CC BY
3
УДК 544.72:539.23:577.322:539.26
Фоломешкин М.С., Благов А.Е., Волковский Ю.А., Дьякова Ю.А., Ильина К.Б., Марченкова М.А., Писаревский Ю.В., Просеков П. А., Рогачев А.В., Серегин А.Ю., Ковальчук М.В.
РАЗВИТИЕ РЕНТГЕНОВСКИХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ ПЛАНАРНЫХ БЕЛКОВЫХ СИСТЕМ НА ПОВЕРХНОСТИ ЖИДКОСТИ
Фоломешкин Максим Сергеевич *, младший научный сотрудник, folmaxim@gmail.com
Благов Александр Евгеньевич *, д.ф.-м.н., ведущий научный сотрудник.
Волковский Юрий Андреевич *, младший научный сотрудник.
Дьякова Юлия Алексеевна **, д.ф.-м.н., первый заместитель директора по науке.
Ильина Ксения Борисовна *, к.ф.-м.н., научный сотрудник.
Марченкова Маргарита Александровна *, к.ф.-м.н., старший научный сотрудник.
Писаревский Юрий Владимирович *, д.ф.-м.н., главный научный сотрудник.
Просеков Павел Андреевич *, к.ф.-м.н., старший научный сотрудник.
Рогачев Александр Владимирович **, к.ф.-м.н., инженер-исследователь.
Серегин Алексей Юрьевич *, к.ф.-м.н., научный сотрудник.
Ковальчук Михаил Валентинович *, д.ф.-м.н., профессор, член-корреспондент РАН, руководитель научного направления.
* Институт кристаллографии им. А.В. Шубникова ФНИЦ «Кристаллография и фотоника» РАН, 119333, Москва, Ленинский проспект, д. 59, с. 1.
** НИЦ «Курчатовский институт», 123182, Москва, площадь Академика Курчатова, д. 1.
Представлены результаты исследования структуры ленгмюровских пленок лизоцима на поверхности жидкости, сформированных из кристаллизационных растворов с добавлением в качестве осадителя ряда хлоридов металлов. Развиты методы анализа и обработки экспериментальных данных, получаемых методами рентгеновской рефлектометрии и стоячих рентгеновских волн при исследовании подобных систем. Ключевые слова: рентгеновские методы исследования, ленгмюровские пленки, кристаллизация белков.
DEVELOPMENT OF X-RAY METHODS FOR STUDYING PROTEIN PLANAR SYSTEMS ON LIQUID SURFACE
Folomeshkin M.S., Blagov A.E., Volkovsky Yu.A., Dyakova Yu.A., Ilina K.B., Marchenkova M.A., Pisarevsky Yu.V., Prosekov P.A., Rogachev A.V., Seregin A.Yu., Kovalchuk M.V.
Shubnikov Institute of Crystallography FSRC «Crystallography and photonics» RAS, Moscow, Russian Federation. National Research Centre "Kurchatov Institute", Moscow, 123182, Russian Federation.
Article presents the results of studies ofLangmuir lysozyme thin films on liquid, formedfrom crystallization solutions with addition of metal chlorides asprecipitants. Methods are developedfor analyzing and processing experimental data obtained by X-ray reflectometry and standing X-ray waves techniques in the study of such systems. Keywords: X-ray methods of analysis, Langmuir films, protein crystallization.
Введение
В последние годы все больший интерес вызывает исследование ленгмюровских планарных систем на основе белковых молекул как с точки зрения возможности их применения в качестве функциональных элементов различных
биоэлектронных гибридных устройств, так и с точки зрения исследования процессов взаимодействия молекул белков, в частности процессов кристаллизации.
