CC BY
71
О. И. Юдакова, В. С. Тырнов. Реализация предпосылок к полиэмбрионии у апомиктичных видов__ УДК 581.33
РЕАЛИЗАЦИЯ ПРЕДПОСЫЛОК К ПОЛИЭМБРИОНИИ У АПОМИКТИЧНЫХ ВИДОВ МЯТЛИКОВ
О. И. Юдакова, В. С. Тырнов
Саратовский государственный университет E-mail: yudakovaoi@info.sgu.ru
В статье представлены результаты сравнительного анализа частоты цитоэмбриологических предпосылок к полиэмбрионии и степени их реализации у трех видов мятликов с разными типами апомиксиса: Роа badensis Haenke (диплоспория) и P. pratensis L., P. chaixii Vill. (апоспория). Установлено, что апоспорические виды мятликов обладают более высокими потенциями к истинной и ложной полиэмбрионии по сравнению с диплоспорическим видом P. badensis. У P. pratensis и P. chaixii образование дополнительных яйцеклеток вместо синергид наблюдалось в 4,0 и 5,4% зародышевых мешков, соответственно, а развитие двух и более мегагаметофитов зарегистрировано в 32,1 и 31,5% семязачатков. У P. badensis эти явления встречались лишь с частотой 0,1 и 2,5% соответственно. Предпосылки к развитию множественных зародышей в большинстве случаев остаются нереализованными. При высоких потенциальных возможностях к полиэмбрионии частота семян с близнецовыми проростками у P. pratensis и P. chaixii составила лишь 5,8 и 1,8%. У P. badensis полиэмбрионы среди проростков не обнаружены. Обсуждаются возможные причины, препятствующие реализации потенций к полиэмбрионии. Ключевые слова: полиэмбриония, апомиксис, злаки, Poa.
Realization of the Prerequisites to Polyembryony in Apomictic Poa L.
O. I. Yudakova, V. S. Tyrnov
The article presents the comparative analysis results of the frequency of cytoembryological prerequisites to polyembryony and the extent of their realization in three bluegrass species with different types of apomixis: Poa badensis Haenke (diplospory) and P. pratensis L., P. chaixii Vill. (apospory). It was found that aposporous bluegrass species have higher potencies to true and false polyembryony in comparison with diplospous P. badensis. In P. pratensis and P. chaixii the formation of additional egg cells instead synergids was observed in the 4,0 and 5,4% embryo sacs, respectively, and the development of two or more megagametophytes was registered in the 32.1 and 31,5% ovules. In P. badensis these phenomenas are occurred only with a frequency of 0.1 and 2.5%. In most cases prerequisites to the development of multiple embryos remain unfulfilled. At high potencies to polyembryony in P. pratensis and P. chaixii the twin seedlings frequency was only 5,8 and 1,8 %. In P. badensis the twins were not found. The possible reasons preventing the realization of potencies to polyembryony are discussed. Key words: polyembryony, apomixis, cereals, Poa.
Изучение явления полиэмбрионии (формирования в одном семени нескольких зародышей) имеет важное практическое значение, поскольку может использоваться в селекционно-генетических работах для ускоренного получения чистых линий, гаплоидов и гомозиготных диплоидных форм. Способы образования многозародышевых семян весьма разнообразны. Дополнительные
зародыши могут развиваться из разных структур семязачатка и элементов зародышевого мешка, причем как в результате оплодотворения (бипа-рентальное наследование), так и без него (унипа-рентальное наследование) [1, 2]. Многочисленные попытки систематизации типов полиэмбрионии привели к созданию различных классификаций, в которых нередко один и тот же термин использовался для описания совершенно разных явлений. В зависимости от числа мегагаметофитов, в ко -торых развиваются дополнительные зародыши, часто выделяют два типа полиэмбрионии: 1) истинную, если несколько зародышей образуются из элементов одного зародышевого мешка (дополнительных гамет, яйцеклеткоподобных синергид и др.) [3-5]; 2) ложную, когда в одном семязачатке формируется несколько мегагаметофитов с собственными зародышами [5-7].
