CC BY
42
УДК 616.981.452:576.8.093.2
С.А.Бугоркова, С.Ю.Задумина, В.В.Кутырев
РЕАКЦИЯ КЛЕТОК APUD-СИСТЕМЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ БИОМОДЕЛЕЙ НА ПОДКОЖНУЮ ИММУНИЗАЦИЮ ВАКЦИННЫМ ШТАММОМ YERSINIA PESTIS ЕВ
ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Установлено, что реакция клеток APUD-системы отражает иммунологические и адаптационно-компенсаторные процессы в организме морских свинок, привитых подкожно вакцинным штаммом Y. pestis ЕВ. Показана динамика изменения активности и количества апудоцитов в иммунокомпетентных органах в различные периоды иммуногенеза при противочумной вакцинации биомоделей. Применение количественной оценки содержания и функции апудоцитов в лимфоидных органах и надпочечниках при вакцинном процессе, позволяя характеризовать адаптационно-компенсаторные реакции в организме биомодели, делает возможным сравнительный анализ реактогенности и безвредности разрабатываемых против этой инфекции вакцин на этапах их доклинического испытания.
Ключевые слова: вакцинный штамм ЕВ, апудоциты, иммунизация, адаптационно-компенсаторные реакции.
Вакцинация является эффективным средством борьбы с чумой, но в силу своей реактогенности живая вакцина вызывает в макроорганизме сложный комплекс нейрогуморальных, метаболических и морфологических сдвигов [4], строгий учет которых позволит охарактеризовать безопасность как имеющихся, так и вновь создаваемых противочумных вакцин.
При вакцинации происходит мобилизация иммунной системы и тесно связанной с ней нейроэндокринной или АРиБ-системы [8]. Наличие большого числа апудоцитов в различных органах, в том числе и иммунокомпетентных, химическая общность действия основных регуляторных пептидов позволяют считать АРИБ-систему одной из систем реагирования, контроля и защиты макроорганизма [1, 10, 16]. Новый подход к выяснению роли апудоцитов в иммуногенезе при противочумной вакцинации на основе изучения их реакции в функционально значимых системах макроорганизма, расширяя представления о механизмах нейроиммуноэндокринных взаимоотношений, может быть применен для разработки методов оценки безопасности и эффективности противочумных вакцин и коррекции нарушений иммунного статуса при вакцинации ими.
Цель работы - охарактеризовать в динамике иммунологические и адаптационно-компенсаторные процессы в организме морских свинок, подкожно иммунизированных вакцинным штаммом У рвъиъ ЕВ, по реакции клеток АРИБ-системы.
Материалы и методы
Три группы морских свинок массой 400 г (27 особей) иммунизировали подкожно в область правого бедра взвесью двухсуточной агаровой культуры вакцинного штамма У pestis ЕВ (линии НИИЭГ) в дозах 1-107, 2-109 или 1,5-1010 м.к. в 2 мл изотонического раствора хлорида натрия. Контрольным животным (3 особи) аналогично вводили 2 мл изото-
нического раствора хлорида натрия. Наблюдение за животными осуществляли в течение 14 сут, вскрывая умерщвленных хлороформом морских свинок на 3-и, 7-е и 14-е сутки.
Для гистологического исследования кусочки внутренних органов (печени, почек, сердца, легких, селезенки, тимуса, надпочечников), лимфатических узлов (ЛУ, регионарных, контрлатеральных, отдаленных) и кожи места введения культуры фиксировали в 10 % водном нейтральном растворе формалина, а затем проводили по общепринятой схеме обработки материала для гистологического исследования [7]. Полутонкие парафиновые срезы окрашивали раствором гематоксилина и эозина [6], импрегнировали раствором нитрата серебра по Гримелиусу [13] для выявления аргирофильных (АГ) апудоцитов и по Массону в модификации Гамперля [9] - для выявления аргентаффинных (АТ). Готовые препараты просматривали в микроскопе Olympus CX31 с триноку-ляром, выполняя подсчет апудоцитов в 10 полях зрения правильно ориентированных срезов органов при увеличении 400 (селезенка, тимус, лимфатические узлы, легкие, надпочечники) и при увеличении 200 (двенадцатиперстная кишка), оценивая морфофункциональное состояние клеток по степени заполнения их аргирофильным или аргентафинным веществом. Статистическая обработка полученных данных выполнялась с использованием программы Microsoft Office Excel 2003.
