Развитие представлений о белках с доменом холодового шока. Перспективы применения в лекарственной терапии Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

развитие представлений о белках

С ДОМЕНОМ хОЛОДОВОГО ШОКА.

перспективы применения в лекарственной терапии

УДК 615

© В. И. Ващенко, В. Н. Вильянинов, П. Д. Шабанов

Военно-медицинская академия им. С. М. Кирова, Санкт-Петербург

Ключевые слова:

белки холодового шока; белки с доменом холодово-го шока; клеточные реакции на холодовой стресс; УБ-1; UNR.

Резюме:_

Белки c доменом холодового шока (ДХШ-белки) обнаружены почти во всех живых организмах и их функции показаны во множестве процессов, которые связаны с посттранскрипционной регуляциией генов. Конфигурация ДХШ-белка — это пространственный изгибв-барреля, который служит, чтобы связывать нуклеиновые кислоты. ДХШ структурно и функционально подобен CspA — белку холодового шока (БХШ) бактерий и гомологичен его первичной последовательности. Этот обзор суммирует современные знания относительно эукариотических белков с доменами ДХШ с акцентом на YB-1 и UNR. Библ. 258 назв.

Библиографическая ссылка:_

Ващенко В. И., Вильянинов В. Н, Шабанов П. Д. Развитие представлений о белках с доменом холодового шока. Перспективы применения в лекарственной терапии // Обзоры по клин. фармакол. и лек. терапии. — 2011. — Т. 9, № 3 — С. 3-30.

ВВЕДЕНИЕ

Во второй половине ХХ века популярным научным направлением среди молекулярных биологов и медиков было изучение реакций бактериальных клеток на шок и стрессовые воздействия. Значительные успехи были достигнуты как в выявлении нового класса белков (белков теплового шока — БТШ), так и их участия в механизмах ответа на стресс различных живых организмов. БТШ представлены в клетках всего живого на Земле, включая археобактерии, а также абсолютно у всех представителей царств рас-

теиий и животных [48, 61]. Этот факт свидетельствует о том, что БТШ являются неотъемлемой частью эволюционного процесса и крайне необходимы для функционирования «белковых машин» клетки, определяющих, в конечном счете, возможность ее существования.

Почти в это же время обнаружили, что при резком понижении температуры среды обитания у бактерий синтезируются особые белки, которые получили название «белки холодового шока — БХШ» (Cold Shock Proteins) [247, 249]. Они, как оказалось, необходимы для адаптации бактерий к росту при низких температурах. Установлено, что БХШ представляют собой белки с очень консервативной аминокислотной последовательностью имеющей около 70 аминокислотных остатков. В дальнейшем БХШ были обнаружены практически во всех живых организмах, включая, и растительные белки, которые подобно бактериальным, способствуют адаптации растений к низким температурам [45, 121].

Небактериальные белки, индуцируемые понижением температуры, имеют значительно больший размер, чем БХШ, поэтому их аминокислотная последовательность высокогомологичная бактериальным БХШ была названа «доменом холодового шока» (Cold Shock Domain, CSD — ДХШ) [229, 241]. Эука-риотические белки с ДХШ обнаружены в митохондриях, ядре и цитозоле и содержат от одного до пяти ДХШ, наряду с другими доменами, различающимися по своему строению у разных представителей эука-риот. Исследованные к настоящему времени ДХШ-белки обладают высоким сродством как к ДНК, так и к РНК и могут связываться с любыми нуклеотидными последовательностями, хотя оказывают определенное предпочтение некоторым специфическим мотивам, преимущественно в составе одноцепочечных участков нуклеиновых кислот [6, 154].

Cчитают, что в силу сродства к одноцепочечным участкам бактериальные БХШ и эукариотические ДХШ-белки существенно понижают температуру

плавления двойных спиралей РНК и ДНК [72, 257] и благодаря этой плавящей способности компенсируют «замораживающее» действие низких температур на вторичную структуру нуклеиновых кислот и возвращают нуклеиновым кислотам тот уровень структурной подвижности, который они имели при оптимальных физиологических температурах [113].

Несмотря на то, что ДХШ-белки широко распространены в живом мире от бактерий до человека, в геномах некоторых организмов гены таких белков не обнаружены [247]. К таким организмам относятся археобактерии. Предполагается, что археобак-териям ДХШ-белки не нужны, поскольку они обычно обитают при высоких и стабильно поддерживаемых температурах. Только в ХХ! веке были обнаружены гены ДХШ-белков у дрожжей Sacchaюmyces cerevisiae. Однако пока неясно, почему такие важные для других организмов гены прямо не участвуют в активации процессов, необходимых для выживания дрожжей.

Функции большинства БХШ и ДХШ-белков пока исследованы мало. Более подробно они изучены у некоторых эукариотических ДХШ-белков таких как YB1 и UNR. Обобщению и анализу данных о ДХШ-белках эукариот, в основном YB-1 и UNR, посвящен данный обзор.

структурные особенности белков холодового шока прокариот

Пространственная структура типичных БХШ бактерий

Первооткрыватели CspA E. coli полагали, что этот белок строго специфичен и поэтому по аналогии с БТШ ему дали название «белок холодового шока» (БХШ), однако позже синтез БХШ обнаружили и при физиологических условиях [39]. В последующем, 27 различных БХШ были обнаружены у E. coli и у других бактерий [5]. Характерной структурной особенностью БХШ (рис. 1) является наличие двух консенсусных мотивов РНП-1 (K/N-G-F/Y-G-F-I/V) и РНП-2 (V-F-V-H-F) [133,247]. Эти участки обогащены ароматическими остатками и необходимы для связывания с нуклеиновыми кислотами. В настоящее время определена пространственная структура для нескольких бактериальных БТШ: для CspA E. coli — методом рентгеноструктурного анализа [206] и ЯМР [175] (рис. 1); для CspB B. subtilis — методом рентгеноструктурного анализа [205] и ЯМР [209]; для Csp B. caldolyticus — методом рентгеноструктурного анализа [168]; для Csp Thermotoga maritime — методом ЯМР [129].

