CC BY
38
_Успехи в химии и химической технологии. ТОМ XXIX. 2015. № 6_
УДК 541.15
В.В. Николаева*, Э.П. Магомедбеков, И.Г. Антропова, А.А. Фенин
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125480, Москва, Героев Панфиловцев дом 21, корпус 1 * e-mail: valli888@bk.ru
РЕАКЦИОННАЯ СПОСОБНОСТЬ КОФЕЙНОЙ КИСЛОТЫ С СУПЕРОКСИД АНИОН-РАДИКАЛОМ
Аннотация
Окислительное воздействие на клетки живого организма губительно для их жизнедеятельности. Супероксид анион-радикал вызывает апоптоз клеток. Реакционная способность кофейной кислоты с суперокстд анион-радикалом определена с применением нитросинего тетразолий хлорида. НСТ известен как индикатор супероксид анион-радикалов, возникающих при воздействии ионизирующего излучения.
Ключевые слова: кофейная кислота, супероксид анион-радикал, нитросиний тетразолий хлорид, радиолиз, у-излучение, радиопротектор.
Окислительное воздействие на клетки живого организма губительно для их жизнедеятельности. Повреждение клеточной мембраны, увеличение концентрации липопротеина низкой плотности и ферментативное окисление и т.д. являются следствием образования в организме супероксид анион-радикала (СОАР). Известно, что эта активная форма кислорода взаимодействует с липопротеинами, пептидами и молекулами ДНК -вызывает окислительное разрушение данных молекул и приводит к апоптозу клетки. Целью многих научно -исследовательских работ в современности является установление механизма образования повреждающих радикалов и их взаимодействия в системе. Введение
химически-активных соединении - антиоксидантов в систему и изучение их протекторного действия в отношении радикалов - основная задача научных проектов.
Полифенольные соединения повсеместно распространены в лекарственных растениях и в пище. Непредельные карбоновые кислоты содержатся в продуктах питания в качестве эфира. Одна из числа наиболее распространенных и потребляемых фенольных кислот является кофейная кислота (Са£). П-кумаровая кислота имеет схожую структурную формулу, менее распространена, используется в качестве вещества для сравнения [1].
ноос-сн . „ „ ...
а) б)
Рис.1. Структурные формулы молекул фенольных кислот: а) кофейная кислота; б) п-кумаровая кислота.
-{>он
Цель научно-исследовательской работы - оценка реакционной способности раствора кофейной кислоты с СОАР непрямым методом в реакции с нитросиним тетразолием хлоридом (НСТ).
Для этого оценили скорость накопления диформазана в системе: кофейная кислота-НСТ-спирт в фосфатном буфере. Исходя из полученных экспериментальных данных, рассчитали константы взаимодействия кофейной кислоты с СОАР.
Методика.
В работе использовались реактивы: бледно-желтый кристаллический порошок кофейной кислоты («Sigma Aldrich», США); 97 % очищенный этанол;
кристаллический порошок нитросинего тетразолия хлорида («Across organics», США). Фосфатный буфер, равный рН=7,4, готовили из NaH2PO4 и Na2HPO4.
Все растворы готовили на деионизованной воде, очищенной на фильтрах Millipore.
Для исследования супероксидгенерирующей системы в присутствии НСТ (таблица 1) использовали антиоксидантное вещество - кофейную кислоту с концентрациями до 2*10-4 моль/л. Концентрация НСТ в системе оставалась постоянной и равна 50 мкмоль. Вещества растворяли в водно-спиртовой системе Юэтатфнола=5%.
Таблица 1.Содержание исходных компонентов для системы кофейная кислота-НСТ.
№ [Caf],моль/л V (Caf), мл V (НСТ), мл V5%EtOH в буф.,мл
1 0 0 2.5 2.5
2 0.25Х10-4 0.25 2.5 2.25
3 0.05х10-4 0.5 2.5 2.0
4 1.0х10-4 1.0 2.5 1.5
5 1.5х10-4 1.5 2.5 1.0
6 2.0х10-4 2.0 2.5 0.5
Успехи в химии и химической технологии. ТОМ XXIX. 2015. № 6
Спектральные исследования образования диформазана в системе проводили в фосфатном буфере рН=7,4 на спектрофотометре СФ-2000 при комнатной температуре. При аналитической длине волны 542,5 нм регистрировали образование диформазана, продукта восстановления НСТ. Дополнительной аналитической длиной волны стала Х=900,2 нм, которая взята для обработки данных.
Измерение спектра фиолетового-синего окрашенного продукта восстановления НСТ показало наличие максимума оптического поглощения в области 560 нм, что соответствует литературным данным образованию диформазана [3].
Концентрация образования диформазана оценивали по формуле: AI=IX=542-IX=900. Константу взаимодействия кофейной кислоты с диформазаном рассчитывали по экспериментальным данным тангенс угла наклона [w(caf)]/[ w( НСТ)] = f([w(caf)]/[w(HCT)])= k[caf+COAP]/ k[HCT].
