CC BY
32
«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017
Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya
РОЛЬ АУТОАНТИТЕЛ К CD4 И РЕГУЛЯТОРНОГО РЕВМАТОИДНОГО ФАКТОРА В ГИБЕЛИ СD4+ ЛИМФОЦИТОВ У КРЫС, ИММУНИЗИРОВАННЫХ gp120 ВИЧ-1
Храмова Т.В., Снигирёв А.Я., Ворожцова В.С., Вайтина А.М.
ФГБОУ ВО «Удмуртский государственный университет», Ижевск, Россия БУЗ УР «Удмуртский республиканский центр по профилактике и борьбе со СПИДом и инфекционными заболеваниями», Ижевск, Россия
Введение. Сегодня одним из центральных вопросов патогенеза ВИЧ-инфекции, сдерживающим разработку эффективных способов лечения и предотвращения заболевания, является выяснение механизма гибели неинфи-цированных ВИЧ CD4+ лимфоцитов, которые составляют основную массу гибнущих клеток при ВИЧ-инфекции. Предложенные в разное время гипотезы, объясняющие механизм истощения незараженных CD4+ лимфоцитов при ВИЧ-инфекции, либо не получили экспериментального подтверждения, либо не считаются полностью доказанными. Наиболее непротиворечивой и обоснованной является аутоиммунная гипотеза. Согласно аутоиммунной гипотезе СПИДа, основной причиной гибели неза-раженных ВИЧ CD4+-лимфоцитов, является аутоиммунная реакция против CD4.
Цель. Исследование роли аутоантител к CD4, продукцию которых индуцирует gp120 ВИЧ, в гибели CD4+ лимфоцитов.
Материалы и методы. Крыс Wistar (n = 12) иммунизировали рекомбинантным gp120 гликопротеином ВИЧ-1 (ACROBiosystems) однократно в/к в составе неполного адъюванта Фрейнда (НАФ) в дозе 20 мкг. Уровень антител к gp120 ВИЧ-1 в плазме крови крыс определяли методом иммуноферментного анализа. Определяли уровень антител к рекомбинантному CD4 человека и уровень аутоантител к рекомбинантному CD4 крыс методом иммуноферментного анализа. Кроме того, определяли аутоантитела к CD4+ лимфоцитам крыс с помощью разработанного нами метода конкурентного иммуноцитохи-мического анализа. Количество CD4+ лимфоцитов в периферической крови крыс измеряли методом проточной цитофлуориметрии, используя меченые FITC антитела к CD4 крыс. Также определяли титр регуляторного ревматоидного фактора методом агглютинации танизиро-ванных нагруженных гомологичным IgG эритроцитов.
Результаты. Обнаружено, что иммунизация gp120 ВИЧ-1 вызывает продукцию аутоантител к CD4 у всех иммунизированных крыс, в то время как у контрольных крыс, получивших инъекцию НАФ, аутоантител к CD4 не обнаружено. Показано, что аутоантитела к CD4 связываются как с рекомбинантным СD4 крыс, так и с мембра-носвязанным CD4 крыс. Индуцированные иммунизацией gp120 аутоантитела к CD4 крысы способны связывать также рекомбинантный CD4 человека. Полученные факты служат подтверждением того, что gp120 ВИЧ-1 способен не только индуцировать продукцию антител к gp120, но и вызывать активацию аутореактивных лимфоцитов, продуцирующих аутоантитела, перекрестно реагирующие с CD4 крысы и человека.
У иммунизированных крыс, продуцирующих ауто-антитела к CD4, наблюдалось транзиторное снижение количества CD4+ лимфоцитов. Непосредственной связи
между уровнем антител к CD4+ лимфоцитам и количеством CD4+ клеток обнаружено не было. Однако снижение числа CD4+ лимфоцитов совпадало со спонтанным повышением уровня регуляторного ревматоидного фактора в крови. Обнаружена обратная корреляция между уровнем регуляторного ревматоидного фактора и количеством CD4+ лимфоцитов в крови крыс, продуцирующих аутоантитела к CD4, в ответ на иммунизацию gp120 гликопротеином ВИЧ-1 (г = - 0,73, р < 0,05). Регуляторный ревматоидный фактор был исследован у крыс с целью выяснения его роли в регуляции иммунного ответа к gp120, так как ранее на нескольких экспериментальных моделях было показано его участие в предотвращении развития аутоиммунных заболеваний (Beduleva, 2015). В регуляции иммунного ответа против gp120 ВИЧ регуляторный ревматоидный фактор участия не принимает.