■ Рисунок 1. Пространственная структура БХШ CspA E. Coli [цит. по Newkirk K. et al.,1994, Schindelin H. et al, 1994].

Рамками показаны боковые цепи ароматических аминокислотных остатков, которые входят в состав РНП-1 и РНП-2 мотивов и образуют гидрофобный кластер на поверхности белка

Все известные пространственные структуры бактериальных БХШ очень похожи и состоят из пяти ß-тяжей (рис. 1). Эти ß-тяжи формируют два антипараллельных ß-листа: один ß-лист образован тяжом ß1 (ближайшим к N-концу белка) вместе с тяжами ß2 и ß3, а другой — тяжами ß4 и ß5. Эти два ß-листа в пространстве прилегают друг к другу таким образом, что образуется бочкообразная структура, называемая ß-баррелем. При формировании такой структуры ß-тяжи укладываются по типу «греческого ключа». Хотя структуры различных бактериальных БХШ белков почти совпадают, некоторые отличия между ними все же наблюдаются, в основном, в петлях, соединяющих ß-тяжи, и прежде всего в протяженной петле между ß3 и ß4. Образованная, таким образом, ß-баррель очень компактна. РНП-1 и РНП-2 консенсусы находятся, соответственно, на ß2 и ß3 тяжах и располагаются в пространстве близко друг к другу.

В дальнейшем было установлено, что БХШ имеет укладку, почти совпадающую с доменом S1 бактериального рибосомного белка S1, хотя между ними отсутствует прямая гомология по первичной структуре [42]. Позже негомологичные домены с укладкой, как у S1, были также идентифицированы в полинуклеотидфосфорилазе (ПНФ), факторах инициации трансляции IF1, eIF5A, eIF1A, eIF2a, в дрожжевой РНК-хеликазе PRP22, белке Rrp40 и Rrp44,

в РНКазе Е и ряде других белков. Поэтому все эти домены были объединены в группу, обозначенную как ОВ (oligonucleotide/oligosaccharide binding fold) [42,172]. Основным признаком доменов этой группы является укладка в ß-баррель, состоящий из пяти антипараллельных ß-тяжей. Оказалось, что сходство между ОВ-доменами перечисленных белков не ограничивается сходством только по пространственной структуре.

Домены этой группы белков могут выполнять сходные с БХШ функции и заменять друг друга в некоторых процессах. Например, делеция генов БХШ E. coli, приводящая к нарушению процесса адаптации клеток к росту при низких температурах, может быть супрессирована за счет экспрессии OB домена белка ПНФ [246], а делеция генов БХШ белков B. subtilis, вызывающая нарушения роста и споруля-ции при нормальных температурах, супрессируется за счет дополнительного синтеза фактора инициации трансляции IF1 [240].

Связываясь с ДНК бактерий, БХШ работают как факторы транскрипции и активируют, а иногда подавляют экспрессию большого количества генов, участвующих в клеточном делении и дифференциров-ке, а также кодирующих разнообразные защитные белки [227].

Особенностью пространственной структуры БХШ является также то, что РНП консенсусы обогащены ароматическими остатками, которые в основном располагаются на поверхности белка. У CspA это остатки — Phe18, Phe20, Phe31, His33, Phe34. Они очень консервативны и присутствуют в БХШ не только белков E. coli, но и других бактерий. Эти остатки формируют на поверхности БХШ гидрофобный кластер необычно большого размера ~ 790 А, в то время как в большинстве случаев у других белков он не превышает 350 А [102, 175]. Как правило, расположение гидрофобных аминокислот на поверхности вызывает дестабилизацию структуры белка, однако гидрофобный участок на поверхности БХШ, наоборот, стабилизирует структуру БХШ, а замена ароматических остатков в кластере на другие аминокислоты, как полярные, так и неполярные, снижает общую стабильность БХШ [193, 207].

Роль БхШ при акклиматизации бактерий к пониженным температурам

В настоящее время принято считать, что основным механизмом, способствующим повышению количества БХШ в ответ на понижение температуры является перестройка рибосом и активности мРНК БХШ в трансляции по сравнению с мРНК других белков [70, 103]. Вероятно, это итоговый результат действия нескольких факторов.

Во-первых, 5' НТО мРНК БХШ сама по себе имеет повышенное сродство к бактериальным рибосомам. Было показано, что ее перепроизводство при холодовом шоке может уводить рибосомы из трансляции и препятствовать возобновлению синтеза нешоковых клеточных белков по завершении стадии акклиматизации [113, 246]. Интересно то, что сами рибосомы из клеток, подвергшихся охлаждению, приобретают склонность к преимущественной трансляции мРНК БХШ, хотя по белковому составу они ничем не отличаются от рибосом из обычных клеток [38, 39, 94].

