CC BY
76
УДК 612.825.1+612.821.2
А.Г. Шапкин М.В. Таборов 2, Ю.Г. Шапкин 3
ЗАПИСЬ И ВОСПРОИЗВЕДЕНИЕ СЛЕДА ПАМЯТИ ПРОИЗВОЛЬНОГО СИГНАЛА ПРИ ПРЯМОЙ ЭЛЕКТРОСТИМУЛЯЦИИ КОРЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА У КРЫС
1 Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека СО РАМН (Иркутск)
2 Институт солнечно-земной физики СО РАН (Иркутск) 3 Иркутский государственный медицинский университет (Иркутск)
В статье показана возможность записи и воспроизведения следа памяти при прямой электростимуляции коры, головного мозга у крыс, и. изучены, изменения сверхмедленной электрической активности, сопутствующие этим, процессам.. Установлено, что при. воспроизведении следа памяти происходит, последовательная смена фаз активации и. релаксации энграммы, сопровождающаяся соответствующими отрицательными и. положительными сдвигами уровня постоянного потенциала. Наблюдаемые электрофизиологические изменения могут, отражать процессы, активации и. торможения нейрональных ансамблей, участвующих в формировании, следа памяти. Предложенная нами модель может, использоваться для. непосредственного изучения, механизмов памяти в нервной системе высокоорганизованных животных, изучения, влияния различных фармакологических препаратов на память и. разработки, биологических систем, с интерфейсом, «мозг — компьютер».
Ключевые слова: энграмма, электростимуляция головного мозга, кратковременное преобразование Фурье, уровень постоянного потенциала
RECORDING AND REPLAY OF TRACE OF MEMORY OF ARBITRARY SIGNAL AT THE DIRECT ELECTROSTIMULATION OF CEREBRAL CORTEX IN RATS
A.G. Shapkin M.V. Taborov 2, Yu.G. Shapkin 3
1 Scientific Center of Family Health Problems and Human Reproduction, Irkutsk
2 Institute of Solar-Terrestrial Physics SB RAS, Irkutsk
3 Irkutsk State Medical University, Irkutsk
In the article the opportunity of recording and replay of trace of memory at the direct electrostimulation of cerebral cortex in rats is demonstrated, and. the changes of superslow electrical activity that accompany these processes are studied. It was determined, that at the replay of trace of memory sequential change of phases of activation, and. relaxation, of engram, that is accompanied, by corresponding negative and. positive changes of direct current potentials, happens. Observed electrophysiological changes can reflect processes of activation. and inhibition, of neuron ensemble taking part in forming of memory trace. Proposed model can be used for direct study of mechanisms of memory in nervous system, of high-order animals, for study of influence of different pharmacological preparations on memory and. also for development of biological system, with, "brain — computer" interface.
Key words: engram, brain electrostimulation, short-time Fourier transform, direct current potentials
ВВЕДЕНИЕ
Несмотря на очевидные успехи в выяснении механизмов памяти, связанные в основном с открытиями в области синаптической и нейрональной пластичности [4, 6], вопрос о функционировании аппарата записи и извлечения следов памяти до настоящего времени остается открытым. Ограничения существующих биологических моделей, определенные методические затруднения выделения специфических коррелятов энграммы [13] и, как следствие, неоднозначная ясность в понимании функционирования формирующихся нейронных ансамблей и механизмов влияния эмоций и мотиваций [2] в процессах запоминания и воспроизведения информации сдерживают дальнейший прогресс в этой области.
Рассматривая механизмы формировании следа памяти как процесс интеграции двух активированных внешними сигналами нейрональных ансамблей [3, 13], можно предполагать, что продолжительная активация индифферентным внешним стимулом определенной связанной группы нейронов и после-
дующее кратковременное предъявление запоминаемого паттерна будет сопровождаться установлением специфических связей между первично-активированной нейронной сетью и чувствительными к компонентам паттерна нейрональными структурами. Повторное предъявление референтного сигнала и, как следствие, активация элементов первичного нейронного ансамбля будут вызывать последовательное включение чувствительных к паттерну нейронных сетей, в результате чего в случае искусственного моделирования этого процесса возможна запись и прямая визуализация воспроизведения записанного в память сигнала. В данной статье показана возможность записи и воспроизведения из памяти произвольного паттерна при прямой электростимуляции коры головного мозга у крыс, и изучены изменения уровня постоянного потенциала (УПП), сопутствующие этим явлениям.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Работа выполнена на 5 беспородных крысах-самцах массой тела 200 — 220 г. Имплантация элек-
тродов выполнялась под достаточной анестезией внутрибрюшинной инъекцией этаминал-натрия в дозе 50 мг/кг за 20 минут до начала операции.