Заключение. Таким образом, гибель CD4+ лимфоцитов у крыс, иммунизированных gp120 ВИЧ-1, является результатом совместного действия аутоантител к CD4 и регуляторного ревматоидного фактора. Мы предполагаем, что аутоантитела к CD4 вызывают активацию CD4+ лимфоцитов, что приводит к экспрессии на их поверхности активационных молекул, к которым специфичен регуляторный ревматоидный фактор. Связывание последнего ведет к гибели CD4+ лимфоцитов. Данное предположение не противоречит ранее обнаруженному факту, что регуляторный ревматоидный фактор убивает активированные CD4+ лимфоциты. Вопрос о том, какие именно молекулы активации на CD4+ лимфоцитах являются ли-гандом для регуляторного ревматоидного фактора, является предметом дальнейших исследований.
РЕАКЦИЯ ТУЧНЫХ КЛЕТОК В СЕМЕННИКАХ НА РАЗЛИЧНЫЕ ВИДЫ ИХ ПОВРЕЖДЕНИЯ
Храмцова Ю.С., Тюменцева Н.В., Юшков Б.Г., Бухарина А.Ю.
Институт иммунологии и физиологии УрО РАН, УрФУ, Екатеринбург, Россия
Тучные клетки являются неотъемлемым компонентом иммунного микроокружения семенников, а именно важными посредниками в управлении Т-клеточной толерантностью. Они также выделяют ряд цитокинов, участвующих в физиологическом апоптозе зародышевых клеток, происходящем в нормальном яичке. Вместе с тем, выявляется отчетливая отрицательная корреляция между такими показателями, как число мастоцитов и состояние сперматогенеза. Вырабатывая провоспалительные медиаторы, они могут усугублять воспалительные процессы, происходящие в яичке после повреждения. Причины, которые могут привести к повреждению семенников, самые разнообразные. Однако остается невыясненным вопрос о типе реакции тучных клеток в ответ на разные виды повреждения яичек. В связи с этим целью работы является изучение реакции тучных клеток в семенниках на различные виды его повреждения.
Материалы и методы. Исследование проведено на 35 половозрелых крысах-самцах линии Wlstaг, которые были разделены на 4 группы: 1) интактные; 2) животные с проколом левого семенника иглой диаметром 3 мм; 3) животные с тупой травмой левого семенника путем его сдав-ления; 4) животные с экспериментальной моделью ва-рикоцеле. Семенники исследовали на 7 и 30 сутки после воздействия. Для подсчёта тучных клеток в тканях срезы
2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue
Экспериментальные модели Experimental models
окрашивали толуидиновым синим. Подсчет проводили на единицу площади с пересчетом на 1 мм2. Для определения синтетической активности вычисляли средний гистохимический коэффициент. Для оценки функциональной активности рассчитывали индекс дегрануляции. Значимость различий при статистической обработке экспериментального материала оценивали по непараметрическому критерию Манна—Уитни.
Результаты. На 7 сутки после прокола не наблюдается каких-либо достоверных изменений в количестве тучных клеток в поврежденном семеннике, но к 30-м суткам происходит снижение этого показателя по сравнению с интактной группой. При этом синтетическая активность тучных клеток на все сроки эксперимента остается высокой. Индекс дегрануляции на 7 сутки растет, а на 30 возвращается к показателю интактных животных. После тупой травмы на 7 сутки возрастает количество тучных клеток, а на 30 сутки происходит снижение количества мастоцитов до уровня интактных животных. Вместе с количеством тучных клеток достоверно возрастает и их синтетическая активность на 7 сутки. На 30 сутки после воздействия уровень синтетической активности тучных клеток возвращается к показателям интактных животных. Индекс дегрануляции увеличивается на 7 сутки и остается таким же и на 30 сутки после тупой травмы. На 7 сутки после формирования экспериментальной модели варикоцеле не отмечается достоверных изменений в количестве тучных клеток семенников, но уже на 30 сутки данный показатель резко уменьшается. Оценивая функциональные показатели тучных клеток, отмечаем повышение их синтетической активности на 7 сутки. К 30-м суткам картина становится противоположной, и синтетическая активность резко снижается и становится достоверно меньше интактных показателей. Индекс деграну-ляции тучных клеток, в свою очередь, также значительно повышается к 7-м суткам и резко падает ниже интактного показателя к 30-м.