Результаты и обсуждение
При макроскопическом исследовании на 3-и сутки после иммунизации морских свинок в месте введения обнаруживали небольшие очаги уплотнения тканей, умеренное полнокровие сосудов и очаговый отек подкожной клетчатки только при использовании максимальной дозы вакцинного штамма Y. pestis ЕВ (1,5-1010 м.к.). К 7-м суткам эти изменения уже не регистрировались. Гистологические изменения у
4б
животных этой группы характеризовали очаговую тканевую реакцию - выраженную воспалительную инфильтрацию полиморфно-ядерными лейкоцитами (ПМЯЛ) вокруг микробных скоплений. На введение меньших доз к 3-м суткам наблюдали незначительную межуточную мононуклеарную инфильтрацию. В последующие сроки (7-14-е сутки) видимых изменений не находили, и при гистологическом исследовании ни в одном случае не отмечали рубцовых изменений.
Использование наименьшей дозы Y. pestis ЕВ вызывало в регионарных лимфатических узлах (РЛУ) минимальные воспалительные изменения (в виде незначительного расширения маргинального синуса и явлений катара синусов мозгового вещества) отчетливее всего выраженные на 7-е сутки.
В течение всего периода наблюдения у животных всех групп превалировали признаки, характеризующие активный иммунный ответ. Об этом свидетельствовали: гиперплазия клеток с накоплением бластических элементов в Т-зоне, нарастающая от значительной до резкой степени выраженности; активация светлых центров фолликулов (В-зоны), ко-
торая постепенно стихала к 13-м суткам, сменяясь гиперплазией клеток в мозговых тяжах (В-зоны), где на фоне плазмобластической реакции даже формировались светлые центры в юкстамедуллярной зоне.
Данные по изменению количества клеток APUD-системы в лимфатических узлах и других органах представлены в таблице. После иммунизации дозой 1-107 м.к. динамику реакции клеток APUD-системы в РЛУ характеризовало плавное колебание количества АТ клеток вокруг контрольного значения и достоверное снижение числа АГ клеток на 3-и и 14-е сутки с относительным накоплением нейроэндокринных клеток (НЭК) к 7-м суткам. При введении Y. pestis ЕВ в дозе 2-109 м.к. отмечали достоверное снижение количества АТ клеток на 3-и, а АГ - на 7-е сутки, но на 14-е сутки число и тех, и других НЭК превышало аналогичные показатели у контрольных животных. Максимальная иммунизирующая доза (1,5-1010 м.к.) вызывала резкое опустошение АТ клеток к 7-м суткам и увеличение их количества к 14-м, в то время как число АГ элементов на протяжении всего срока наблюдения не достигало контрольных значений.
В контрлатеральных и отдаленных ЛУ изме-
Динамика реакции клеток APUD-системы у морских свинок, иммунизированных подкожно вакцинным штаммом Y. pestis ЕВ
Иммунизирующие дозы вакцинного штамма Y. pestis ЕВ
Орган / окраска 1107м.к 2-109 м.к 1,5^1010 м.к Интактный контроль
3- и сутки 7-е сутки 14-е сутки 3- и сутки 7-е сутки 14-е сутки 3-и сутки 7-е сутки 14-е сутки
Массон 2,б+0,23 2,0+0,89 2,8+0,б9 4,1+0,90 Легкие 3,1+0,05 3,8+0,75 3,4+0,23 5,5+1,04* 2,б+0,72 3,б+0,50
Гримелиус 1,7+0,б5 0,9+0,07* 1,3+1,01 2,б+0,89 1,8+0,б4* 1,9+0,55* 2,4+0,32 3,2+0,б4 1,б+0,23* 3,9+1,52
Массон 3,1+0,35 4,2+1,5б Группа регионарных лимфатических узлов 3,1+0,б5 2,4+0,б1* 2,5+0,28 4,8+2,11 3,8+1,11 0,9+0,б1* 4,1+0,07 3,3+0,б8
Гримелиус 1,5+0,89* 2,9+0,б1 1,2+0,4б* 3,3+0,89 2,5+0,29* 4,б+1,58 2,3+0,32 2,7+0,51 2,3+0,51 3,7+0,50
Массон 2,7+0,75 Группа контрлатеральных лимфатических узлов 2,5+1,04 4,1+1,12* 2,2+0,90 4,5+0,7б* 3,б+0,б5 5,0+2,31* 2,7+1,82 4,0+1,15 2,7+0,51
Гримелиус 1,1+0,47 0,9+0,02* 1,5+0,5 2,7+1,17 4,8+0,б4* 3,7+0,89 2,4+0,30 2,4+1,50 3,7+0,51 2,2+0,53