Стимулирующий электрод имплантировали в эпидуральное пространство в точке над теменной корой правого полушария на 3 мм правее сагиттального шва и 2 мм позади венечного шва. Регистрирующий электрод располагали на 2 мм позади стимулирующего. Индифферентный электрод крепился в носовых костях черепа слева. Индифферентный стимулирующий электрод (площадью 25 мм2) располагали на мышцах спины (рис. 1). Для экспериментов использовались неполяризующие-ся хлорсеребряные проволочные электроды с диаметром кончика 0,25 мм. Электродную конструкцию фиксировали быстротвердеющей пластмассой Акрилоксид (АО «СТОМА», Украина).
а. st. а. reg,
/ ■............in. st.
Рис. 1. Схематическое изображение расположения электродов: a. st. - активный стимулирующий электрод; in. st. - индифферентный стимулирующий электрод (мышцы спины); a. reg. - активный регистрирующий электрод; in. reg. - индифферентный регистрирующий электрод (носовые кости).
Процедура записи сигнала в память осуществлялась не ранее чем через 3 суток после вживления электродов путем многократного последовательного повторения монополярной стимуляции одной и той же точки поверхности коры референтным (считывающим) сигналом и основным (записываемым) паттерном. В качестве референтного сигнала использовался переменный синусоидальный ток с частотой 7 Гц и продолжительностью 30 сек, в качестве основного паттерна — переменный ток с линейным увеличением частоты в течение 10 сек от 0,5 до 10,5 Гц (рис. 2). Контрольный сигнал был представлен переменным синусоидальным током с частотой 13 Гц, продолжительностью 30 сек. Амплитуда референтного и контрольного сигналов устанавливалась таким образом, чтобы в точке регистрации амплитуда зарегистрированного сигнала не превышала 200 мкВ, отношение амплитуд
референтного сигнала и основного паттерна составляло 1 : 5.
Схема эксперимента включала 4 основных этапа: 10-минутную фоновую униполярную запись ЭЭГ, этапы контрольной стимуляции коры головного мозга референтным сигналом 7 Гц, «обучения» и «тестирования». Процедура контрольной стимуляции заключалась в 10-кратном включении в случайные моменты времени референтного сигнала 7 Гц без последующей электростимуляции основным паттерном. Продолжительность электростимуляции составляла 30 секунд, пауза между стимуляциями составляла не менее 60 сек. Процедура «обучения» заключалась в последовательном 25-кратном чередовании референтного сигнала и основного паттерна со случайными временными промежутками между сигналами (не менее 1 и не более 5 секунд). Процедура «тестирования» проводилась через 60 минут после окончания процедуры «обучения» и заключалась во включении в случайном порядке референтного (7 Гц) и контрольного (13 Гц) сигналов. Каждый сигнал включался в течение «тестирования» не менее 10 раз, пауза между сигналами составляла от 30 до 60 секунд.
Регистрацию биоэлектрической активности проводили по униполярной методике с помощью усилителя постоянного тока с входным сопротивлением не менее 108 Ом и полосой пропускания частот 0 — 40 Гц. Биоэлектрические потенциалы оцифровывались с частотой 1024 Гц и вводились в компьютер для дальнейшей математической обработки.