Хорошо известно, что добавление различных осадителей в кристаллизационные растворы глобулярных белков способствует перераспределению поверхностного заряда молекул белка и изменению межмолекулярного взаимодействия от отталкивания к притяжению. Кроме того, как было показано в серии предыдущих работ [1-5], добавление осадителей приводит к образованию в растворе промежуточной предкристаллизационной фазы - определенных олигомеров белка, служащих кластерами-прекурсорами в процессе дальнейшей кристаллизации. Использование
подобных кристаллизационных растворов при формировании ленгмюровских белковых пленок приводит к изменению их структуры, что открывает новые возможности для исследования особенностей взаимодействия белковых молекул с ионами осадителя и специфики кристаллизации белков [6, 7]. При этом исследование белковых ленгмюровских пленок непосредственно на поверхности жидкости представляют особый интерес, так как позволяют получать информацию о механизмах образования предкристаллизационной фазы в белковых растворах и участии образующихся олигомеров как в процессе кристаллизации, так и при формировании пленки [6].
В настоящей работе представлены результаты исследования структуры ленгмюровских пленок модельного белка лизоцима на поверхности жидкости с одновременным применением методов рентгеновской рефлектометрии (РР) и стоячих рентгеновских волн (СРВ). Исследовали пленки, сформированные из различных кристаллизационных растворов как без
осадителя, так и с добавлением в качестве осадителя ряда хлоридов металлов. Материалы и методы
Использовали белок лизоцим из куриного яйца производства Sigma-Aldrich (CAS № 12650-88-3), KCl (CAS № 7447-40-7, aber GmbH), LiCl (ТУ 6-09-3751-83, Лаверна Стройинжиниринг), NiCl2 (CAS № 7791-20-0, Alta Aesar) и CuCl2 (CAS № 7447-39-4, Acros Organics). Растворы веществ были приготовлены с использованием ультрачистой воды Millipore (сопротивление воды 18 МОм-см). Белок и соли осадителя растворяли в натрий-ацетатном буфере с концентрацией 0.2 М. Растворы солей фильтровали с помощью мембранных шприцевых фильтров Millex с размером пор 0.22 мкм, раствор белка центрифугировали в течение 10 мин с частотой 10000 об./мин.
Пленки белка лизоцима формировали в однобарьерной ленгмюровской ванне размером 36x11.5x0.5 см, поверхностное давление измеряли с использованием весов Вильгельми (использовали фильтрованную бумагу). При формировании пленки скорость сжатия монослоя составляла 23 см2/мин, конечное поверхностное давление сформированных монослоев составляло 10-20 мН/м.
Измерения методами РР и СРВ проводили на станции P08 источника синхротронного излучения (СИ) PETRA III (DESY, Германия) с использованием жидкостного дифрактометра LISA. В эксперименте размер пучка СИ с энергией 18 кэВ составлял около 400 мкм на позиции расположения образцов. Угловые зависимости зеркального отражения регистрировали в диапазоне 0-10 нм-1 с помощью двумерного детектора LAMBDA. При измерениях методом СРВ диапазон измерения зеркального отражения составлял 0-0.3 нм-1, а регистрацию флуоресцентного сигнала осуществляли с помощью энергодисперсионного детектора Amptek PX5.
Для обработки экспериментальных данных применяли модельный подход, основанный на использовании рекуррентных соотношений, схожих с соотношением Парратта [8]. При обработке данных РР использовали модель пленки, в которой плавное распределение электронной плотности по толщине задавали в виде набора функций ошибок, описывающих переходные слои пленка-вакуум, пленка-субфаза. Для модельного профиля распределения электронной плотности вычисляли кривую зеркального отражения. При обработке данных СРВ задавали распределение концентрации иона осадителя по толщине структуры в виде экспоненциально-модифицированной функции Гаусса и в дипольном приближении вычисляли угловые зависимости выхода рентгеновской флуоресценции. Модельные профили распределения электронной плотности и концентрации осадителя уточняли путем минимизации расхождения экспериментальных и расчетных кривых зеркального отражения и выхода рентгеновской флуоресценции. Для реализации нелинейного метода наименьших квадратов применяли алгоритм Левенберга-Марквардта [9]. Результаты и их обсуждение
Были исследованы четыре серии образцов: пленки, сформированные из раствора белка без добавления осадителя и из растворов с добавлением осадителей KCl, NiCl2, CuCl2. В ходе экспериментов была обнаружена слабая чувствительность образцов к изменениям поверхностного давления и высокая воспроизводимость измеряемых кривых, что позволило произвести их усреднение для каждой серии образцов. Также наблюдалась временная стабильность структуры пленок в течение более 1 ч.