Виды с апомиктичным способом репродукции, как правило, характеризуются высокой частотой полиэмбрионии [8-10]. Дело в том, что некоторые особенности развития репродуктивных структур у апомиктов создают условия для образования в одном семени более одного зародыша. Однако наличие цитоэмбриологических предпосылок к полиэмбрионии еще не является гарантом развития семян с близнецовыми проростками [11, 12]. В связи с этим важно изучать не только механизмы развития многозародышевых семян, но и то, в какой степени происходит реализация потенций к полиэмбрионии и какие причины могут препятствовать их проявлению.
Модельным объектом для изучения полиэм-брионии у апомиктичных форм может стать род Poa L. Среди злаков он занимает одно из первых мест по числу апомиктичных видов, многие из которых характеризуются разными типами апо-миксиса и полиэмбрионии [9, 13]. В частности, у апоспорического P. pratensis L. зарегистрированы истинная, ложная и нуцеллярная полиэмбриония [14-18].
Цель данной работы состояла в выявлении цитоэмбриологических предпосылок к полиэм-брионии и определении степени их реализации у растений трех видов мятликов c разными типами апомиксиса: Poa badensis Haenke (диплоспория) и P. pratensis L., P. chaixii Vill. (апоспория).
Материал и методы
Материалом исследования послужили ви-дообразцы P. pratensis, P. chaixii, P. badensis из коллекции Ботанического сада Саратовского госуниверситета. Соцветия фиксировали ацето-алкоголем (3:1) за 1 и 2 суток до начала цветения, в разгар цветения и через 1, 2, 3, 5, 10 и 15 суток после опыления. Структуру женских гаметофи-тов исследовали на классических микротомных препаратах, окрашенных гематоксилином [19], а также на препаратах просветленных семязачатков [20, 21] и целых зародышевых мешков, выделенных с использованием метода ферментативной мацерации с последующей диссекцией семязачатков [22]. Анализ просветленных препаратов проводили с помощью фазово-контрастного микроскопа «AxioStar Plus» (K.Zeiss, Германия). Во все сроки фиксации у каждого видообразца анализировали в среднем по 100 зародышевых мешков. Всего была изучена структура около 3000 мегагаметофитов.
Для выявления полиэмбрионов среди проростков зерновки проращивали в чашках Петри на влажной фильтровальной бумаге в термостате при температуре +23оС. Частоту полиэмбрионии
определяли как отношение семян с несколькими проростками к общему числу исследованных, выраженное в процентах.
Фотографирование проводили с использованием программ визуализации изображения «Zoombrawser» и «AxioVision» на микроскопах «AxioStar Plus» и «AxioScope».
Результаты и их обсуждение
Изученные виды мятликов являются факультативными псевдогамными апомиктами, у которых зародыш развивается партеногенетически, а эндосперм формируется после оплодотворения центральной клетки. У P chaixii и P pratensis нередуцированный зародышевый мешок образуется из соматической клетки нуцеллуса в результате трех последовательных митозов в соответствии с Poa (№егасшт)-типом [15-18, 23, 24], у P. badensis - из нередуцированной клетки диады мегаспор в соответствии с Taraxacum-типом [24, 25].
Проведенный анализ показал, что у растений всех трех видов при образовании зародышевых мешков и в процессе их дифференцировки создаются предпосылки к истинной и ложной по-лиэмбрионии (рис. 1, 2).
а б
в г д
Рис. 1. Эмбриологические предпосылки к истинной полиэмбрионии (P. pratensis): а, б - зародышевый мешок с яйцеклеткоподобной антиподой (пр - проэмбрио, пя - полярные ядра, ант - антиподы, яц - яйцеклетка); в, г - зародышевый мешок с двумя яйцеклетками в яйцевом аппарате; д - два глобулярных проэмбрио и клеточный эндосперм (энд)
- I ЧНь,
'-Л " vb ■i'l
-
.:
■; чягvsTUvV 1
T \ 7
и
i » * . ^
2 Ж. iV gfc* ' -
л* 's t.
