CC BY
58
Щербаков Д.А.
ФГУ «Всероссийский центр глазной и пластической хирургии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» г. Уфа E-mail: guziel@mail.ru
РЕАКЦИЯ СИСТЕМЫ ЛИМФОЦИТОВ НА ВВЕДЕНИЕ БИОМАТЕРИАЛОВ АЛЛОПЛАНТ (ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ ДАННЫЕ)
Проведены морфологические и иммунологические исследования по введению биоматериалов Аллоплант в периферические органы иммунной системы. Лимфоцитарная реакция, наблюдаемая при этом выражается в активации лимфоцитопоэза. Показано, что биоматериалы Аллоплант, являясь аттрактантами стволовых клеток, взаимодействуют с системой Т-лимфоци-тов, изменяя соотношение различных клонов внутри популяции.
Ключевые слова: лимфоциты, биоматериалы.
До настоящего времени клеткам иммунной системы, в частности лимфоцитам, при аллотрансплантации, как правило, отводилась незначительная, а иногда и отрицательная роль [2]. Увеличение количества этих клеток или просто их появление в области аллотрансплантации рассматривалось как проявление иммунопатологии (присоединение аллергического компонента или начало аутоиммунного процесса). В итоге роль лимфоцитов в морфогенетических процессах при пересадке различных биоматериалов оставалась мало изученной. Хотя в классическом представлении Ф. Бернета (1964) иммунная система обеспечивает структурную и функциональную целостность организма, постоянство его химического и клеточного состава. По мнению А.Г Бабаевой с соавт. (2009), для реализации такой функции иммунной системе должны быть свойственны «цитогенетическая, цитостатическая и цитолитическая активность, т. е. хотя бы минимальные проявления морфогенетической функции». Учитывая изложенное, изучено взаимодействие аллогенных биоматериалов Аллоплант с иммунокомпетентными клетками.
В отделе морфологии совместно с лабораторией иммунологии Центра выполнены эксперименты по введению биоматериалов Аллоп-лант в органы иммунной системы. Исследования выполнены на 68 половозрелых крысах породы Вистар. Всем животным посредством открытого доступа (минилапоротомный разрез в левом подреберье) производилось инъекционное введение диспергированного материала 10 гр на 1 мл физ. раствора №01 в четыре точки (расстояние между вколами иглы - 0,5 см) на передней поверхности селезенки на глубину 2-3 мм (рис. 1). Животные были разделены на
четыре группы. В первой группе выполнялось введение аллогенного диспергированного биоматериала Аллоплант (ДБА) «Стимулятор регенерации» (ТУ42-2-537-2006), во второй группе ксеногенного биоматериала, в третьей - препарата Polysorb, размеры частиц которого соответствуют размерам ДБА (120 мкм). У животных четвертой группы ткань селезенки оставалась интактной. После манипуляции животным всех четырех групп производили послойное ушивание операционной раны.
Динамику морфологических изменений изучали на первые, третьи седьмые и 30-е сутки эксперимента. Гистологические срезы селезенки окрашивались по Ван-Гизону, гематоксилином и эозином, по Маллори. Проводилась поляризационная микроскопия. Для морфометрии использовались программа Biovision 3.0. Гистологические срезы селезенки, окрашенные гематоксилином и эозином, исследовали с помощью светового микроскопа Micros (МС-50) с цифровой фотонасадкой Nicon Coolpix 4500. Полученные фотоснимки передавались с Flash-карты фотоаппарата в ПК для дальнейшей обработки. С помощью предварительно откалиброванной на объектив 40 программы Biovision 3.0 производилось измерение толщины мантийной зоны вторичного лимфатического фолликула, толщины маргинальной зоны над фолликулом и площади зародышевого центра вторичного лимфатического фолликула. Полученные результаты автоматически переводились в программу Excel для устранения производственных погрешностей, далее в программу Statistica для построения графиков.
Для иммунологических исследований забор материала производился в первые, седьмые и 30-е сутки. Для иммунофенотипирования ис-
пользовались FITC-меченые моноклональные антитела фирмы Catlag против CD45 антигена крыс и PE-меченые антитела против CD90 антигена крыс, а также типировались активированные NK-клетки, лимфоциты, содержащие рецептор к IL-2, Т-хелперы и цитотоксические лимфоциты. Анализ экспрессии поверхностных антигенов проводили в проточном цитофлюо-риметре FACS Calibur (BD), учитывая, что зрелые лейкоциты имеют фенотип CD45+/CD90-, гематопоэтические стволовые клетки экспрессируют оба антигена CD45 и CD90, а фенотип CD45-/CD90+ принадлежит негематопоэтичес-ким стволовым клеткам (мезенхимальным предшественникам).
