CC BY
142022, т. 12, № 2
крымский журнал экспериментальной и клинической медицины
УДК 616.697-021.6. DOI: 10.29039/2224-6444-2022-12-2-28-32
РЕАБИЛИТАЦИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО НАРУШЕННОГО СПЕРМАТОГЕНЕЗА ПРИМЕНЕНИЕМ ФАКТОРОВ РОСТА ПЛАЗМЫ, ОБОГАЩЕННОЙ ТРОМБОЦИТАМИ
Демяшкин Г. А.1,2, Боровая Т. Г.3, Корякин С. Н.2, Вадюхин М. А.1, Щекин В. И.12
'ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова (Сеченовский Университет), 119048, Москва, Россия
2ФГБУ Медицинский радиологический научный центр им. А.Ф. Цыба - филиал ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр радиологии» Минздрава РФ (ФГБУ «НМИЦ радиологии»), 249036, Обнинск, Россия.
3ФГБУ Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи, 123098, Москва, Россия.
Для корреспонденции: Демяшкин Григорий Александрович, к.м.н., зав. лабораторией гистологии ИТМиБ, Первого МГМУ им. И.М. Сеченова; заведующий отделом патоморфологии «НМИЦ радиологии» Минздрава России, e-mail: dr.dga@mail.ru
For correspondence: Demyashkin Grigory, PhD, Head of Department of Histology, ITM &B of Sechenov University; Head of the Department ofPathomorphology, «NMRC for Radiology», e-mail: dr.dga@mail.ru
Information about authors:
Demyashkin G. A., https://orcid.org/0000-0001-8447-2600 Borovaya T. G., https://orcid.org/0000-0001-8444-1801 Koryakin S. N., https://orcid.org/0000-0003-0128-4538 Vadyukhin M. A., https://orcid.org/0000-0002-6235-1020 Shchekin V. I., https://orcid.org/0000-0003-3763-7454
РЕЗЮМЕ
Разработка новых способов лечения мужского бесплодия, которые являлись бы максимально эффективными и экономически выгодными во вспомогательных репродуктивных технологиях, остается предметом научных исследований. Представляет актуальность изучение восстановления нарушенного сперматогенеза с применением различных факторов роста и их комбинаций. Цель исследования - оценка морфологических изменений семенников при использовании факторов роста плазмы, обогащенной тромбоцитами (PRP). Материал и методы. Самцы Wistar (n=135) были поделены на 5 групп: I - Контроль; II, III, IV - локально облучали электронами, доза 2 Гр; затем животным III группы вводили PRP и IGF-1, IV и V - вводили PRP. Результаты. Через неделю после облучения у животных отмечали нарушение сперматогенеза, постепенное восстановление которого наблюдали на фоне введения PRP+IGF и PRP. Заключение. Биологически активные вещества, содержащиеся в плазме, обогащенной тромбоцитами, индуцируют восстановление мужских половых клеток после экспериментального гипосперматогенеза, вызванного облучением электронами, а рекомбинантный инсулиноподобный фактор роста - 1 усиливает пролиферативную активность мужских гамет
Ключевые слова: сперматогенез, бесплодие, облучение, плазма, обогащенная тромбоцитами.
