, е-таП: Sergey.Kovalev@usu.ru; Мухачева Татьяна Александровна - м.н.с.; Беляева Ирина Вениаминовна - с.н.с., к.б.н.; Кокорев Валерий Серафимович - заведующий лабораторией, профессор, д.м.н.:
620030, Екатеринбург, ул. Летняя 23, ЕниИ ВИ.