Массон 4,9+1,09 3,2+1,0б Группа отдаленных лимфатических узлов 4,4+1,28 3,3+0,90 5,2+0,б9* 2,9+1,05 1,5+0,54* 3,4+1,05 5,0+1,02* 3,8+1,51
Гримелиус 3,1+1,07 2,9+0,б9 2,4+0,5 2,9+0,б1 4,9+0,б1* б,б+2,57* 1,7+0,б1 2,0+1,10 2,8+0,52 2,8+0,б4
Массон 3,б+1,59 18,1+1,18* 2,1+1,12 Тимус б,5+1,2* 2,7+1,01 2,4+0,84 2,9+0,89 2,1+0,0б 3,1+0,0б 2,1+0,95
Гримелиус 2,7+1,17 15,3+2,47* 1,8+0,53 3,8+0,9 3,2+0,б4 1,9+0,0б 1,б+0,31 3,5+2,02 2,8+0,12 2,8+1,01
Массон 3,8+0,53 3,7+0,17 2,7+0,51* Селезенка 2,2+0,б5* 5,5+0,29 4,1+0,87 3,9+0,0б 2,2+0,53* 3,8+0,11 5,б+0,35
Гримелиус 2,4+0,89* 2,б+1,09 2,7+0,52 2,1+0,3б 2,4+1,05 3,б+0,92 3,8+1,50 3,1+2,0б 2,8+0,12 3,7+0,б4
Массон 5,4+2,44 2,5+0,51* 2,4+0,42* Надпочечники 3,5+0,89* 2,5+1,04* 2,3+1,07* 2,8+0,52* 4,7+2,14* 2,8+0,б4* 7,1+1,05
Гримелиус 3,1+1,45 1,9+0,75* 1,9+0,51* 3,б+1,44 2,7+1,02 3,2+1,01 1,8+0,б1 1,4+0,52* 2,9+1,53 3,7+0,б4
* р<0,05
нения характеризовали менее интенсивный иммунный ответ: активность Т- и В-зон к 7-м суткам колебались от незначительной (при дозе 1-107 м.к.) до выраженной (при дозе 2-109 м.к.), а умеренные воспалительные явления (лимфаденит, периаденит, в том числе с продуктивной реакцией) в основном встречались при иммунизации максимальной из использованных доз.
В контрлатеральных ЛУ после введения У pes-tis ЕВ в дозе 1-107 м.к. при общей тенденции к снижению числа АГ клеток во все сроки по сравнению с контрольным уровнем достоверным оно было на 7-е сутки, а количество АТ элементов, напротив, достоверно возрастало к 14-м. С увеличением дозы иммунизации (2-109 м.к.) максимальные показатели активности как АГ, так и АТ клеток наблюдали к 7-м суткам, с последующим некоторым снижением их числа к 14-м. Максимальная иммунизирующая доза вызывала резкий подъем числа АТ клеток уже к 3-м суткам, а количество АГ элементов в течение всего периода наблюдения превышало контрольный уровень, особенно на 14-е сутки.
При иммунизации У pestis ЕВ в дозе 1-107 м.к. в отдаленных лимфатических узлах наблюдали умеренное колебание числа НЭК, достоверно не отличающееся от контрольных показателей. С увеличением иммунизирующей дозы (2-109 м.к.) регистрировали выраженную активацию обоих видов НЭК к 7-м суткам, и количество АГ клеток росло вплоть до 14-х суток. При максимальной иммунизирующей дозе после начального снижения уровня АТ клеток на 3-и сутки происходило существенное накопление их к 14-м суткам, а число АГ элементов, несколько сниженное в первые два срока, к 14-м суткам так и не превысило контрольный уровень.
В селезенке реакция клеток белой и красной пульпы на введение У pestis ЕВ в целом характеризовалась высокой интенсивностью. Гиперплазия клеток в органе достигала максимальной степени выраженности в период с 3-х по 7-е сутки. Это проявлялось увеличением размеров мальпигиевых телец, накоплением в их Т- и В-зонах значительного числа бластических форм лимфоцитов, формированием крупных высокоактивных светлых центров. В пери-трабекулярных скоплениях (ПТС) красной пульпы, значительно или умеренно выраженных, на пике гиперплазии клеток белой пульпы на 7-е сутки определялись лимфобласты. Помимо лимфобластов в ПТС и в других участках красной пульпы после введения У pestis ЕВ в дозах 2-109 и 1,5-1010 м.к. присутствовали в виде небольшой примеси ПМЯЛ, что указывало на развитие очагового инфекционного спленита. С 3-х суток значительно возрастали число и активность макрофагов и стромальных элементов - ретикулярных клеток, активность которых, хотя и сниженная, сохранялась вплоть до 14-х суток. На этом фоне количество АГ и АТ клеток в селезенке во всех случаях было несколько ниже контрольных показателей.