REHABILITATION OF EXPERIMENTALLY IMPAIRED SPERMATOGENESIS USING PLATELET-RICH PLASMA GROWTH FACTORS
Demyashkin G. A.u, Borovaya T.G.3, Koryakin S. N.2, Vadyukhin M. A.1, Shchekin V. I.12
1I. M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), Moscow, Russia
2Medical Radiological Scientific Center named after A.F. Tsyba - branch of the National Medical Research Center of Radiology, Obninsk, Russia
3National Research Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamalei, Moscow, Russia
SUMMARY
The development of new treatments for male infertility, which would be the most effective and cost-effective in assisted reproductive technologies, remains the subject of scientific research. It is urgent to study the restoration of impaired spermatogenesis using various growth factors and their combinations. The aim of the study was to assess morphological changes in the testes using platelet-rich plasma (PRP) growth factors. Material and methods. Wistar males (n = 135) were divided into 5 groups: I - Control; II, III, IV — locally irradiated with electrons, dose 2 Gy; then the animals of group III were injected with PRP and IGF-1, IV and V were injected with PRP. Results. One week after irradiation, the animals showed impaired spermatogenesis, a gradual recovery of which was observed against the background of the administration of PRP + IGF and PRP. Conclusion. Biologically active substances contained in platelet-rich plasma
induce the restoration of male germ cells after experimental hypospermatogenesis caused by electron irradiation, and recombinant insulin-like growth factor-1 enhances the proliferative activity of male gametes.
Key words: spermatogenesis, infertility, radiation, platelet-rich plasma.
Разработка новых способов лечения мужского бесплодия, которые являлись бы максимально эффективными и экономически выгодными во вспомогательных репродуктивных технологиях, остается предметом научных исследований. Представляет актуальность изучение восстановления нарушенного сперматогенеза с применением различных факторов роста и их комбинаций [1; 2]. Подобные факторы в определенных количествах присутствуют, к примеру, в бедной лейкоцитами плазме, обогащенной тромбоцитами (Leukocyte-poor platelet-rich plasma, LP-PRP) [3; 4]. Некоторые из этих факторов способны повышать качественные и количественные параметры сперматозоидов и, следовательно, - увеличивать шансы позитивного результата экстракорпорального оплодотворения [5]. Одним из ключевых факторов роста тромбоцитов в составе PRP является инсулиноподобный фактор роста-1 (Insuline-like growth factor-1, IGF-1), который запускает процессы пролиферации во многих тканях организма и способен уменьшать активность апоптоза половых клеток, способствуя генерации округлых и удлиненных спер-матид [6; 7].
Цель исследования - оценка морфологических изменений семенников при использовании факторов роста плазмы, обогащенной тромбоцитами, в условии экспериментального бесплодия, вызванного облучением электронами в дозе 2 Гр.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Крысы породы Wistar (n=135) были поделены на группы (условные названия): I-ая - контрольные (n=10), которым вводили физиологический раствор; II-ая, III-я, IV-ая - крысы (n=95), однократное локальное облучение семенников электронами дозой 2 Гр (2IR); крысам III-ей группы в течение 11 недель вводили плазму, содержащую высокую концентрацию тромбоцитов и низкую концентрацию лейкоцитов - LP-PRP в комбинации с рекомбинантным IGF-1, а IV-ой группе (n=30) только LP-PRP; V-ая (n=30) получали LP-PRP. Животных всех групп выводили из эксперимента 1 раз в 2 недели на протяжении 12 недель.
Все манипуляции осуществляли согласно Международным рекомендациям по проведению медико-биологических исследований с использованием животных (ЕЭС, Страсбург, 1985), Европейской конвенции о защите по-
звоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (ЕЭС, Страсбург, 1986), Руководствам по проведению медико-биологических исследований по уходу и использованию лабораторных животных (ILAR, DELS), Правилам лабораторной практики и приказу Минздрава России № 199н от 01.04.2016 «Об утверждении правил лабораторной практики». Исследование было одобрено локальным этическим комитетом ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), протокол № 043 от 11.08.2020 г.
Семенники после фиксации в растворе Буэна готовили по протоколу гистологического исследования. Морфометрический анализ проводили в 10-ти случайно выбранных полях зрения светового микроскопа при увеличении ><400, при этом подсчитывали количество половых клеток с помощью системы видео-микроскопии (микроскоп Leica DM2000) с использованием программного обеспечения Leica Application Suite, Version 4.9.0. Полученные данные обрабатывали с использованием компьютерной программы SPSS 12 for Windows statistical software package (IBM Analytics, США). Сравнение между группами проводили с использованием однофактор-ного дисперсионного анализа ANOVA со значимостью p<0,01.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В семенниках крыс II-ой группы через неделю после облучения наблюдали нарушение гистоархитектоники и признаки гипоспермато-генеза (рис. 1).