• t
'л t.
Рис. 2. Эмбриологические предпосылки к ложной полиэмбрионии (P. pratensis): а, б - сдвоенные зародышевые мешки, в одном из которых присутствует партеногенетический проэмбрио (пр), в другом яйцеклетка (яц); в - два зародышевых мешка (зм), один из которых расположен внутри антиподального комплекса (ант) другого; г - два зародышевых мешка с проэмбрио и клеточным
эндоспермом
Нарушение поляризации и дифференциации элементов женского гаметофита приводят к формированию дополнительных яйцеклеток вместо синергид и в исключительных случаях - антипод [26-29]. Полигаметия делает возможным развитие нескольких зародышей на базе одного мегагаме-тофита. Более высокой частотой полигаметии характеризовались апоспорические виды P. pratensis (5,7%) и P. chaixii (4,0%). У диплоспорического P. badensis она составила лишь 0,1%. Только у P. pratensis в одном зародышевом мешке дополнительная яйцеклетка присутствовала среди клеток антиподального комплекса (см. рис.1 а, б). Во всех остальных случаях яйцеклеткоподобными были синергиды (см. рис.1 в, г).
Предпосылки к ложной полиэмбрионии у изученных видов создаются за счет развития в семязачатках нескольких зародышевых мешков (см. рис. 2). У P. pratensis и P. chaixii около трети всех исследованных семязачатков содержали два, реже три и в единичных случаях четыре и пять мегагаметофитов (табл. 1). Высокая частота образования множественных зародышевых мешков типична для апоспорических видов. Во-первых, при этой форме апомиксиса может происходить одновременное развитие в семязачатке эуспо-рического и апоспорического зародышевых мешков. Во-вторых, нередко несколько соматических клеток нуцеллуса вступают на путь мегагаметофитогенеза.
в
г
Таблица 1
Частота образования семязачатков с несколькими мегагаметофитами у изученных видообразцов
Вид Количество исследованных семязачатков Количество семязачатков с несколькими зародышевыми мешками, %
с двумя с тремя с четырьмя с пятью
P. badensis 120 2,5 0,0 0,0 0,0
P. chaixii 102 27,4 3,9 0,0 0,0
P. pratensis 131 25,9 4,6 0,8 0,8
У P. badensis только 2,5% семязачатков содержали сдвоенные зародышевые мешки. К сожалению, нам не удалось достоверно определить механизм их образования. Можно предположить лишь, что в исключительных случаях обе клетки диады мегаспор дают начало зародышевому мешку.
Исходная высокая частота семязачатков с цитоэмбриологическими предпосылками к полиэмбрионии снижалась по мере созревания семени. На завершающих стадиях эмбриогенеза
а 6
Рис. 3. Семена P. pratensis: а - с дифференцированным зародышем (зар) и клеточным эндоспермом (энд) (норма, дана для сравнения); б - с двумя глобулярными проэмбрио (пр) и без эндосперма
более двух зародышей в одном семени уже не встречалось, а количество семязачатков с двумя зародышами даже у апоспорических видов было практически вчетверо меньше, чем сумма исходной частоты полигаметии и частоты семязачатков с множественными зародышевыми мешками (табл. 2). При этом в некоторых семязачатках с двойнями наблюдалась остановка развития проэмбрио на глобулярной стадии из-за отсутствия эндосперма или его аномального строения (рис. 3, б).
На стадии проростков частота полиэмбрионии у P. pratensis составила 5,8%, у P. chaixii -1,8%. Полиэмбрионы были представлены только двойнями (рис. 4). У P. badensis семян с близнецовыми проростками не обнаружено. Фактическая частота многозародышевых семян достоверно и значительно отличалась от теоретически ожидаемой (рис. 5, табл. 3). Все это свидетельствует о том, что предпосылки к полиэмбрионии в большинстве случаев остаются не реализованными. В ходе развития семени происходит дегенерация дублирующих структур: дополнительных зародышевых мешков, яйцеклеток и зародышей.