На рис. 1 приведены полученные по данным РР профили распределения электронной плотности, а также профили распределения атомов серы по данным, полученным методом СРВ. Кривые выхода флуоресценции атомов серы для всех исследованных образцов были практически идентичны. Атомы серы равномерно распределены внутри молекулы белка лизоцима, поэтому по их распределению можно с высокой точностью определить расположение пленки в окрестности поверхности субфазы. Полученные профили распределения серы во всех образцах показывают, что пиковая электронная плотность пленки приходится именно на молекулы белка, пленка остается стабильной, и белок не тонет в воде. В то же время, точное определение толщины по распределению серы затруднено, так как кривая выхода флуоресценции слабо чувствительна к толщине слоя серы в пределах монослоя.
По приведенным данным РР видно, что при формировании пленки из растворов с добавлением осадителей наблюдается изменение распределения электронной плотности и заметное увеличение толщины пленки. При этом установлена следующая зависимость: толщина пленок, сформированных из растворов с наибольшей концентрацией октамеров [5], также максимальна. Так, толщина пленок с осадителями NiCl2, KCl и CuCl2 оказалась увеличена приблизительно на 75, 56 и 45% соответственно по сравнению с толщиной пленки, сформированной из раствора без осадителя. Такое увеличение толщины при добавлении осадителя может быть объяснено участием в формировании пленки октамеров лизоцима, которые образуются в кристаллизационных растворах. Отметим, что увеличенная приблизительно на 3% электронная плотность и более резкая межфазная граница пленки с осадителем CuCl2 может быть объяснена тем, что тяжелые атомы меди встраиваются в структуру молекулы лизоцима [10].
На рис. 2 представлены полученные по данным метода СРВ профили распределения концентрации ионов осадителей для соответствующих образцов пленок. Видно, что характер распределения осадителей принципиально отличается от распределения атомов серы (рис. 1). Такой характер кривых свидетельствует о том, что ионы осадителя диффундируют в приповерхностную область субфазы. При этом глубина проникновения более тяжелых ионов также оказывается больше. Однако распределение концентрации всех ионов имеет максимум в непосредственной близости от поверхности субфазы, что свидетельствует о том, что пленка белка «удерживает» ионы осадителя.
-4-3-2 -1012 3 4 5 Координата по нормали к поверхности субфазы, им
Рисунок 1. Профили распределения электронной плотности по данным метода РР и профиль распределения концентрации атомов серы по данным метода СРВ.
В результате по различию глубины проникновения ионов с близкой атомной массой можно судить о специфике взаимодействия этих ионов с молекулами белка. Например, более затянутый профиль распределения ионов меди говорит о более слабом взаимодействии по сравнению с ионами никеля, что согласуется с данными о концентрации олигомеров, образующихся в растворах с осадителями СиСЪ и№СЬ. 1.0 г
-С1
0.8
Ц 0.6
s 0.4
в я
0.2
0.0
---К
----Ni
-----Си
-250 -200 -150 -100 -50 0 50 100 Координата по нормали к поверхности субфазы, мкм
Рисунок 2. Профили распределения ионов осадителя для пленок, сформированных из растворов с осадителями KCl, NiCh CuCh.