На фоне введения LP-PRP обнаружили увеличение количества половых клеток уже на 14 сутки после облучения с постоянной положительной динамикой. В III-ей группе по мере введения LP-PRP в комбинации с IGF-1 отмечали постепенное увеличение численности половых клеток: на 42 сутки сперматогоний - в 12,6 раза, сперматоцитов (в 5,6 раза) и сперматид (в 4,1 раза) по сравнению со II-ой группой (табл. 1).
К концу эксперимента в III-ей и IV-ой группах отмечали количество половых клеток, близкое к показателям контрольной группы, а в просвете семенных канальцев присутствовали сперматозоиды (появились на 56 сутки). Еженедельное введение LP-PRP с IGF-1 (III-я группа) и LP-PRP (IV-ая группа) привели к постепенному увеличению количества половых клеток, причем до-
КРЫМСКИИ ЖУРНАЛ экспериментальной и клиническои медицины
2022, т. 12, № 2
полнительное введение рекомбинантного IGF-1 ускорило процесс восстановления гистоархи-тектоники семенника и увеличения количества половых клеток на 4 недели (табл.1, рис.).
Таким образом, окончательное восстановление сперматогенеза наблюдали к концу эксперимента
(на 84 сутки) в 1У-ой группе и за 4 недели до конца эксперимента в Ш-ей группе (на 56 сутки). Животные У-ой группы после введения LP-PRP на протяжении всего эксперимента не показали достоверных отличий по всем изученным параметрам по сравнению с контрольной группой.
Таблица 1
Количество половых клеток в семенных канальцах при облучении электронами дозой 2 Гр
Группы Сперматогонии Сперматоциты Сперматиды
Контроль 31.2±1.5 123.3±6.1 165.9±8.2
2Ш 7 сутки 22.8±1.1а 83.4±4.0а 134.7±6.6а
2Ж 14 сутки 10.2±0.4а 37.8±1.7а 69.8±3.2а
2Ж 28 сутки 4.3±0.2а 21.1±0.7а 34.1±1.6а
2Ж 42 сутки 2.1±0.1а 15.3±0.6а 28.2±1.2а
2Ж 56 сутки 1.8±0.08а 7.9±0.3а 16.9±0.6а
2Ж 70 сутки 12.2±0.5а 6.1±0.2а 7.1±0.2а
2Ж 84 сутки 16.2±0.6а 9.4±0.4а 4.1±0.2а
2IR+LP-PRP+IGF-1 14 сутки 12.3±0.5Ь 47.1±2.1Ь 93.6±4.0Ь
2IR+LP-PRP+IGF-1 28 сутки 15.7±0.6Ь 63.4±2.4Ь 105.7±4.9Ь
2IR+LP-PRP+IGF-1 42 сутки 26.4±1.2Ь 86.3±4.0Ь 116.8±5.3Ь
2IR+LP-PRP+IGF-1 56 сутки 26.8±1.3Ь 101.5±4.7Ь 137.6±6.6Ь
2IR+LP-PRP+IGF-1 70 сутки 27.0±1.1Ь 104.2±4.9Ь 139.3±6.8Ь
2IR+LP-PRP+IGF-1 84 сутки 28.1±1.3Ь 111.4±5.1Ь 142.1±6.9Ь
2IR+LP-PRP 14 сутки 10.4±0.4с 43.3±2.0с 77.2±3.7с
2IR+LP-PRP 28 сутки 12.1±0.5с 57.7±2.7с 86.8±3.9с
2IR+LP-PRP 42 сутки 15.3±0.6с 69.2±3.2с 94.5±4.1с
2IR+LP-PRP 56 сутки 17.6±0.6с 82.5±3.7с 105.6±4.9с
2IR+LP-PRP 70 сутки 20.6±0.7с 95.7±4.4с 117.8±5.3с
2IR+LP-PRP 84 сутки 24.3±1.0с 103.1±4.8с 129.1±5.4с
LP-PRP 31.3±1.4 124.0±6.1 166.2±8.5
Примечание: ар <0,01 (контроль и 2Ж), Ьр <0,01 (2Ж и 2IR+LP-PRP+IGF), ср <0,01 (2Ж и 2IR+LP-PRP)
Рисунок 1. Микроскопия семенников крыс на 84 сутки эксперимента в группах контроля,облучения (2ГО), 2IR+LP-PRP+IGF-1,
2IR+LP-PRP и LP-PRP. Окраска - гематоксилином и эозином, увелич. *200.