В качестве одной из основных причин снижения потенций к полиэмбрионии нередко указывается конкуренция между дублирующими генеративными структурами [2, 18]. Особенности образования и развития близнецов не гарантируют их абсолютной идентичности. Напротив, в большинстве случаев они различаются своими
Таблица 2
Структура семязачатков на завершающих стадиях развития зародыша и эндосперма
Вид Количество семязачатков, %
Всего С клеточным эндоспермом С аномальным эндоспермом или без него Без зародыша и эндосперма
с одним дифференцированным зародышем с двумя дифференцированными зародышами без зародыша с одним глобулярным проэмбрио с двумя глобулярными проэмбрио
P. badensis 130 92,6 0,7 0,7 3,0 1,5 1,5
P. chaixii 120 86,1 5,8 0,8 1,6 2,5 3,2
P. pratensis 115 80,0 7,0 2,7 1,7 4,3 4,3
Рис. 4. Проросшие семена: а - с одним проростком (P badensis); б - с двумя проростками, один из которых выходит из семени в базальный области (P pratensis); в - с двумя проростками одинакового размера (P. pratensis); г-e - с двумя проростками разного размера (P. chaixii, P. pratensis)
□ Зародышевые мешки с несколькими яйцеклетками (полигаметия) И Семязачатки с множественными зародышевыми мешками ■ Семена с двумя проростками
Рис. 5. Исходная частота эмбриологических предпосылок к полиэмбрионии и фактическая частота семян с несколькими проростками у апомиктичных видов мятликов
Таблица 3
Отклонение фактически установленных данных по частоте полиэмбрионии от теоретически ожидаемой величины (по методу х2)
Вид Цитоэмбриологические предпосылки к полиэмбрионии, % Теоретически ожидаемая частота полиэмбрионии Фактическая частота полиэмбрионии X2
количество зародышевых мешков с дополнительными гаметами количество семязачатков с несколькими зародышевыми мешками
P. badensis 0,1 2,5 2,6 0,0 2,7
P. chaixii 4,0 31,5 35,5 1,8 49,6*
P. pratensis 5,7 32,1 37,8 5,8 43,5*
Примечание: х2^ {2,7; 3,84; 6,63}, *различия между теоретически ожидаемыми и фактически полученными данными достоверны при уровне значимости р>0,99
генетическими характеристиками (например, уровнем плоидности), временем индукции к развитию и взаимным расположением. Генетические различия, прежде всего, определяются разным способом происхождения дублирующих структур. Так, формирование зародышевых мешков в одном семязачатке может идти с участием мейоза и в его отсутствии, зародыш может развиваться партеногенетически и в результате оплодотворения. Генотип и уровень плоидности
зародышей может оказать существенное влияние на их развитие и конкурентоспособность.
Из-за разного времени индукции к развитию отстающая в росте структура может угнетаться более развитым аналогом. У P. pratensis и P. chaixii были зарегистрированы случаи, когда морфогенез зародышей нарушался вследствие того, что он оказывался сдавленным соседним зародышем (рис. 6 а, б) или соседним мегагаме-тофитом (см. рис. 6 в).
б
Рис. 6. Нарушение морфологии одного из близнецовых зародышей: а, б - зародышевый мешок с двумя проэмбрио, один из которых имеет нетипичную морфологию (а пр); в - два зародышевых мешка, в одном из которых проэмбрио имеет веретенообразную форму
в
Существенным препятствием на пути реализации цитоэмбриологических предпосылок к полиэмбрионии является остановка эмбриогенеза в результате аномального развития эндосперма или его отсутствия (см. рис. 3, б). Центральная клетка зародышевого мешка может остаться неоплодотворенной по разным причинам. Прежде всего, низкое качество пыльцы, характерное для апомиктов, снижает вероятность успешного опыления. Средняя степень дефектности пыльцы составила у P. badensis 59,8 ± 4,7%, P. chaixii - 45,26 ± 6,8%, P. pratensis - 47,23±16,2%.