Резулкгаты морфологических исследований
Селезенка крысы имеет сегментарное строение. Капсула селезенки представляет собой плотную оформленную соединительную ткань толщиной 9-12 мкм с отходящими от нее трабекулами - рыхлая неоформленная соединительная ткань. Паренхима органа представлена двумя видами ткани - ретикулярная ткань, заполненная эритроцитами (красная пульпа) и лимфоидная ткань (белая пульпа). Последняя представлена лимфатическими пе-риартериальными влагалищами, эллипсоидами (эллипсоидными лимфоцитарно-макрофа-гальными муфтами) и лимфоидными фолликулами (рис. 2). Клеточный состав лимфоидных структур белой пульпы селезенки крыс следующий. Периартериальные влагалища представлены в основном лимфоцитами средними и малыми лимфоцитами, однако также обнаруживаются макрофаги. Размеры вторичных лимфатических узлов варьируют. Так, площадь центра размножения лимфатического фолликула составляет 15434,5±1321,57 мкм2 в норме. Клеточный состав ЦР: пролиферирующие лимфоциты и малые лимфоциты, также определяются макрофаги с включениями разрушенных лимфоцитов. Толщина мантийной зоны лимфатического фолликула в норме равна 67±9,18 мкм, а толщина маргинальной зоны над лимфатическим фолликулом по полученным данным - 58,7±10,7 мкм. В мантийной зоне (МЗ) определяются малые лимфоциты, а в маргинальной зоне на границе с вторичным фолликулом определяется маргинальный синус толщиной до 15 мкм. В МЗ выявляются
такие клетки, как средние лимфоциты, макрофаги, эритроциты и эозинофилы.
Красная пульпа селезенки крысы, как упоминалось выше, представляет собой ретикулярную ткань. В красной пульпе определяются селезеночные тяжи, венозные синусы и нефильтрующие зоны. Клеточный состав красной пульпы следующий: эритроциты, лимфоциты различных размеров и степени дифференцировки и макрофаги. Селезеночная артерия крысы после нескольких ветвлений (до 3 порядка) дает начало трабекулярным артериям, последние ветвятся до пульпарных (центральных) артерий, имеющих диаметр 30-120 мкм.
Пульпарные артерии продолжают ветвиться и, в конечном итоге, распадаются до капилляров. Мелкие артерии и артериолы также содержат периартериальные влагалища. С уменьшением калибра артерии уменьшается и диаметр влагалищ. Капилляры селезенки крысы окружены лимфоцитами и макрофагами - эллипсоидные лимфоцитарно-макрофагальные муфты. Последние содержат до четырех слоев клеток, концентрически расположенных вокруг капилляров.
Первые сутки. В области инъекции ДБА обнаруживаются фрагменты трансплантата, окруженные макрофагами. Последние адгези-руются на частицах ДБА и подвергают их биодеградации, наблюдается полиморфно-клеточная инфильтрация. Обнаруживались набухание и гомогенизация коллагеновых волокон ДБА, свидетельствующие о начинающейся деградации введенных частиц. Сам биоматериал инфильтрирован незначительно. В инфильтрате периферической зоны обнаруживаются следующие клетки: макрофаги, лимфоциты, недифференцированные соединительнотканные клетки, эозинофилы и эритроциты красной пульпы. Необходимо отметить важность локализации инъекции (красная или белая пульпа), определяющей характер окружения биоматериала на ранних сроках.
Наблюдалась активная сосудистая реакция окружающей ткани на введение ДБА. Место введения биоматериала обильно кровоснабжа-лось, наблюдалось образование мелких капилляров по периферии ДБА. Центральные зоны биоматериала не инфильтрированы клетками и не прорастают сосудами.
30-е сутки. Происходит формирование волокон коллагена в области введения биомате-
риала, окрашивающихся в голубой цвет при окраске по Маллори (рис. 4).
При инъекции ДБА в красную пульпу вблизи лимфоцитарных периартериальных влагалищ также наблюдается пролиферативная активность лимфоцитов. Следует отметить, что в выбранный срок периартериальные влагалища содержат большое количество макрофагов со светлой цитоплазмой. Они окружают островки пролиферации лимфоцитов.
Далее приведем результаты морфометрии селезенки при инъекции ДБА в ее паренхиму. В динамике определялась площадь центра размножения вторичного фолликула селезенки. В нативной селезенке площадь центра размножения в среднем составляет 15434,5±1322 мкм2. При введении ДБА в паренхиму селезенки на третьи сутки происходит увеличение данного показателя до 18750,3±1425 мкм2. Позднее (14-е сутки) площадь герминативного центра фолликула также увеличивается и составляет 21788,4±1760 мкм2.
Толщина мантийной зоны лимфатического фолликула в норме равна 67±9,18 мкм. На третьи сутки после введения ДБА в паренхиму селезенки происходит увеличение данного показателя до 88,6±9,16 мкм. В более поздние сроки (14-е сроки) толщина мантийной зоны уменьшается - 83,5±10,21 мкм.