Мощность дозы излучения по дозиметру Фрикке равна 0,079 Гр/с. Для генерирования свободных радикалов в системе, а в частности СОАР, использовали установку РХМ- у-20 Со60 РХТУ им. Д.И. Менделеева в диапазоне доз 0-160 Грэй. Диапазон доз был подобран экспериментальным путём.
Представленные данные являются средними значениями, полученными в независимых экспериментах при 3-5 параллельных измерениях, статистическая погрешность измерений равна ±0,005.
Результаты и обсуждение.
НСТ известен как индикатор супероксид анион-радикалов, возникающих при воздействии
ионизирующего излучения[2]. При помощи такой системы является возможным непосредственно идентифицировавть образование О2- , который восстанавливает НСТ до диформазана. Скорость образования диформазана представлена на рис.2. Зависимость накопления диформазана от дозы облучения подчиняется линейному закону. С увеличением дозы ионизирующего излучения пропорционально увеличивается скорость образования диформазана. Поскольку О2-непосредственно «ловится» молекулами НСТ, то по образованию диформазана его можно оценить количественно.
При введении в систему кофейной кислоты разной концентрации зависимости концентрация-время облучения (рис.3), не меняют характер кривых, меняется угол наклона относительно контроля.
Количественная оценка скорости взаимодействия СОАР с кофейной кислотой представлена на рис.4. Кривые изменений оптической плотности от времени облучения для кофейной кислоты меняются линейно. Как видно, угол наклона кривых меняется от значений концентраций. На графике дублируется кривая накопления диформазана, она является контролем.
Для сравнения реакционной способности исследовали взаимодействие диформазана с п-кумаровой кислотой. По литературным данным она применяется при лечении хронических заболеваний и зарегистрирована в реестре антиоксидантов. Анализ реакционной способности п-кумаровой кислоты с НСТ не проявил антиоксидантных свойств.
Рис. 2. Зависимость изменения накопления диформазана от времени облучения
Рис.3. Зависимости изменений накопления диформазана от времени облучения при разных концентрациях кофейной кислоты: 1- контроль, НСТ; 2- с=0,5*10-4 моль/л; 3- с=1,30*10"4 моль/л; 4- с=2,*10-4 моль/л.
Успехи в химии и химической технологии. ТОМ XXIX. 2015. № 6
Рис.4 Зависимости изменения [w (НСТ)] [w (caf. acid)] от [w (caf. acid)]/[w (НСТ)]
Исследуя реакции взаимодействия СОАД с антиокисдантом - кофейной кислотой, по накоплению продукта окисления НСТ диформазана, установлена экспериментальная константа взаимодействия кофейной кислоты с СОАР к^+СОЛР]=3.2*Ю4 л/(моль*с). Уравнение описывается законом второго порядка, реакция взаимодействия радикала с исследуемым веществом протекает посредствам образования короткоживущих промежуточных продуктов. Метод оценки реакционной способности вещества «кофейная кислота - НСТ» является
чувствительным, но не избирательным. Не смотря на неселективность метода, кофейная кислота проявляет себя как высокоактивный антиоксидант и радиопротектор.
Ингибирующая способность кофейной кислоты высока при сравнительной оценке в диапазоне микроконцентраций. Данные о том, что при малых концентрациях наблюдается терапевтическое действие биологически активных веществ [3], коррелируют с экспериментальными данными по данной работе.
Николаева Валентина Викторовна аспирант первого года обучения кафедры химии высоких энергий и радиоэкологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Магомедбеков Эльдар Парпачевич к.х.н., доцент, зав.кафедры химии высоких энергий и радиоэкологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Антропова Ирина Геннадьевна к.х.н., доцент кафедры химии высоких энергий и радиоэкологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Фенин Анатолий Александрович, старший преподаватель кафедры химии высоких энергий и радиоэкологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Литература
1. Burgos-Moron E., Calderon-Montano J.M. The coffee Constituent Chlorogenic Acid Induces Cellular DNA Damage and Formation of Topoisomerase I and II-DNA Complexes in Cells // Agriculture FoodChem. 2012. Vol. 60. P. 7384-7394.
2. Dorfman L. M., Taub I. A. and Buhler R.E. // J. Chem. Phys. 1962. Vol. 36. P. 3051
3. Меньшикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. М.: Издательский дом «Слово». 2006
Valenytina Viktorovna Nikolaeva*, Irina Gennadievna Antropova, Eldar Parpachevich Magomedbekov, Anatoliy Aleksandrovich Fenin
D.I. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia.
* e-mail: valli888@bk.ru
REACTIVITY ABILITY OF CAFFEIC ACIDS WITH SUPEROXIDE ANION-RADICAL
Abstract
Oxidative effect on the cells of a living organism is detrimental effect to their livehoods. Superoxide anion radical induces apoptosis. Reactivity of caffeic acid and superoxid anion-radical determined using nitroblue tetrazolium chloride. NBT is known as an indicator of superoxide anion radicals arising from exposure to ionizing
Key words: caffeic acid, superoxide anion-radical, nitroblue tetrazolium chloride, radiolisys, y-radiation, radioprotector.