Анализ и усреднение сверхмедленной электрической активности головного мозга проводили после удаления линейного тренда и применения фильтра НЧ с полосой среза 0,15 Гц к отдельным фрагментах ЭЭГ. Кроме того, отдельные и усредненные (по всем животным) фрагменты ЭЭГ в каждом из 4 этапов эксперимента после предварительной фильтрации референтной (7 Гц) или контрольной (13 Гц) частоты визуализировали с помощью частотно-временного анализа с использованием метода кратковременного преобразования Фурье. Для уменьшения уровня шума спектрограммы пропускали через 2-мерный адаптивный фильтр Винера. Вычисление временных параметров воспроизведения следа памяти осуществляли путем кросскорреляции спектрограмм фрагментов ЭЭГ и основного паттерна в частотно-временном диапазоне 0,5—10,5 Гц — 0 — 10 сек [1]. Порог детекции основного паттерна устанавливался, исходя из предельных колебаний коэффициента корреляции в фоновой записи, и составлял 0,15. Дальнейшее усреднение и сравнение статистически значимых коэффициентов корреляции проводили с помощью z-преобразования Фишера. Отдельно усредняли максимальные значение коэффициентов корреляции, превышающие по модулю порог детекции паттерна, и совпадающие с ними по времени амплитуды сверхмедленной электрической активности.
Визуализация результатов, статистическая и математическая обработка данных выполнялись
с использованием MATLAB 7 и MS Excel 2003. Для оценки статистической значимости полученных результатов использовались непараметрический критерий U Уилкоксона — Манна — Уитни. Различия считали значимыми при р < 0,05. Результаты представлены в виде M ± m , где M — среднее арифметическое, m — ошибка средней.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В фоновой записи ЭЭГ (50 безартефактных фрагментов по 30 секунд) максимальные колебания уровня постоянного потенциала не превышали
200 мкВ и в среднем составляли 0 ± 109,28 мкВ. Изменения коэффициента корреляции спектрограмм суммарной фоновой ЭЭГ и основного паттерна находились в пределах ± 0,11. В период контрольной электростимуляции коры головного мозга референтным сигналом 7 Гц (50 фрагментов) при корреляционном анализе колебания коэффициента корреляции находились в пределах ±0,12 и не отличались от подобных изменений в фоновой записи ЭЭГ. Во время электростимуляции наблюдалась тенденция к снижению УПП на 50 — 100 мкВ от исходного уровня. В среднем за все время стиму-
Рис. 2. Спектрограммы усредненных фрагментов ЭЭГ (после фильтрации референтного сигнала 7 Гц) в периоды контрольной стимуляции ^) N = 50), обучения (Б) N = 125) и тестирования (В) ^ = 50). Амплитуда нормирована, момент включения референтного сигнала указан пунктирной линией. Справа показана спектрограмма основного паттерна.
290
niiiiiiiiiiiiiiiiin I in i urn □ 11II I □ nil III ii
ляции УПП снизился на 28,94 ± 78,29 мВ. Подобные изменения уровня постоянного потенциала были статистически незначимы в сравнении с исходным уровнем (до стимуляции) и не превышали физиологических изменений в фоновой записи за аналогичный период. Тенденция к снижению УПП вероятно отражала неспецифическую реакцию коры головного мозга на электростимуляцию переменным током [16]. В спектрограммах фрагментов ЭЭГ, записанных во время этого периода, и
в фоновой ЭЭГ ни визуально, ни с использованием корреляционного метода не определялся сигнал, сходный с основным паттерном (рис. 2а, 3).
Как видно из рис. 2б, во время процедуры обучения (125 фрагментов) в среднем через 6,2 ± 2,3 сек после начала стимуляции на спектрограммах 78 из 125 фрагментов ЭЭГ (62,4 %) визуально и с использованием корреляционного анализа было зарегистрировано появление сигнала, по своим частотно-временным характеристикам подобного
Рис. 3. Результаты корреляционного анализа (А) и изменения УПП (Б) в периоды контрольной стимуляции, обучения и тестирования. Крупными маркерами выделены статистически значимые изменения (р < 0,05) по сравнению с изменениями во время контрольной стимуляции и исходным уровнем (до стимуляции).
основному паттерну. Воспроизведение данного сигнала мы обозначили как «фазу активации эн-граммы». Коэффициент корреляции спектрограмм усредненной ЭЭГ N = 125) и основного паттерна в этот период составлял 0,36 (при усреднении максимальных значений коэффициента корреляции с превышением порога детекции N = 78) 0,26 ± 0,11 (р < 0,05 в сравнении с исходным уровнем)) (рис. 3а). Фаза активации энграммы сопровождалась негативным сдвигом УПП до 508,39 ± 187,67 мкВ (р < 0,01 в сравнении с исходным уровнем, для анализа использовались значения УПП в момент максимального значения коэффициента корреляции N = 78)) (рис. 3б).