Заключение. Таким образом, гетерогенная тучнокле-точная популяция совершенно по-разному реагирует на различные повреждения семенника как количественными, так и функциональными изменениями. Можно предположить, что тучные клетки обладают разнонаправленным действием в зависимости от срока воздействия. Так, на ранние сроки мастоциты способствуют развитию воспаления и косвенно вызывают деструкцию органа, а на поздние сроки играют иммунорегуляторную роль в ре-паративных процессах в семеннике. Следовательно, повышение количества мастоцитов на ранние сроки может свидетельствовать об ухудшении картины восстановления, а на поздние сроки, наоборот, их повышенное количество указывает на положительный прогноз восстановления.
АКТИВАЦИЯ ТОЛЛ-ПОДОБНЫХ РЕЦЕПТОРОВ ВАКЦИНАМИ ПРОТИВ ГРИППА (IN VITRO)
Хромова Е.А., Сходова С.А, Столпникова В.Н., Кукина О.М., Ахматова Н.К., Костинов М.П.
ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова», Москва, Россия
Введение. Грипп остается актуальной проблемой здравоохранения на протяжении последних десятилетий. Единственным способом эффективного ограничения распространения гриппа и уменьшения тяжести его последствий является широкий охват вакцинацией групп
риска населения. Наибольшее применение, в силу своей высокой эффективности и малой реактогенности, получили инактивированные иммуноадъювантные вакцины против гриппа. В механизме формирования поствакцинального иммунитета в настоящее время отсутствует информация о сравнительной активности адъювантных и безадъювантных вакцин и их влиянии на врожденные эффекторы иммунной системы на молекулярно-клеточ-ном уровне.
Известно, что к факторам врожденного иммунитета относятся предсуществующие в организме до контакта с патогеном механизмы защиты, предназначенные для предупреждения проникновения возбудителя и для запуска раннего воспалительного ответа Toll-подобные рецепторы (TLRs), которые распознают широкий спектр пато-ген-ассоциированных молекулярных структур (PRRs).
Цель и задачи. Изучение влияния вакцин против гриппа на содержание клеток с экспрессией TLRs in vitro.
Материалы и методы. Экспрессию TLRs на МЛПК определяли методом проточной цитометрии с применением мАТ к TLR-2, TLR-3, TLR-4, TLR-5, TLR-8, TLR-9 (eBioscience, США) с использованием проточного цито-метра FC-500 (Beckman Culter, США).
Исследуемые вакцины: Инфлювак — субъединичная вакцина, Ваксигрип — сплит-вакцина. Данные вакцины содержат 2 штамма вируса гриппа А по 15 мкг, один штамм вируса гриппа В — 15 мкг. Гриппол плюс — поли-мер-субъединичная иммуноадъювантная вакцина. Содержит 2 штамма вируса гриппа А по 5 мкг, один штамм вируса гриппа В — 5 мкг и иммуноадъювант Полиоксидо-ний — 500 мкг.
Результаты. Изучение влияния данных вакцин на содержание гранулоцитов с экспрессией TLRs выявило существенное повышение экспрессии со стороны TLR-5, TLR-9. Более активным стимулирующим действием на TLR-3+ клетки обладала субъединичная вакцина (увеличение содержания в 7,2 раза), несколько ниже была активность иммуноадъювантной вакцины (увеличение в 5,1 раз), сплит-вакцина повышала экспрессию в 3,7 раз. Известно, что TLR-8 распознает одноцепочечные РНК вирусов и является специфическим рецептором для распознавания вируса гриппа. Максимально активирующим влиянием обладала субъединичная вакцина (увеличение в 5,7 раз), при этом активность сплит-вакцины была несколько ниже (в 4,1 раза). Это, вероятно, связано с костимулирующим влиянием на экспрессию TLR-8 Полиоксидония в составе иммуноадъювантной вакцины и воздействием поверхностных и внутренних вирусных белков в составе сплит-вакцины. В отношении активации лимфоцитов, экспрессирующих TLRs, было выявлено максимально активирующее влияние на эндосомаль-ные рецепторы сплит-вакцины. Под ее воздействием увеличивалась экспрессия TLR-9 в 4 раза, безадъювант-ная и адъювантная субъединичные вакцины оказывали меньшее стимулирующее влияние (увеличение в 2,8 и 3,3 раза соответственно). При инкубации МЛПК со сплит-вакциной происходило увеличение численности клеток с экспрессией TLR-8 в 10 раз. Иммуноадъювантная вакцина проявляла большую активность по сравнению с другими вакцинами только в отношении количества лимфоцитов с экспрессией TLR-4, что можно объяснить опосредованным лиганд-рецепторным взаимодействием. Также отмечено увеличение TLR-5—экспрессирующих моноцитов в 4,7 раз при стимуляции субъединичной вакциной. Выявлено, что иммуноадъювантная вакцина яв-