Во-вторых, преимущественная трансляция мРНК БХШ в период акклиматизации к низким температурам может быть результатом действия и других белков, синтезирующихся или модифицирующихся в таких условиях. Например, было показано, что непосредственно сам белок CspA, накапливающийся в начальной стадии периода акклиматизации, стимулирует трансляцию мРНК БХШ [38, 94]. Среди белков, синтезирующихся в период акклиматизации, важную роль играют факторы инициации трансляции IF1, ^2 и IF3, из которых ^3 оказывает наиболее сильный стимулирующий эффект на трансляцию мРНК БХШ [94].

Запуск синтеза БХШ — это только первая стадия сложного процесса акклиматизации бактерий к росту и размножению при низких температурах. Через некоторое время синтез индуцированных БХШ прекращается и параллельно возобновляется синтез обычных клеточных белков. Исследования показали, что выключение синтеза БХШ происходит в результате усиления деградации их мРНК к концу периода акклиматизации. Однако в отличие от деградации мРНК БХШ при 37 °С, происходящей главным образом под действием рибонуклеа-зы Е, в конце периода акклиматизации деградацию этих мРНК осуществляет преимущественно по-линуклеотидфосфорилаза (ПНФ) [174, 247]. Этот фермент катализирует фосфорилизацию мРНК в направлении 3'^ 5' и, наряду с другими РНКазами и РНК-хеликазами, входит в состав деградосомы (мультикомпонентного белкового комплекса), расщепляющего большинство мРНК бактериальной клетки [50]. Фермент ПНФ сам является белком холодового шока, индуцирующимся при понижении температуры [29, 115], но в отличие от большинства других БХШ, максимальный синтез ПНФ наступает только к концу периода акклиматизации [255]. При помощи иммуноблоттинга установили, что содержание белка CspA сильно изменяется в зависимости от фазы роста бактериальной популяции при оптимальной температуре: его уровень максимален на ранней фазе экспоненциального роста.

В этот фазе концентрация белка в клетке составляет около 50 мкМ или ~5 * 105 молекул на клетку и падает до почти недетектируемых количеств в поздней фазе роста бактерий. Подобным образом меняется и концентрация мРНК CspA. Это достигается за счет того, что на ранней фазе экспоненциального роста бактериальной культуры скорость синтеза этой РНК выше, а скорость ее распада ниже, чем в последующий период. Соответственно, уровень индукции CspA при холодовом шоке сильно зависит от фазы роста бактерий, в которой происходит понижение температуры. Для клеток на начальной фазе роста стимуляция синтеза CspA оказалась не такой значительной, как считалось ранее. Гораздо большая индукция CspA наблюдалась в клетках, находившихся в поздней фазе роста культуры. Показано, что прибавление к культуре клеток свежей порции среды ведет к повышению уровня CspA, из чего был сделан вывод, что CspA чувствителен к объему питательных веществ и при их избытке запускается синтез БХШ [39,249]. У B. subtШs все три гена БХШ СspB, СspC и СspD важны для жизнедеятельности клеток как при холодовом шоке, так и при оптимальной температуре роста — удаление двух из этих генов сильно уменьшает скорость роста, а удаление всех трех генов приводит к гибели клеток при любых условиях [91, 92]. Пока мало известно о других

функциях, которые выполняют бактериальные БХШ при оптимальных условиях окружающей среды.

БЕЛКИ ЭУКАРИОТ С ДОМЕНОМ холодового ШОКА

История открытия

Первые эукариотические белки c доменом холодового шока (участок гомологичный БХШ) были обнаружены в начале 80-х годов прошлого века как мажорные компоненты цитоплазматических мРНП в ретикулоцитах кролика [32] и птиц [164, 165]. Молекулярная масса этих белков при SDS-электрофорезе составила около 50 кДа, поэтому позже им дали название р50-белки. Впоследствии обнаружили сходные по молекулярной массе ДХШ-белки в разных типах клеток, включая клетки KB человека [143], HeLa [131], клетки почки [106], асцитной карциномы Эрлиха [256], ооциты Xenopus laevis [57, 80] и некоторые другие [111]. Схематичная структура ряда эукариотических белков с ДХШ или с S1-доменом представлена на рис. 2.

На основании этих данных предположили, что белок р50 в качестве мажорного белка мРНП у позвоночных имеет универсальный характер. В последую-

А

H. sapiens elF5A H. sapiens elFIA H. sapiens elF2A S. cerevisiae Rrp40 A. thaliana GRP2 C. elegans Lin-28 H. sapiens YB-1

*

ran

1111

S. cerevisiae Rrp44 [

H. sapiens UNR | Д Д

• ••|• • • (e

ДХШ Б

S1

КН

С-концевой домен спирализованный домен домен «цинковые пальцы» богатый глицином домен RNB

III PinC

и bfl i

■ Рисунок 2. Эукариотические белки, содержащие ДХШ и S1-домены.

А — схема доменной организации эукариотических ДХШ- и S1-белков. Б — код отдельных доменов и их обозначения

*

щем многими исследователями было установлено, что ДХШ-белки эукариот повышают устойчивость клеток к ионизирующему облучению и ксенобиотикам и выполняют плейотропные функции в ядре и цитоплазме [76, 125]. ДХШ-белки могут также участвовать в процессах репарации, репликации и рекомбинации ДНК, сплайсинге и стабилизации мРНК, а также в других процессах [7]. Они активируют или подавляют транскрипцию и трансляцию многих генов, участвующих в клеточном росте, делении, диф-ференцировке, а также в кодировке различных защитных белков [12, 159].