ОБСУЖДЕНИЕ
В качестве улучшения показателей сперматогенеза после облучения электронами животным III-ей и IV-ой групп вводили LP-PRP, механизмы которого не были полностью выяснены, но лабораторные исследования показали, что высокая концентрация факторов роста в LP-PRP потенциально может ускорить процесс восстановления тканей [8]. Согласно имеющимся данным в специализированной литературе, факторы роста а-гранул тромбоцитов играют важную роль в улучшении качественно-количественных характеристик мужских гамет и их микроокружения. Многие из них улучшают пролиферацию, диф-ференцировку и предотвращают апоптоз [3]. В III-ей и IV-ой группах наблюдалось улучшение всех показателей и положительная динамика на протяжении всего эксперимента по сравнению с группой облучения, которые доходили до нормальных значений: увеличивались масса и объем семенников, площадь и диаметр семенных канальцев, количество и светооптическая характеристика половых клеток, высота спер-матогенного эпителия, однако снижался объем интерстициальной ткани. Такие результаты могут быть обусловлены влиянием многих факторов роста и биологически-активных молекул, высвобождающихся из а-гранул тромбоцитов LP-PRP, основными из которых являются фактор роста тромбоцитов (изомеры PDGF-AA, BB и AB), трансформирующий фактор роста-Р (TGF-P), интерлейкин-1 (IL-1), фактор ангиоге-неза тромбоцитов (PDAF), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста эндотелия тромбоцитов (PDEGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF), остеокальцин (Oc) и фибриноген (Ff) [9; 10; 11; 12].
В качестве дополнительного воздействия нами был выбран рекомбинантный IGF-1, который известен как мощный стимулятор пролиферации и дифференцировки во многих тканях, при этом отмечалось улучшение сперматогенеза. В III-ей группе по сравнению с IV-ой группой восстановление сперматогенеза практически до нормальных значений наблюдалось уже на 9 неделе эксперимента. Скорее всего, это было связано с биологическими свойствами IGF-1, который опосредует свои эффекты, главным образом, сигнальными путями митоген-ак-тивируемой протеинкиназы (MAPK/ERK1/2) и фосфоинозитид-3-киназы (PI3K/Akt) [13]. Введение этого фактора роста смогло снизить степень выраженности апоптоза, запускаемого облучением, и стимулировать восстановление стромального компонента семенников.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Биологически активные вещества, содержащиеся в плазме, обогащенной тромбоцитами, индуцируют восстановление мужских половых клеток после экспериментального гипосперма-тогенеза, вызванного облучением электронами дозой 2 Гр, а рекомбинантный инсулиноподоб-ный фактор роста-1 усиливает пролифератив-ную активность мужских гамет.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interest. The authors have no conflict of interests to declare.