Кроме того, расположение в семязачатке некоторых из множественных зародышевых мешков затрудняет проникновение в них пыльцевых трубок. Дополнительные зародышевые мешки у P. pratensis и P. chaixii нередко располагались перпендикулярно микропилярно-халазальной оси семязачатка под антиподами соседнего мегагаметофита (см. рис. 2, б), а иногда даже внутри его антиподального комплекса (см. рис. 2, в, табл. 4). Проникновение пыльцевых трубок в такие зародышевые мешки проблематично, а следовательно, для них существует риск остаться неоплодотворенными.
Таблица 4
Расположение множественных зародышевых мешков в семязачатках
Вид Количество семязачатков с несколькими зародышевыми мешками, %
Всего Расположение зародышевых мешков
параллельно друг другу перпендикулярно друг другу под углом менее 90о друг к другу один мегагаметофит лежит внутри антиподального комплекса другого
P. badensis 3 100,0 0,0 0,0 0,0
P. chaixii 32 53,1 15,6 15,6 9,4
P. pratensis 42 57,1 21,4 11,9 9,9
Таким образом, при разных типах апомик-сиса у мятликов на ранних стадиях эмбриологического развития создаются цитоэмбриологи-ческие предпосылки к ложной полиэмбрионии вследствие развития в семязачатках нескольких мегагаметофитов и предпосылки к истинной полиэмбрионии в результате формирования в зародышевых мешках нескольких яйцеклеток. Частота образования множественных мегагаметофитов существенно превышает частоту полигаметии. Апоспорические виды P. pratensis и P. chaixii обладают более высоким потенциалом для производства семян с добавочными зародышами по сравнению с диплоспорическим P. badensis. Значительное отклонение теоретически ожидаемой частоты полиэмбрионии от фактической и результаты цитоэмбриологического анализа свидетельствуют в пользу того, что среди дублирующих структур (зародышевых мешков, яйцеклеток и зародышей) в процессе их развития осуществляется клеточная селекция, в результате которой выживают наиболее жизнеспособные и занимающие в семязачатке более выгодное для нормального развития положение. Кроме того, низкое качество пыльцы, аномалии или отсутствие развития эндосперма могут служить существенным препятствием на пути реализации потенций к полиэмбрионии.
Список литературы
1. Лакшманан К. К., Амбегаокар К. Б. Полиэмбриония // Эмбриология растений : использование в генетике, селекции, биотехнологии : в 2 т. Т. 2. / под ред. В. М. Джори. М. : Агропромиздат, 1990. С. 5-38.
2. Батыгина Т. Б., Виноградова Г. Ю. Феномен полиэмбрионии. Генетическая гетерогенность семян // Онтогенез. 2007. Т. 38, № 3. С. 166-191.
3. Ernst A. Bastardierung als Ursache der Apogamie in Pflanzenreiche Eine Hypothese zur experimentellen Verebings und Abstammunglehre. Jena : G. Fischer, 1918. 666 s.
4. Webber J. M. Polyembryony // Bot. Rev. 1940. Vol. 6. № 11. P. 575-598.
5. Maheschwari P. Polyembryony in Angiosperms // Pa-leobotanist. 1952. Vol. 1. P. 319-329.
6. Lebegue A. La polyembryonie chez les Angiospermes // Bull. Soc. Bot. France. 1952. Vol.99. P. 329-367.
7. Lebegue A. Nouveaux aspects d'une classification embryologique // Bull. Soc. Bot. France. 1966. Vol. 113. P. 3-9.
8. Селиванов А. С. Многозародышевость семян и селекция. Саратов : Изд-во Сарат. ун-та, 1983. Ч. 1. 83 с.
9. Carman J. G. Gametophytic angiosperm apomicts and the occurrence of polyspory and polyembryony among their relatives // Apomixis Newsletter. 1995. № 8. P. 39-53.
10. Carman J. G. Asynchronous expression of duplicate genes in angiosperms may cause apomixis, bispory, tetraspory and polyembryony // Biol. J. Linn. Soc. 1997. Vol. 61, № 1. P. 51-94.