YB1-белок как типичный представитель ДХШ-белков связывается с предшественниками эука-риотических мРНК в клеточном ядре и принимает участие в их сплайсинге [47, 225]. Этот же белок в цитоплазме упаковывает мРНК в мРНП (информо-сомы) и осуществляет общий позитивный и негативный контроль трансляции мРНК, а также стабилизирует мРНК, защищая ее от экзонуклеаз [6]. На физиологическом уровне, как уже указано выше, бактериальные и растительные ДХШ-белки помогают выживанию организмов при низких температурах окружающей среды. YB1 млекопитающих повышает устойчивость клеток к ультрафиолету и токсическим химическим агентам, повреждающим ДНК [125].

Установлено, что белок YВ-1 присутствует в экстрактах многих опухолевых тканей, в том числе, в карциномах легкого [10, 211], молочной железы [28], простаты [85], толстой кишки [204], а также в меланомах [208]. Определение содержания в тканях (иммуногистохимическим методам) белка YВ-1, выявило возрастание его количества в опухолях по сравнению с нормальными клетками той же ткани. Показано также, что повышение количества YВ-1 в клетках в результате дополнительного синтеза ДНК с введенной плазмидой приводит к онкотранс-формации [30]. С другой стороны, этот белок блокирует онкогенную клеточную трансформацию по фосфатидилинозитол-3-/АЙ-киназному сигнальному пути [21, 22].

В различных опухолях часто наблюдается переход белка в ядро, что рассматривают как негативный прогностический фактор [4, 156].

Эукариотические белки с доменом холодового шока (ДХШ-белки) могут связываться с регулятор-ными последовательностями, включая Y-бокс мотив (инвертированный ССААТ-бокс), расположенными в промоторах и энхансерах различных генов.

ДХШ-белок человека YВ-1 структурно содержит три домена: небольшой А/П-домен на Оконце, богатый аланином и пролином, высококонсервативный домен холодового шока (ДХШ) [7, 8] и протяженный С-концевой домен, состоящий из чередующихся

кластеров положительно и отрицательно заряженных остатков с размером каждого кластера в 25-30 остатков (рис. 4). ДХШ YB-1 почти идентичен по аминокислотной последовательности ДХШ других белков эукариот.

Большинство обнаруженных к настоящему времени ДХШ-белков эукариот имеет сходный тип строения и высокую степень гомологии с белком YB-1 человека. Многие из ДХШ-белков были обнаружены как мажорные компоненты цитоплазматиче-ских мРНП соответствующих организмов. Следовательно, эти белки можно объединить в одну группу YB-1 подобных белков, исходя из их структурно-функционального сходства [149]. Хотя белок FRGY2 и FRGY1 не имеет столь высокой степени гомологии с YB-1, как остальные белки этой группы, их вполне можно отнести к YB-1 подобным белкам на основании сходной доменной организации и близости выполняемых функций. Основные функции ДХШ-белков перечислены в таблице 1, причем этот список непрерывно пополняется как за счет описания новых членов этого семейства, так и нахождения новых функциональных свойств в уже известных белках.

Показано, например, что FRGY2 упаковывает мРНК в ооцитах в компактный РНП-комплекс, который ингибирует трансляцию и стабилизирует мРНК, а белок FRGY1 появляется в раннем эмбриональном развитии на стадии гаструлы [155, 170, 242]. Подобно YB-1, ДХШ FRGY2 не требуется для ингибирова-ния трансляции [153], но необходим для распознавания РНК [37].

Эукариотические ДХШ-белки являются многофункциональными. Помимо упаковки мРНК в цитоплазме, к настоящему времени установлено их участие в ряде как ДНК-зависимых (репликация, репарация и транскрипция), так и РНК-зависимых процессах (сплайсинг, редактирование, трансляция и деградация мРНК) [74, 154]. Многоуровневые взаимосвязи биохимических функций ДХШ-белков эукариот представлены в модели Аль-Фади и Смайла [12] (рис. 3).

Структурная организаци ДхШ-белка YB-1

Подробная пространственная структура ДХШ-белка YB-1 человека впервые была установлена методом ЯМР [Kloks C. P. et al., 2002] (рис. 4).

Как было установлено, исходя из высокой степени гомологии (~45% идентичности белку CspA E. coli), пространственная структура ДХШ YB-1 очень сходна с пространственной структурой главных белков холодового шока бактерий. Как и у бактериальных БХШ, пространственное расположение ароматических аминокислотных остатков консенсусов YB-1 позволяет им участвовать в связывании

■ Таблица 1. Эукариотические белки, содержащие ДХШ и S1 домены

Название(другое название) Функции Участие в клеточных процессах Источник информации

YB-1 (DbpB, YBX1, p50, FRGY1, Yps, DjY1)a Регуляция транскрипции, сплайсинга, трансляции и стабилизации мРНК, репарация ДНК Пролиферация, дифференци-ровка [8,32,145,214,224]

UNR (CSDE1) Регуляция трансляции по механизму внутренней посадки рибосомы и стабилизации мРНК Апоптоз, дозовая компенсация Х-хромосомы, клеточный цыкл [105,183]

FRGY1 (YB-1, contrin, MSY1) Регуляция транскрипции Созревание клеток на стадии гаструлы [46,228]

FRGY2 (YB-2, contrin, MSY2, DbpC) Регуляция транскрипции, трансляции и стабилизации мРНК, времени жизни мРНК Созревание зародышевых клеток [36,88,97,228,253]

Ct-p40/p50 Упаковка пре-мРНК в ядре и мРНК в цитоплазме Пролиферация [221]

RYB-a Регуляция транскрипции Пролиферация [108,109]

CSDA (DbpA, ZONAB) Регуляция транскрипции Пролиферация, дифференци-ровка [24,25,141]