После первичной генерации сигнала, через 10,8 ± 3,5 сек после включения референтного сигнала, на спектрограммах 67 из 125 фрагментов ЭЭГ (53,6 %) отмечалось последовательное подавление амплитуды ЭЭГ, по своим частотно-временным характеристикам сопоставимое с основным паттерном и сопровождающееся положительным сдвигом уровня постоянного потенциала на 135,47 ± 82,98 мкВ от исходного уровня N = 67, р < 0,01 в сравнении с периодом активации энграммы) (рис. 3). Данное явление мы обозначили как фазу релаксации энграммы. Коэффициент корреляции спектрограмм усредненной ЭЭГ N = 125) и основного паттерна в этот период составлял —0,26 (при усреднении минимальных значений коэффициента корреляции с превышением порога детекции N = 67) —0,21 ± 0,04 (р < 0,05 в сравнении с исходным уровнем; р < 0,01 в сравнении с периодом активации энграммы)) (рис. 3б). В некоторых случаях регистрировалось несколько последовательных фаз активации и релаксации.
В период тестовой электростимуляции референтным сигналом 7 Гц, через 60 мин после процедуры обучения, фаза активации энграммы регистрировалась через 3,8 ± 1,45 сек после начала электростимуляции в 39 из 50 фрагментах ЭЭГ (78 %) (рис. 2в) и сопровождалась негативным сдвигом уровня постоянного потенциала до 417,07 ± 237,87 мкВ N = 39; р < 0,05 в сравнении исходным уровнем) (рис. 3б). Коэффициент корреляции спектрограмм усредненного сигнала ЭЭГ N = 50) и основного паттерна в этот период был выше, чем в аналогичный период во время процедуры обучения, и составлял 0,56, средний максимальный коэффициент корреляции N = 39) был равен
0,28 ± 0,12 (р < 0,05 в сравнении с исходным уровнем) (рис. 3а). Фаза релаксации энграммы регистрировалась через 8,4 ± 1,68 сек после включения референтного сигнала в 31 из 50 фрагментов ЭЭГ (62 %) и сопровождалась позитивным сдвигом УПП на 219,04 ± 104,77 мкВ N = 31; р < 0,01 в сравнении с фазой активации энграммы). Коэффициент корреляции спектрограмм усредненного сигнала ЭЭГ N = 50) и основного паттерна в этот период составлял —0,23 (при усреднении минимальных значений коэффициента корреляции с превышением порога детекции N = 31) —0,198 ± 0,039 (р < 0,05 в сравнении с исходным уровнем; р < 0,01
в сравнении с периодом активации энграммы)). Не наблюдалось никаких статистически значимых различий изменений коэффициентов корреляции и УПП во время фаз активации и релаксации энграммы во время процедуры тестирования в сравнении с аналогичными периодами процедуры обучения. Также, несмотря на некоторую тенденцию к более раннему появлению фаз активации и релаксации энграммы, связанному, по-видимому, с более стабильным функционированием вновь образованных нейронных сетей, статистически значимых различий между временем возникновения этих фаз в период обучения и тестирования зафиксировано не было. Отмечалась высокая частотная специфичность воспроизведения следа памяти: при электростимуляции контрольным сигналом в период тестирования (13 Гц, 50 фрагментов) не регистрировалось превышений порога детекции основного паттерна, колебания коэффициента корреляции составляли в среднем ± 0,11. При использовании контрольного сигнала 13 Гц, также, как и при контрольной стимуляции с использованием референтного сигнала 7 Гц до процедуры обучения, регистрировалась тенденция к снижению УПП в среднем на 44,83 ± 116,08 мВ от исходного уровня. Подобные изменения коэффициента корреляции и УПП были незначимы по сравнению с исходным уровнем (до стимуляции) и не отличались от аналогичных изменений в фоновой записи и при использовании референтного сигнала 7 Гц до процедуры обучения.