ЛИТЕРАТУРА
1. Al-Nasser R., Khrait Z., Jamali S. The Effectiveness of Autologous Platelet-Rich Plasma (PRP) in the Therapy of Infertile Men with Non-Abstractive Azoospermia. J Reprod Med Gynecol Obstet. 2018; 3:11. DOI:10.24966/RMGO-2574/100011
2. Sekerci C. A., Tanidir Y., Sener T. E., Sener G., Cevik O., Yarat A., Alev-Tuzuner B., Cetinel S., Kervancioglu E., Sahan A., Akbal C. Effects of platelet-rich plasma against experimental ischemia/reperfusion injury in rat testis. J Pediatr Urol. 2017; 13(3): 317.e1-317.e9. doi: 10.1016/j. jpurol.2016.12.016.
3. Lubkowska A., Dolegowska B., Banfi G. Growth factor content in PRP and their applicability in medicine. J Biol Regul Homeost Agents. 2012; 26(2):135-225.
4. Bielecki T. M., Gazdzik T. S., Arendt J., Szczepanski T., Krol W., Wielkoszynski T. Antibacterial effect of autologous platelet gel enriched with growth factors and other active substances: an in vitro study. J Bone Joint Surg Br Volume. 2007;89(3):417-20. doi: 10.1302/0301-620X.89B3.18491.
5. Pan Y., Cui Y., Baloch A. R. Insulin-like growth factor I improves yak (Bos grunniens) spermatozoa motility and the oocyte cleavage rate by modulating the expression of Bax and Bcl-2. Theriogenology. 2015; 84(5): 756-762. doi:10.1016/j.theriogenology.2015.05.007
6. Middleton К., Barro V., Muller B., Terada S., Fu F. 2012. Evaluation of the Effects of Platelet-Rich Plasma (PRP) Therapy Involved in the Healing of Sports-Related Soft Tissue Injuries. The Iowa Orthopaedic Journal. 2012;32:63-150.
7. Maria-Angeliki G., Alexandros-Efstratios K., Dimitris R., Konstantinos K. Platelet-rich Plasma as a Potential Treatment for Noncicatricial Alopecias. Int J Trichology. 2015; 7(2): 54-63. doi:10.4103/0974-7753.160098
2022, т. 12, № 2
крымский журнал экспериментальной и клинической медицины
8. International Cellular Medicine Society. Platelet-Rich plasma (PRP) guidelines [Internet]. Las Vegas: International Cellular Medicine Society; 2011. Available from: http:// www.cellmedicinesociety.org/icms-guidelines/ guidelines.
9. Magalon J., Bausset O., Serratrice N.. Giraudo L., Aboudou H., Veran J., Magalon G.. Dignat-Georges F., Sabatier F. Characterization and comparison of 5 platelet-rich plasma preparations in a single donor model. Arthrosc J Arthrosc Relat Surg. 2014;30, 629-638. doi: 10.1016/j. arthro.2014.02.020.
10. Castillo TN, Pouliot MA, Kim HJ, Dragoo JL. Comparison of growth factor and platelet concentration from commercial platelet-rich plasma separation systems. Am J Sports Med. 2011;39:266-271. doi:10.1177/0363546510387517.
11. Laskaj R, Dodig S, Cepelak I, Kuzman I. Superoxide dismutase, copper and zinc concentrations in platelet-rich plasma of pneumonia patients. Ann Clin Biochem. 2009; 46:123-128. doi:10.1258/acb.2008.008178.
12. Appel TR, Potzsch B, Muller J, von Lindern J-J, Berge SJ, Reich RH. Comparison of three different preparations of platelet concentrates for growth factor enrichment. Clin Oral Implants Res. 2002;13:522-528. doi:10.1034/j.1600-0501.2002.130512.x.
13. Ahmad S. S., Ahmad K., Lee E. J., Lee Y. H., Choi I. Implications of Insulin-Like Growth Factor-1 in Skeletal Muscle and Various Diseases. Cells. 2020;9(8):1773. doi: 10.3390/cells9081773.