Lin-28 Регуляция биогенеза и трансляции микроРНК Пролиферация, программирование стволовых клеток, биологические часы клетки [99,166,167,195, 245]

eIF1A Инициация трансляции Развитие клетки [78,254]

eIF2a Инициация трансляции Реакция на стресс, взаимодействие с РНК-зависимой про-теинкиназой РКЯ [56,65]

eIF5A Элонгация трансляции Жизнеспособность клетки, пролиферация [31,201,211]

Rrp44 (Dis3) Деградация РНК Жизнеспособность клетки [144,237]

Rrp40 Деградация РНК [178]

Prp22 пре-мРНК сплайсинг Рост и развитие клетки [81]

GRP2 (AtCSP2) РНК шаперон Созревание и развитие клетки, ответ на холодовой стресс [195]

a Название белка, обозначающее видовые различия: YB-1 (человека), p50 (кролик), FRGY1 (лягушка), Yps (Ypsilon Schachtel, дрозофила), DjY1 (Dugesia japonica Y1, планария). YB-1 родственный специфическим зародышевым клеткам Y-box-белкам: YB-2 (человек), MSY2 (мышь), FRGY1 и FRGY2 (лягушка)

нуклеиновых кислот. Так как ДХШ YB-1 почти полностью идентичен по аминокислотной последовательности ДХШ другим белкам эукариот, то это означает, что ДХШ этих белков имеют, по-видимому, такую же пространственную структуру, как и домен холодного шока белка YB-1. Установлено, что их домены также состоят из пяти р-тяжей, уложенных антипарал-лельно в р-баррель. Как и у прокариотических белков, в ДХШ белка YB-1 имеется два консенсусных мотива — РНП-1 и РНП-2, которые, соответственно, находятся на р2 и р3-тяжах (рис. 4Б). Однако, хотя структура доменов ДХШ эукариот и прокариот очень сходна, некоторое отличие есть, оно заключается в более протяженной петле, соединяющей р3 и р4-тяжи белка YB-1.

Аминокислотная последовательность YB-1 содержит 324 аминокислотных остатка и состоит из трех доменов. На Оконце находится небольшой домен, богатый аланином и пролином ^-домен), далее идет

домен холодового шока (ДХШ), а за ним — протяженный С-концевой домен (С-домен), состоящий из чередующихся кластеров положительно и отрицательно заряженных аминокислотных остатков, с размером каждого кластера примерно в 25-30 остатков (рис. 4А). Для этого белка характерна очень высокая изо-электрическая точка, около 10, молекулярная масса около 35-36 кДа и аномальная электрофоретическая подвижность, соответствующая размеру белка около 50 кДа. Он способен полимеризоваться с образованием крупных гомоолигомерных комплексов с молекулярной массой от 150 до 800 кДа [72, 82]. ^домен содержит участки связывания актина [194], фактора сплайсинга SRp30c [187] и фактора транскрипции р53 [180]. Как упоминалось ранее, ДХШ способен как специфично, так и неспецифично связываться с ДНК [229] и РНК [37, 132].

С-домен связывает РНК неспецифически, усиливая взаимодействие ДХШ с нуклеиновой кислотой

■ Рисунок 3. Модель регуляции ДХШ-белками клеточных процессов млекопитающих [цит. по Al-Fagee M. B. and Smales C. M., 2006 c изменениями]

и, таким образом, обеспечивает гомоолигомери-зацию белка [37, 171, 229]. В С-домене содержатся также участки связывания некоторых важных регу-ляторных белков, таких как белок К [214], p53 [160] и IRP-2, который участвует в регуляции трансляции ферритиновой мРНК [19, 43].

С-концевой домен и ДХШ совместно формируют участки связывания фактора транскрипции Pura и T-антигена полиомавируса JC [198], а также фактора транскрипции вируса HIV-1 Tat [17].

Свойства С-домена YB-1

Как уже отмечалось, характерной особенностью С-концевого домена является присутствие в нем чередующихся кластеров положительно и отрицательно заряженных аминокислотных остатков (по четыре кластера каждого знака) и высокое содержание пролиновых остатков. Поэтому аномальную электрофоретическую подвижность YB-1 свя-

зывают с наличием этих заряженных кластеров в С-домене [62, 74]. ^концевой домен значительно менее консервативен в эволюции, чем ДХШ. Сложности в определении пространственной структуры ^домена связаны с тем, что у белка YB-1 в мономерной форме этот домен, по всей вероятности, является подвижным и не имеет стабильной уникальной укладки. Его конформация, скорее всего, фиксируется только при связывании лигандов и может быть различной в комплексе с разными ли-гандами [153]. Компьютерные программы предсказывают отсутствие в ^домене протяженных а- и р-элементов вторичной структуры и наиболее вероятную укладку домена в виде вытянутой поли ^-пролиновой) спирали II типа [150]. Как было упомянуто выше, ^домен участвует в гомоолигомери-зации YB-1 [229]. Было высказано предположение, что олигомеризация происходит в результате взаимодействия положительно и отрицательно заря-

С-концевой домен

N-концевои домен i

взаимодеиствие

связь с ДНК С фактором вРрзос связь с РНК специфической последовательностью стабилизация мРНК связь с другими белками

с актином

с фактором з53

324

связь с одноточечными

ДНК и РНК блокирование трансляции связывание внутри мРНК связь с другими белками гомоолигомеризация

Пространственная структура YB-1

[цит. по Kloks С. Р. et al., 2002].