Толщина маргинальной зоны над лимфатическим фолликулом селезенки по полученным данным составляет 58,7±10,7 мкм в норме. После инъекционного введения биоматериала
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
■ 45-90+
□ акт.ЕК
В рец. Ил-2
■ ЦТП
И 45+90+
■ Тх
Рисунок 5. Структура клеточных популяций селезенки на фоне введения различных материалов в ее паренхиму
Аллоплант происходит увеличение данного показателя до 97,2±8,64 мкм и до 110,3±12,93 мкм на 14-е сутки эксперимента.
Результаты иммунологических
исследований
Обнаружено увеличение содержания гема-топоэтических стволовых клеток CD45+CD90+ до 35±6,13 на фоне введения аллогенного биоматериала в ранние сроки. Данный факт подтверждает ранее полученные факты о том, что биоматериалы Аллоплант являются аттрак-тантами стволовых клеток [3] . Увеличение количества клеток-предшественниц в очаге введения биоматериала свидетельствует об оптимизации процессов репаративной регенерации.
В описываемых экспериментах в первые сутки выявлена тенденция к увеличению числа ЦТЛ (до 29,8±1,9; в нативной селезенке - 18±2), со снижением числа Т-хелперов (до 23,1±1,8; в нативной селезенке - 30±2), т. е. изменение соотношения хелперов и цитотоксических лимфоцитов (индекс = 0,7±0,1, в норме 2,1±0,2).
Также через 24 часа после введения происходит уменьшение количества активированных NK-клеток вплоть до полного отсутствия их в ткани селезенки (0±0,7; в нативной селезенке -до 10,3±2). Наблюдается снижение числа клеток, имеющих рецепторы к IL-2 (CD3-CD8+) до 2,4±0,7 (в нативной селезенке 27±3,1). Описанные явления представлены на рисунке 5.
Выводы
1. Введение биоматериала Аллоплант стимулирует репаративные процессы посредством активации, как макрофагальной системы, так и системы лимфоцитов. Что согласуется с данными литературы о стимулирующей роли лимфоцитов при репаративной регенерации.
2. Лимфоцитарная реакция, наблюдаемая при введении биоматериала Аллоплант в периферические органы иммунной системы различной структурной организации, включая селезенку, лимфатические узлы, неинкапсулиро-ванную лимфоидную ткань (GALT), выражается в активации лимфоцитопоэза.
3. Инъекционное введение Аллопланта позволило разработать гипотезу морфогенетического действия данного биоматериала. Макрофаг, содержащийся в маргинальной зоне над лимфатическим фолликулом, взаимодействует
с биоматериалом или антигенпрезентирующей клеткой. Получив необходимую информацию, данный макрофаг мигрирует в лимфатический фолликул, где происходит передача антигенной информации о биоматериале фолликулярной дендритной клетке. После чего происходит образование центра размножения - формируется вторичный лимфатический фолликул. При этом фолликулярная дендритная клетка на своих отростках производит презентирование полученной от макрофага информации об антигенах биоматериала. Таким образом, происходит селекция клона В-лимфоцитов, которые в последующем будут продуцировать антитела, высокоаффинные к антигенам трансплантата. В нашем исследовании данный механизм не рассматривается как ведущий, потому что биоматериалы Аллоплант не обладают высокой антигенной активностью. Другой путь стимуля-
ции системы лимфоцитов заключается в представлении макрофагом (или другой антигенп-резентирующей клетки) антигенов биоматериала (или их отсутствия) с выделением ряда ци-токинов (возможно ИЛ-6, ИЛ-1, ФНОб), которые активируют Т-хелперы, находящиеся в лимфоцитарном периартериальном влагалище. При этом происходит не только пролиферация Т-хел-перов, но и их дифференцировка в субпопуляцию ТЫ, возможно также образуется клон Т-клеток, несущих СБ4+, СБ 25+ маркеры, являющихся регуляторами иммунного ответа.
4. Биоматериалы Аллоплант являются ат-трактантами стволовых клеток и взаимодействуют с системой Т-лимфоцитов, изменяя соотношение различных клонов внутри популяции, что раскрывает морфогенетическую роль трансплантатов, опосредованную через лимфоцитарное звено иммунитета.
Список использованной литературы:
1. Бернет, Ф. Целостность организма и иммунитет / Ф. Бернет. - М., 1964.
2. Курчатова, Н.Н. Миграция клеток в имплантированные трехмерные структуры соединительнотканного матрикса / Н.Н. Курчатова, Э.А. Нигматуллина, Р.Ш. Юсупова и др.// Иммунология Урала. 2006-№1(5)-С.17-18.
3. Роль лимфоцитов в оперативном изменении программы развития тканей / А.Г. Бабаева, Н.М. Геворкян, Е.А. Зотиков // М.: Издательство РАМН, 2009. - 108 с.