ОБСУЖДЕНИЕ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Полученные нами результаты предполагают, что формирование следа памяти можно рассматривать как процесс интеграции двух активированных внешними сигналами нейрональных ансамблей [3, 13]. Первичная активация чувствительной к референтному сигналу нейрональной системы (референтная нейрональная система) в результате продолжительной стимуляции переменным током референтной частоты (7 Гц) и последующее предъявление сложного по своим частотно-временным характеристикам основного паттерна сопровождаются установлением специфических связей между первично-активированной нейронной сетью и чувствительными к компонентам основного паттерна распределенными нейрональными структурами (компоненты нейрональной структуры паттерна). Повторное предъявление референтного сигнала сопровождается последовательным включением этих распределенных нейронных сетей, что регистрируется в виде шумоподобного частотно-селективного воспроизведения сигнала на ЭЭГ (рис. 2а, б). Отрицательные и положительные сдвиги уровня постоянного потенциала во время фаз активации и релаксации, вероятно, отражают последовательные процессы деполяризации и реполяризации нейрональных ансамблей, ответственных за формирование следа памяти [11, 12].
Изменения уровня постоянного потенциала в момент активации и релаксации энграммы в
наших опытах могут быть «клеточным» аналогом эмоционального компонента в процессах формирования памяти. Согласно предположению С.Э. Мурика [8], нейрофизиологическая основа эмоций и мотиваций тесно связана с поляризационными процессами в сенсорных системах, при этом ухудшение функционального состояния нейронов под действием стимулов из внешней и внутренней среды организма, проявляющееся в деполяризации их мембран (и, как следствие, в повышении метаболических и энергетических потребностей клеточных структур), является отражением негативной эмоциональной реакции. Обратные процессы, связанные с улучшением функционального состояния этих клеток и восстановления их мембранного потенциала, а также гиперполяризационные процессы, сопровождающиеся положительным сдвигом УПП, связаны с положительными эмоциональными реакциями. Стремление избежать неблагоприятного функционального состояния является основой мотиваций. Следуя логике данной концепции, с целью реализации мотивационного поведения умеренная естественная или искуственная деполяризация нейрональных структур должна способствовать формированию и извлечению следов памяти (предположительно вызывать облегчение фазы активации энграммы и угнетение фазы релаксации) [5, 9, 12]. Чрезмерная деполяризация при воздействии повреждающих факторов (ишемия, гипоксия, электрошок, аппликация KCl и другие воздействия, сопровождающиеся нейрофизиологическими изменениями, подобными распространяющейся депрессии Леао [14]) должна сопровождаться невозможностью формирования фазы активации энграммы вследствие развития неблагоприятного функционального состояния, сопровождающегося деполяризационным торможением активности нервной ткани [7]. Эти изменения вследствие физического или функционального разрушения связей между компонентами нейрональных структур референтного и основного сигналов могут объяснять нарушение консолидации или реконсолидации памяти после подобных патологических воздействий [15]. Гиперполяризационные процессы в нейрональных ансамблях, сопровождаемые позитивными сдвигами уровня постоянного потенциала также вследствие развития гиперполяризационного торможения [7], должны обратимо затруднять воспроизведение следов памяти (фазу активации энграммы) и облегчать фазу релаксации [10].
В реальных условиях внешние стимулы могут вызывать активацию различных, порой значительно пространственно разнесенных нейрональных ансамблей, формирующих систему связанных распределенных нейрональных структур, реагирующую исключительно на селективные внешние или внутренние стимулы. В результате взаимодействия этих сетей формируется сложный пространственно-временной след памяти на событие. При повторной активации (полной или частич-
ной) предшествующего нейронального ансамбля внешним стимулом происходит последовательная активация с последующей релаксацией связанных нейрональных структур.
ВЫВОДЫ
1. Запись сигнала в память при прямой электростимуляции коры головного мозга возможна на фоне длительной предварительной активации мозговых структур референтным сигналом. Повторное предъявление референтного сигнала сопровождается воспроизведением следа памяти
2. При воспроизведении следа памяти происходит последовательная смена фаз активации и релаксации энграммы, сопровождающихся соответствующими отрицательными и положительными сдвигами уровня постоянного потенциала.
3. Временные параметры и корреляционные коэффициенты фаз активации и релаксации энграммы могут быть объективным критерием функционирования нейронных сетей в процессах запоминания и воспроизведения информации в коре головного мозга.