полоса 2 — РНП-1 мотив (Gly-Tyr-Gly-Phe-Ile)

полоса 3 — РНП-2 мотив (Val-Phe-Val-His)

■ Рисунок 4. Пространственная структура (Б) и схема расположения доменов вдоль полипептидной цепи (А) основного мажорного УВ-1 белка мРНК млекопитающих

женных кластеров этого домена на одной молекуле с противоположно заряженными кластерами этого же домена на других молекулах [182].

Структура гена YB-1 и его гомологов у высших эуеариот

Подробная структура генов ДХШ-белков позвоночных изучена только для двух представителей этого семейства — YB-1 и dbpA человека [130,148,234]. В обоих случаях гены содержат большое число ин-тронов. Ген белка dbpA, размером 24 kb, имеет 10 экзонов, ген YB-1, размером 19 kb — 8 экзонов. При этом, небольшой ДХШ в этих белках закодирован в нескольких экзонах: в пяти (с первого по пятый) у YB-1 и в четырех (со второго по пятый) у dbpA. В промоторах указанных генов отсутствуют наиболее характерные регуляторные последовательности ТАТА и CCAAT. Вместо этого, в промоторе гена YB-1 присутствует несколько Е-боксов, а в начале первого экзона содержится много ^-повторов, а также GATA-мотивы, и этот участок первого экзона необходим для транскрипции гена. Пока надежно не установлено, какие именно факторы могут связываться с промотором гена YB-1 и регулировать его активность, хотя есть сообщения, что с Е-боксом может связываться белок c-Myc [237], а с GATA мотивами — транскрипционные факторы GATA-1 и GATA-2, необходимые для развития клеток эритроидного ряда [251].

Подавление синтеза белка YВ-1 у нокаутированных мышей приводит к их постнатальной гибели, хотя эмбриональное развитие проходило нормально [22, 146].

Предполагают также, что белок YВ-1 может служить в качестве потенциальной мишени при терапии

многих злокачественных новообразований [84, 125, 208, 258]. Сверхэкспрессия YB-1 коррелировала с агрессивностью рака и индукцией эпителиально-мезенхимального перехода, процессов, естественно происходящих во время эмбрионального развития, но помогала прогрессии рака, индуцированного во взрослых клетках. Трансляционная стимуляция фактора транскрипции при помощи YB-1, так же как репрессия трансляции промотирующего рост фактора, промотирует EMT и формирование метастазов, показывая значение YB-1 при болезни [77].

Почти все ДХШ-белки содержат, как правило, одну копию ДХШ. Исключение составляет белок млекопитающих UNR (upstream N-ras). Этот белок образован пятью ДХШ довольно сильно различающимися по своей аминокислотной последовательности и не содержит других активных доменов [65].

структурная организация и свойства

ДхШ-БЕЛКА UNR

Белок UNR был открыт в 1990 г. и получил свое название от необычной позиции гена в пределах генома, поскольку ген этого белка расположен на расстоянии в 150 пар оснований от местоположения гена N-ras, обнаруженного, как известно, во многих видах эукариот [114]. Поскольку эти два тандемные гена расположены в той же самой транскрипционной области, то было предположено, что изменение транскрипции гена UNR могло бы объяснить при определенных обстоятельствах регулирование N-ras.

Однако делеция промотора UNR оказывала очень слабый эффект на экспрессию N-ras, [34];

■ Рисунок 5. Пространственная структура UNR-белка и OB-содержащих белков.

Левая часть — рисунок типичных изгибов ОВ-домена [цит. по Arcus V. 2002 с дополнениями Theobald et al.,2003]. Пять ß-полос обозначены какßl, ß2, ß3, ß4 иß5. Правая часть — структура ДХШ1 домена UNR. Стрелками указаны участки связывания SXL с msl-2 мРНК дрозофилы [цит. по Abaza 1., Gebauer F., 2008]

приводя доводы против регулирующей активности на основании этой частной геномной организации. Unr — ключевой ген, так как было показано, что unr-дефектные мыши умирают приблизительно на 10-й день эмбрионального развития [114].

Его белковый продукт адекватно производится рибосомами и прежде всего локализуется в цитоплазме, или в свободной форме, или связанный с мембранами, особенно с эндоплазматическим ре-тикулумом [110]. Это распределение совместимо с основной функцией UNR как регулятора трансляции. Небольшая фракция UNR также обнаружена в ядре, хотя роль UNR в нем остается неясной [79, 183].

Структура белка UNR

Белок UNR уникален среди семейства ДХШ-белков эукариот, так как содержит пять доменов ДХШ [65] (рис. 2). UNR дрозофилы, кроме того, содержит две богатые глутамином области с неизвестными функциями. Белок имеет высокую степень консервативности среди высших эукариот и отсутствует в дрожжах и C. elegans. Эта консервативность увеличивается в пределах ДХШ, особенно в ДХШ1, который демонстрирует самую высокую гомологию с бактериальными БХШ (рис. 5).

Как и у других ДХШ-белков в UNR есть функция связывания с нуклеиновыми кислотами. При этом, UNR оказывает предпочтение неспирализованным одноцепочечным ДНК и РНК [79, 110]. Эксперименты по методу селекция/амплификация (SELEX) in vitro при использовании белка UNR человека позволили установить участки связывания с консенсусной

последовательностью, состоящей из AAGUA/G или AACG, следовавшие на протяжении 1 кДа и область, обогащенную пуринами, с которыми UNR образует связь длиной в 10 нм [235]. В этих экспериментах, специфичная последовательность первого ДХШ (ДХШ1) была аналогична по всей длине белка, и только немного избыточности наблюдалось между другими ДХШ при связывании. С другой стороны, этой избыточности не наблюдалось при опытах с субстратами обычных UNR. Показано, что для того чтобы связаться с риновирусом человека необходимы все ДХШ UNR, а также участок внутренней посадки рибосомы (Internal Ribosome Entry Site — IRES) [41, 98]. Только ДХШ1 связываются с msl-2 мРНК, а не остальные 4 ДХШ [14]. Результаты указанных экспериментов высвечивают гибкость UNR в распознавании мишени и подразумевают широкий набор мишеней для UNR, потенциально предназначенных каждому ДХШ. Перечень уже известных мишеней и последовательностей узнавания UNR дан в таблице 2.