REFERENCES
1. Al-Nasser R., Khrait Z., Jamali S. The Effectiveness of Autologous Platelet-Rich Plasma (PRP) in the Therapy of Infertile Men with Non-Abstractive Azoospermia. J Reprod Med Gynecol Obstet. 2018; 3:11. D0I:10.24966/RMG0-2574/100011
2. Sekerci C. A., Tanidir Y., Sener T. E., Sener G., Cevik O., Yarat A., Alev-Tuzuner B., Cetinel S., Kervancioglu E., Sahan A., Akbal C. Effects of platelet-rich plasma against experimental ischemia/reperfusion injury in rat testis. J Pediatr Urol. 2017; 13(3): 317.e1-317.e9. doi: 10.1016/j. jpurol.2016.12.016.
3. Lubkowska A., Dolegowska B., Banfi G. Growth factor content in PRP and their applicability in medicine. J Biol Regul Homeost Agents. 2012; 26(2):135-225.
4. Bielecki T. M., Gazdzik T. S., Arendt J., Szczepanski T., Krol W., Wielkoszynski T.
Antibacterial effect of autologous platelet gel enriched with growth factors and other active substances: an in vitro study. J Bone Joint Surg Br Volume. 2007;89(3):417-20. doi: 10.1302/0301-620X.89B3.18491.
5. Pan Y., Cui Y., Baloch A. R. Insulin-like growth factor I improves yak (Bos grunniens) spermatozoa motility and the oocyte cleavage rate by modulating the expression of Bax and Bcl-2. Theriogenology. 2015; 84(5): 756-762. doi:10.1016/j.theriogenology.2015.05.007
6. Middleton K., Barro V., Muller B., Terada S., Fu F. 2012. Evaluation of the Effects of Platelet-Rich Plasma (PRP) Therapy Involved in the Healing of Sports-Related Soft Tissue Injuries. The Iowa Orthopaedic Journal. 2012;32:63-150.
7. Maria-Angeliki G., Alexandros-Efstratios K., Dimitris R., Konstantinos K. Platelet-rich Plasma as a Potential Treatment for Noncicatricial Alopecias. Int J Trichology. 2015; 7(2): 54-63. doi:10.4103/0974-7753.160098
8. International Cellular Medicine Society. Platelet-Rich plasma (PRP) guidelines [Internet]. Las Vegas: International Cellular Medicine Society; 2011. Available from: http:// www.cellmedicinesociety.org/icms-guidelines/ guidelines.
9. Magalon J., Bausset O., Serratrice N.. Giraudo L., Aboudou H., Veran J., Magalon G., Dignat-Georges F., Sabatier F. Characterization and comparison of 5 platelet-rich plasma preparations in a single donor model. Arthrosc J Arthrosc Relat Surg. 2014;30, 629-638. doi: 10.1016/j. arthro.2014.02.020.
10. Castillo TN, Pouliot MA, Kim HJ, Dragoo JL. Comparison of growth factor and platelet concentration from commercial platelet-rich plasma separation systems. Am J Sports Med. 2011;39:266-271. doi:10.1177/0363546510387517.
11. Laskaj R, Dodig S, Cepelak I, Kuzman I. Superoxide dismutase, copper and zinc concentrations in platelet-rich plasma of pneumonia patients. Ann Clin Biochem. 2009; 46:123-128. doi:10.1258/acb.2008.008178.
12. Appel TR, Potzsch B, Muller J, von Lindern J-J, Berge SJ, Reich RH. Comparison of three different preparations of platelet concentrates for growth factor enrichment. Clin Oral Implants Res. 2002;13:522-528. doi:10.1034/j.1600-0501.2002.130512.x.
13. Ahmad S. S., Ahmad K., Lee E. J., Lee Y. H., Choi I. Implications of Insulin-Like Growth Factor-1 in Skeletal Muscle and Various Diseases. Cells. 2020;9(8):1773. doi: 10.3390/cells9081773.