В тимусе признаки гиперплазии клеток и телец
Гассаля выявлялись в течение всего периода наблюдения. Клетки АРИБ-системы отвечали максимальной активацией на 7-е сутки при иммунизации У pes-tis ЕВ в дозе 1-107 м.к. и на 3-и - при иммунизации в дозе 2-109 м.к. А высокая иммунизирующая доза вызывала даже некоторое торможение активации НЭК: АГ на 3-и, а АТ - на 7-е сутки.
Описанные изменения апудоцитов в лимфоидных органах, происходящие в ответ на введение вакцинного штамма У pestis ЕВ, отражают регуляторные свойства синтезируемых этими клетками биологически активных веществ (БАВ) и пептидов. Активация НЭК тимуса в период с 3-х по 7-е сутки, коррелирующая с процессами активации лимфоидных элементов в органе, согласуется с данными о роли этого органа как координатора молекулярных и клеточных нейроэндокринных взаимодействий [14, 15]. Способность тимусных эпителиальных клеток (ТЭК) секретировать такие БАВ, как серотонин, мелатонин, гистамин и другие [2], и продуцировать сигнальные молекулы - цитокины, играющие важную роль в дифференцировке и пролиферации ти-моцитов [5], позволяет предположить участие НЭК не только в иммуномодулирующих процессах, но и в ограничении аллергизирующих и общетоксических реакций макроорганизма. В периферических органах иммунной системы первоначально регистрируемое снижение количества апудоцитов, направленное на стимуляцию иммунной реакции, в последующем сменяется увеличением их числа, способствуя ограничению интенсивности процесса [10]. С увеличением дозы У pestis ЕВ развивающиеся явления острого лимфаденита в РЛУ, по-видимому, сопровождались более ранней (до 3-х суток) активацией апудоцитов, в первую очередь АТ клеток, а к 7-м суткам активность этих элементов резко уменьшалась. К 14-м суткам, когда явления острого воспаления стихают, число НЭК начинает нарастать, что может быть отражением регуляторного влияния продуктов секреции этих клеток на различные компоненты или фазы воспалительного процесса.
В легких у животных до 7-х суток отмечали периваскулярную мононуклеарную инфильтрацию и умеренное полнокровие сосудов и капилляров, к концу периода наблюдения эти проявления заметно ослабевали. При иммунизации большими дозами у отдельных животных обнаруживали мелкие очаги утолщения межальвеолярных перегородок за счет инфильтрации их пролиферирующими гистиоцитами и лимфоидными элементами. Количество АТ элементов было аналогично контрольному уровню при иммунизации в дозе 1-107 и 2-109 м.к., но достоверно увеличивалось к 7-м суткам после введения У pestis ЕВ в дозе 1,5-1010 м.к. Ультраструктура эндокринных клеток бронхиального эпителия сходна с ЕС-клетками в кишечнике [12], а физиологический эффект продуктов их секреции предполагает региональный кон -троль за вентиляцией и перфузией в органе. Поэтому реакция апудоцитов в легких является отражением
нарушенного перфузионно-вентиляционного отношения (ПВО), что наблюдается, например, при использовании больших доз Ypestis ЕВ. ПВО определяли по отношению площади действующих альвеол к площади капилляров на единицу площади среза. Так, при иммунизации животных 1-107 и 2-109 м.к. ПВО к 7-м суткам составляло - 30,12 и 27,82 соответственно. Этот показатель у животных, иммунизированных Y pestis ЕВ в дозе 1,5-1010 м.к., составлял 10,01 и был в 3 раза ниже контрольного (30).
В миокарде и почках регистрировались лишь признаки функционального напряжения паренхиматозных элементов и незначительного полнокровия сосудов.
В печени встречали очаги баллонной дистрофии гепатоцитов от резкой в ранний срок до значительной и умеренной в поздние сроки, наблюдали умеренную пролиферацию звездчатых ретикулоэндотелиоцитов и мелкие мононуклеарные инфильтраты (до 10 клеток) как вокруг сосудов, так и внутри печеночных долек.