В дополнение к отдельным ДХШ, требуемым для привязывания UNR к их субстратам, уровень аффинитета связи также играет важную роль. UNR может распознать РНК как мишень или отдельно, или для этого требуются дополнительные факторы для упрочнения связи. Это условие является базовым для отдельных функций UNR дрозофилы, в частности, для половой специфичности, поскольку она позволяет UNR распознать соответствующие мишени в присутствии специфичных для пола кофакторов. По сравнению с РНК-связыванием, относительно немного известно о непосредственном связывании

■ Таблица 2. РНК-сайты для связывания UNR

мРНК Связующий сайта Последовательность Источник

PITSLRE киназа (транскрипт p58) IRES (нпб от 380 до 1) Богатая пуринами с основным мотивом ААГУА [66]

Apaf-1 IRES (нп от 233 до 1) Богатая пуринами с разветвленной петлеобразной структурой [71]

c-fos ORF (нп от 397 до 484, mCRD) Богатая пуринами [83]

HRV-2 IRES (нп от 509 до _435 и от 172 до 1) Не определена [16]

c-Myc IRES (нп от 396 до 1) Не определена [33]

PABP 5'-НТО (нп от 432 до 372, ARS) 4 олиго(А) разделенные пуриновыми участками размером 3-6 нп [26]

PTH 3'-НТО (нп от 594 до 656) Не определена [64]

UNR IRES (нп от 447 до 186) Не определена [13]

UNR msl-2 3'-НТО (нп от 3231 до 3276) Две олиго(У) вставки в богатой пуринами последовательности [163]

SELEX Не определен Мотивы ААвиА/Г или ААСв на протяжении всей пуринбога-той последовательности [111]

a — Позиция 1 является первым основанием открытой рамки считывания (ОРС); нпб — местоположение сайта

ДХШ с ДНК. Исследуя ДХШ1, показали его контакт с Sex-lethal (SXL) участком, в то время как ДХШ2 связывается с фактором ALL-1 хроматина [14, 137]. UNR был обнаружен также в нескольких других комплексах, принимающих участие в регуляции трансляции или стабильности мРНК, однако домены UNR, необходимые для формирования этих сложных комплексов не были определены.

Регуляция экспрессии UNR

В настоящее время предложено несколько посттранскрипционных регулирующих механизмов для регуляции экспрессии unr [14]. Было обнаружено три оригинальных транскрипта unr, альтернативные полиадениляции, в большинстве тканей млекопитающих, а также в эмбрионе дрозофилы [13, 114]. Кроме того, альтернативным сплайсингом внутреннего экзона установлены две изоформы UNR отличающиеся по 31 аминокислоте [33]. Возможно, что зарегистрированные, таким образом, формы UNR регулируют то, что происходит на уровне трансляции. Транскрипты UNR млекопитающих содержат IRES в 5НТО, чья активность регулируется полипиримидин-тракт-связанным белком (ПТБ) [54, 66]. Следует отметить, что активность IRES UNR также непосредственно регулируется при помощи самого UNR, образуя авторегулирующий негативный цикл, который способствует уравновешиванию уровней UNR в клетке [66]. Такое регулирование весьма вероятно потому, что UNR оказывает противоположные эффекты на трансляцию в зависимости от его количества по отношению к другим регуляторам [14, 41]. Активность IRES UNR стимулируется C1/C2 hnPHK ядерным белком, который перемещается в цитоплазму во время митоза и разрушает связь ПТБ и UNR, способствуя таким образом увеличению уровня UNR, что и наблюдается в этой фазе клеточного цикла [203].

Другие функции UNR

Как упоминалось выше, UNR был обнаружен в комплексах, участвующих в регулировании трансляции и стабилизации мРНК. В процессе трансляции UNR ведет себя как IRES, трансактивный фактор (ITAF), который регулирует активность нескольких вирусных и клеточных IRES в дополнение к его собственному. Они включают транскрипты IRES, кодирующие протоонкоген c-Myc [71], проапоптозный фактор Apaf-1 [162], PITSLRE киназу клеточного цикла [233], HRV [64] и полиомавирус [35]. Для нескольких из них (Apaf-1, UNR, HRV), UNR действует вместе с ПТБ, хотя эти два белка, как было продемонстрировано в экспериментах, не взаимодействовали. По крайней мере, в случае Apaf-1 IRES, кооперация между UNR и нейронной изоформой ПТБ (нПТБ) опосредована через взаимодействие с РНК. Связывание UNR с определенной областью этого IRES изменяет структуру РНК и учитывает связь нПТБ. В последующем конформационные перестройки обоих белков позволяют маленькой рибосомной субчастице распознавать IRES, тем самым стимулируя трансляцию [163].