4. Предложенная нами модель может использоваться для непосредственного изучения механизмов памяти в нервной системе высокоорганизованных животных и разработки биологических систем с интерфейсом «мозг — компьютер».
ЛИТЕРАТУРА
1. Altes R.A. Detection, estimation, and classification with spectrograms // J. Acoust. Soc. Am. — 1980. - Vol. 67. - P. 1232-1248.
2. Cahill L., McGaugh J.L. A novel demonstration of enhanced memory associated with emotional arousal // Conscious Cogn. — 1995. — Vol. 4 (4). — P. 410-421.
3. Fuster J.M. Cortical dynamics of memory // Int. J. Psychophysiol. - 2000. - Vol. 35 (2-3). -P. 155-164.
4. Kandel E.R. Common molecular mechanisms in explicit and implicit memory // J. Neurochem. -2006. - Vol. 97 (6). - P. 1520-1533.
5. Marshall L., Molle M., Hallschmid M., Born J. Transcranial direct current stimulation during sleep improves declarative memory // J. Neurosci. -2004. - Vol. 24 (44). - P. 9985-9992.
6. Martin S.J., Grimwood P.D., Morris R.G. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis // Ann. Rev. Neurosci. - 2000. - Vol. 23. -P. 649-711.
7. Murik S.E., Shapkin A.G. Simultaneous recording of eeg and direct current (DC) potential makes it possible to assess functional and metabolic state of nervous tissue // Int. J. Neurosci. - 2004. - Vol. 114 (8). - P. 977-997.
8. Murik S.E. The relation of emotions to polarization processes in sensory systems // Int. J. Neurosci. -1996. - Vol. 88 (3-4). - P. 185-197.
9. Penolazzi B., Di Domenico A., Marzoli D., Mam-marella N. et al. Effects of transcranial direct current stimulation on episodic memory related to emotional
nilllllllllllllllllin llllll 1111ГП □ I I I I I I III □ nil I I I I I I
293
visual stimuli // PLoS One. — 2010. — Vol. 5 (5). — P. 10623.
10. Pereira G.S., Mello e Souza T., Vinade E.R. et al. Blockade of adenosine A1 receptors in the posterior cingulate cortex facilitates memory in rats // Eur. J. Pharmacol. - 2002. - Vol. 437 (3). - P. 151-154.
11. Roland P.E. Dynamic depolarization fields in the cerebral cortex // Trends Neurosci. - 2002. -Vol. 25. - P. 183-190.
12. Rosler F., Heil M., Glowalla U. Monitoring retrieval from long-term memory by slow event-related brain potentials // Psychophysiology. - 1993. -Vol. 30 (2). - P. 170-182.
13. Silva A.J., Zhou Y., Rogerson T., Shobe J. et al. Molecular and cellular approaches to memory alloca-
tion in neural circuits // Science. - 2009. - Vol. 326 (5951). - P. 391 -395.
14. Somjen G.G. Mechanisms of spreading depression and hypoxic spreading depression-like depolarization // Physiol. Rev. - 2001. - Vol. 81 (3). - P. 1065-1096.
15. Stehberg J., Levy D., Zangen A. Impairment of aversive memory reconsolidation by localized intracranial electrical stimulation // Eur. J. Neurosci. -2009. - Vol. 29 (5). - P. 964-969.
16. Zaghi S., Acar M., Hultgren B., Boggio P.S. et al. Noninvasive brain stimulation with low-intensity electrical currents: putative mechanisms of action for direct and alternating current stimulation // Neuroscientist. - 2010. - Vol. 16. - P. 285-307.
Сведения об авторах
Шапкин Андрей Григорьевич - кандидат медицинских наук, врач-нейрохирург отдела малоинвазивной нейрохирургии Научного центра проблем здоровья семьи и репродукции человека СО РАМН (664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16; email: [email protected])
Таборов Михаил Витальевич - ведущий инженер-программист Института солнечно-земной физики СО РАН (664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 126а; e-mail: [email protected])
Шапкин Юрий Григорьевич - кандидат биологических наук, ассистент кафедры фармакологии Иркутского государственного медицинского университета (664003, г. Иркутск, ул. Красного восстания, 1; e-mail: [email protected])
294
ПІІІІІІІІІІІІІІІІІПІІІІІІ ІІІІГП □ I I I I I □ nil I I I I I