В надпочечниках отмечали очаговое, умеренное или значительное, сужение клубочковой зоны коркового вещества, а также обеднение липоидами сетчатой и/или пучковой зон на 3-и -7-е сутки. Наблюдалось снижение феохромии мозгового вещества от умеренной до значительной степени на 7-13 -е сутки в зависимости от дозы вводимого штамма Y pestis ЕВ. Реакция клеток APUD-системы была однотипной независимо от иммунизирующей дозы вакцинного штамма Y. pes-tis ЕВ и заключалась в резком угнетении в первую очередь АТ элементов в интервале с 3-х по 7-е сутки. Эта реакция апудоцитов укладывается в характеристику стрессорных реакций макроорганизма и подтверждается колебанием концентрации БАВ в крови в ранние сроки после введения препаратов [3, 11].
Таким образом, учет количества апудоцитов в иммунокомпетентных органах, легких и надпочечниках при противочумной вакцинации позволяет судить не только о направленности процессов иммуногенеза, но и о стрессорной реакции макроорганизма на введение различных использованных доз вакцинного штамма Y. pestis ЕВ и может быть рекомендован к применению для сравнительной оценки реак-тогенности и безвредности вновь разрабатываемых противочумных вакцин на этапах их доклинического испытания.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Акмаев И. Г. Современные представления о взаимодействии регулирующих систем: нервной, эндокринной и иммунной. Усп. физиол. наук. 199б; 27(l):3-l9.
2. Акмаев И.Г. Нейроиммуноэндокринология: факты и гипотезы. Пробл. эндокринол. 1997; 1(43):3-9.
3. Анисимова Т.И., Сергеева Г.М., Саяпина Л.В. Электрофоретическая подвижность и энергетический заряд аде-ниловой системы лимфоцитов крови морских свинок, привитых против чумы субкультурами штамма Yersinia pestis EV c различной иммуногенностью. Биопрепараты. 2005, сентябрь. С. 17-20.
4. Бунин К.В., Гапочко К.Г. Прививочные реакции при иммунизации живыми вакцинами. М.: Медицина; 1970. 29б с.
5. Кветной И.М., Ярилин А.А., Полякова В.О. Нейроиммуноэндокринология тимуса. СПб; 2005. 102 с.
6. Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. М.: Мир; 19б9. б45 с.
7. Меркулов Г. А. Курс патогистологической техники. - М.: Медицина; 19б9. 423 с.
8. Пальцев М. А., Иванов А. А., Северин С.Е. Межклеточные взаимодействия. М., 2003.
9. Пирс Э. Гистохимия. Португалов В.В., редактор. М.: Изд-во Иностранная литература; 19б2. 9б2 с.
10. Райхлин Н.Т., Кветной И.М., Осадчук М.А. APUD-система (общепатологические и онкологические аспекты). Обнинск; 1993. Ч. 1-2. 172 с.
11. Щуковская Т. Н. Регуляция нейромедиаторами формирования специфической резистентности к особо опасным инфекциям. Аллергология и иммунология. 2000; 1(2):110-1.
12. Feyrter G.L. Uber die peripheren endokrinen (parakrinen) Drusen des Menschen. Wien-Dusseldorf W.Maudrich, 1953. 231 s.
13. Grimelius L. A silver nitrate stain for 12 cells in human pancreatic islets. Acta Soc. Med. upsaliensis. 19б8. 73:243-70.
14. Мanley N.R. Thymus organogenesis and molecular mechanisms of thymic epithelial cell differentiation. Semin. Immunol. 2000; l2(5):42l-8.
15. Maroder M., Bellavista D., Vacca A. et al. The thymus at the crossroad of neuroimmune interactions. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2000; 217:741-7.
16. Toni D.R. The neuroendocrine system: organization and homeostatic role. J. Endocrinol. Invest. 2004; 27 Suppl. б:35-47.
S.A.Bugorkova, S.Yu.Zadumina, V.V.Kutyrev
Reaction of APUD-System Cells of Experimental Biomodels to Subcutaneous Immunization by Yersinia pestis EV Vaccine Strain
Russian Anti-Plague Research Institute “Microbe"
It was stated that the reaction of APUD-system cells reflects immunologic and adaptive-compensatory processes in the organisms of guinea-pigs subcutaneously inoculated by Y. pestis EV vaccine strain. Shown was the dynamics of changing of activity and quantity of apudocytes in immunocompetent organs in different periods of immunogenesis after anti-plague vaccination of biomodels. Implementation of quantitative assessment of content and function of apudocytes in lymphoid organs and adrenals during vaccination process allows characterizing the adaptive-compensatory reactions in biomodel organism and makes it possible to comparatively analyze reactogenicity and safety of vaccines developed against this infection on the stages of their preclinical trials.
Key words: EV vaccine strain, apudocytes, immunization, adaptive-compensatory reactions.
Поступила 20.02.08.