11. Солнцева М. П. Проблемы апогаметии // Бот. журн. 1999. Т. 84, № 8. С. 1-23.
12. Czapik R. Non-fuctional aposporous embryo sacs in flowering plants // XVII Inter. Cong. On Sex. Plant Reproduction. Abstr. Lublin, 2002. P. 48.
13. Шишкинская Н. А., Юдакова О. И., Тырнов В. С. Популяционная эмбриология и апомиксис у злаков. Саратов : Изд-во Сарат. ун-та, 2004. 145 с.
14. Nischimura M. On the germination and polyembryony of Poapratensis L. // Bot. Mag. Tokyo, 1922. P. 36.
15. Батыгина Т. Б., Маметьева Т. Б. К эмбриологии рода Poa L. // Актуальные вопросы эмбриологии покрытосеменных. Л. : Наука, 1979. С. 89-95.
16. Батыгина Т. Б., Фрейберг Т. Е. Полиэмбриония у Poa pratensis L. (Poaceae) // Бот. журн. 1979. T. 64, № 6. С. 793-804.
17. Кутлунина Н.А. Эмбриологическое изучение апо-миксиса у образцов мятлика лугового (Poa praten-sis L.), перспективных для селекции : автореф. дис. ... канд. биол. наук. Пермь, 1999. 20 с.
18. Кутлунина Н. А. Эмбриологическое изучение апо-миксиса и полиэмбрионии у мятлика лугового // Итоги интродукции и селекции травянистых растений на Урале. Екатеринбург : Изд-во Урал. ун-та, 2001. С. 197-214.
19. Паушева З. П. Практикум по цитологии растений. Изд. 4-е. М. : Агропромиздат, 1988. 272 с.
20. Herr Jm. J. M. A new clearing-squash technique for study of ovule, development in angiosperms // Amer. J. Bot. 1971. Vol. 20, № 8. Р. 785-790.
21. Юдакова О. И., Гуторова О.В., Беляченко Ю. А. Методы исследования репродуктивных структур и
органов растений. Саратов : Изд-во Сарат. ун-та, 2012. 38 с.
22. Куприянов П. Г. Ускоренные методы исследования зародышевого мешка // Выявление апомиктичных форм во флоре цветковых растений СССР. Саратов, 1978. С. 155-163.
23. Юдакова О. И., Шакина Т. Н. Псевдогамный апомиксис у Poa chaixii Vill. // Изв. высших учеб. заведений. Поволж. регион. 2006. № 5. С. 277-283.
24. Yudakova O. I., Shakina T. N. Apomixis in Poa chaixii Vill. and P. badensis Haenke // 3rd Inter. Apomixis Conf. Wernigerode, Germany. 27 June - 1 July 2007. Abst. Germany, 2007. P. 29.
25. Шакина Т. Н., Юдакова О. И. Апомиксис у Poa badensis Haenke // Бюл. Бот. сада Сарат. ун-та. Саратов : Изд-во Сарат. ун-та, 2007. Вып. 6. С. 102-104.
26. Шишкинская Н. А., Юдакова О. И., Тырнов В. С. Полигаметия // Бот. исследования в азиатской России : материалы XI съезда РБО : в 2 т. Барнаул, 2003. Т. 2. С. 176-177.
27. Шишкинская Н. А., Юдакова О. И., Тырнов В. С. Явление полигаметии у растений и его возможные эволюционно-генетические эффекты // Изв. Сарат. ун-та. Нов. сер. Сер. Химия. Биология. Экология. 2005. Т. 5, вып. 2. С. 25-32.
28. Юдакова О. И., Шишкинская Н. А. Эмбриологические особенности апомиктичных злаков. Саратов : Изд-во Сарат. ун-та, 2008. 105 с.
29. Юдакова О. И. Аномалии развития женского гаме-тофита у апомиктичных форм мятликов // Онтогенез. 2009. Т. 40, № 3. С. 38-46.