Заключение
В работе развиты методы анализа и обработки данных, получаемых методами РР и СРВ при исследовании ленгмюровских белковых пленок на поверхности жидкости. С применением развитого подхода на примере модельного белка лизоцима подтверждена гипотеза об участии олигомеров, возникающих в кристаллизационных растворах белков, в качестве структурных элементов формируемых из данных растворов ленгмюровских пленок. Обнаружено, что увеличение толщины пленки пропорционально концентрации олигомеров белка в кристаллизационных растворах по данным проведенных ранее исследований.
Экспериментально показано, что белковая пленка «удерживает» ионы осадителя в приповерхностном слое субфазы, толщина которого зависит от атомной массы иона. По разнице глубин проникновения ионов меди и никеля с приблизительно равной атомной массой
установлено, что осадитель NiCh в большей степени влияет на межмолекулярное взаимодействие мономеров лизоцима при формировании ленгмюровской пленки, что согласуется с результатами проведенных ранее исследований кристаллизационных растворов лизоцима.
Работа выполнена при поддержке Министерства науки и высшего образования РФ в рамках выполнения работ по Государственному заданию ФНИЦ «Кристаллография и фотоника» РАН в части подготовки образцов и проведения экспериментов и в рамках выполнения работ по гранту № 075-15-20211362 в части обработки и анализа результатов.
Список литературы
[1] Kovalchuk M.V. et al. Investigation of the Initial Crystallization Stage in Lysozyme Solutions by Small-Angle X-ray Scattering // Cryst. Growth Design. 2016. V. 16. No. 4. P. 1792. DOI: 10.1021/acs.cgd.5b01662
[2] Boikova A.S. et al. Octamer formation in lysozyme solutions at the initial crystallization stage detected by small-angle neutron scattering // Acta Cryst. D. 2017. 73. P. 591.DOI: 10.1107/S2059798317007422
[3] Kovalchuk M.V. et al. Pre-crystallization phase formation of thermolysin hexamers in solution close to crystallization conditions // J. Biomol. Struct. Dynamics. 2019. V. 37. No. 12. P. 3058.
DOI: 10.1080/07391102.2018.1507839
[4] Marchenkova M.A. et al. Dodecamers derived from the crystal structure were found in the pre-crystallization solution of the transaminase from the thermophilic bacterium Thermobaculum terrenum by small-angle X-ray scattering // J. Biomol. Struct. Dynamics. 2020. V. 38. No. 10. P. 2939. DOI: 10.1080/07391102.2019.1649195
[5] Kordonskaya Y.V. et al. Precipitant ions influence on lysozyme oligomers stability investigated by molecular dynamics simulation at different temperatures // J. Biomol. Struct. Dynamics. 2020. V. 39. No. 18. P. 7223.
DOI: 10.1080/07391102.2020.1803138
[6] Kovalchuk M.V. et al. Structural characteristics of lysozyme Langmuir layers grown on a liquid surface from an oligomeric mixture formed during the early stages of lysozyme crystallization // Thin Solid Films. 2019. V. 677. P. 13. DOI: 10.1016/j.tsf.2019.02.051
[7] Folomeshkin M.S. et al. Octamers participation in the formation of lysozyme ordered layers from crystallization solutions // J. Phys.: Conf. Ser. 2020. V. 1560. P. 012033. DOI: 10.1088/1742-6596/1560/1/012033
[8] Parratt L.G. Surface Studies of Solids by Total Reflection of X-Rays // Phys. Rev. 1954. V. 95. No. 2. P. 359.DOI: 10.1103/PhysRev.95.359
[9] Press W. et al. Numerical Recipes, The Art of Scientific Computing. Cambridge: Cambridge University Press, 2007. 1256 p.
[10] Marchenkova M.A., Kuranova I.P., Timofeev V.I. The binding of precipitant ions in the tetragonal crystals of hen egg white lysozyme // J. Biomol. Struct. Dynamics. 2020. V. 38. № 17. P. 5159.
DOI: 10.1080/07391102.2019.1696706