Кроме описанных свойств, UNR регулирует функции РНК-шаперона при помощи усиления связи с РНК или путем диссоциации от трех шаперонов. Другим белком, который часто связывается c UNR, чтобы отрегулировать IRES-зависимую трансляцию является Unrip белок (UNR-взаимодействующий белок). Точная функция Unrip в трансляции пока не установлена [71,105]. Наряду с IRES-зависимой трансляцией, UNR регулирует кеп-зависимую трансляцию при помощи msl-2 мРНК. Установлено, что UNR не блокирует msl-2 трансляцию у мужчин.

Было показано, что три критических остатка в ДХШ1 UNR требуются для связывания SXL с msl-2 мРНК (рис. 1 и 3), но оказалось, что ДХШ1 не достаточно для блокирования трансляции, из чего

следует, что и другие домены принимают участие при помощи соответствующего дополнительного контактирующего фактора [14]. Этот транскрипт кодирует лимитирующий компонент комплекса до-зовой компенсации дрозофилы (КДК), который увеличивает транскрипцию одной части Х-хромосомы до примерно двукратного, чтобы уровнять уровни Х-зависимых генов, которые представлены у женщин как XX. Блокирование msl-2 трансляции у женщин приводит к ингибированию КДК и является основным для жизнеспособности мужчин [26, 122]. Специфический блок у женщин достигается при связывании SXL, специфического для женщин белка, с участками транскриптов в обоих НТО [83]. В последующем SXL привязывает UNR к 3'-НТО, как необходимый шаг для блокирования трансляции [13, 68, 105].

В недавней публикации сообщено, что одним из таких контактирующих факторов является РАВР [69]. Механизм, при помощи которого РАВР вовлекает UNR для воздействия на msl-2 трансляцию, как установлено, является ядерным, однако в нем участвует этап регуляции при формировании кеп-связывающего комплекса с мРНК [69]. Таким образом, UNR и РАВР являются общими партнерами в регуляции экспрессии мРНК. РАВР сам стимулирует привязывание UNR к 5-НТО к его собственному транскрипту, создавая отрицательную авторегули-рующую петлю [183]. Следовательно, взаимодействие между РАВР и UNR важно для регуляции стабильности с-^ мРНК [68, 83]. Поэтому транскрипт с-^ деградирован в UNR-зависимой трансляции у мужчин.

Установлено, что UNR и РАВР привязываются как составные части к большому комплексу mCRD (детерминанта нестабильности главной кодирующей области), расположенному в с-^ ОРС, при этом UNR также входит в контакт с деаденилазой CCR4. Однако во время трансляции перемещение рибосомы приводит к разрушению комплекса и открывает доступ CCR4 к поли(А) участку, приводя к деадени-ляции и деградации мРНК.

Природа многих из известных мишеней UNR (с-Мус, с-^, PITSLRE киназа, АраМ) и факт, что экспрессия UNR регулируется в течение клеточного цикла, подразумевают участие UNR в контроле клеточной пролиферации и жизнеспособности клетки.

Эмбриональная смертность ипг-дефектных мышей и факт, что UNR-дефицитные клетки ES растут нормально, позволили сделать предположение, что UNR затрагивает клеточную пролиферацию специфическим для типа клетки способом. По крайней мере при апоптозе такие специфические для типа клеток эффекты UNR были зарегистрированы [67].

Эти эффекты можно было отменить точечной мутацией в РНП-1 ДХШ1, которая устраняет связывание РНК, что предполагает, что целевой функцией UNR при апоптозе является непосредственная регуляция экспрессии мишеней мРНК.

В эксперименте продемонстрировано, что UNR осуществляет свои функции в ядре, вероятнее всего, промотируя связывание КДК с Х-хромосомой у самцов дрозофилы [183]. Молекулярный механизм этого эффекта неизвестен; однако, можно предположить определенную роль в этом процессе наличия способности UNR связываться с РНК-НТО КДК.

В целом, имеющиеся в настоящее время данные предполагают потенциальную возможность при помощи всех пяти ДХШ связываться с различными РНК и регуляторными факторами, что и лежит в основе разнообразных биологических функций UNR-белка.

взаимодействие дхш-белков С РНК

В ряде работ было установлено, что белки YB-1 и его ближайшие гомологи могут взаимодействовать с любыми последовательностями РНК, хотя и отмечено некоторое предпочтение к участкам с определенным составом и сочетанием нуклеотидов [86, 151, 161, 186]. Связывание YB-1 с РНК характеризуется высокой константой ассоциации ~1-2,5 х 108 M-1 [161, 171, 254]. YB-1 и его гомологи гораздо лучше связываются с РНК в одноцепочечной форме [151]. При неспецифическом связывании белки образуют почти исключительно контакты с сахарофосфатным остовом РНК [186]. Специфический участок для связывания с РНК был первоначально идентифицирован для белков FRGY1 и FRGY2^56 Xenopus laevis с помощью метода SELEX [37]. Этот участок, названный YRS (FRGY recognized sequence), имеет последовательность AACAUC. Его присутствие в РНК повышает константу ассоциации РНК с FRGY2 в несколько раз. Вставка мотива YRS в репортерную мРНК приводит к усилению ингибирования ее трансляции белком FRGY2 в ооцитах Xenopus [153]. Позже были выявлены участки специфического связывания с РНК трех других членов семейства ДХШ-белков: UNR [235], MSY4 [55] и p50 [204]. Вероятно, на специфичность взаимодействия этих белков с РНК в клетке могут оказывать влияние их ковалентные модификации, а также связывание с другими белками. Два домена YB-1 и его гомологов, ДХШ и С-домен, проявляют РНК-связывающую активность [37, 132, 171]. ДХШ взаимодействует с РНК, по-видимому, с помощью аминокислотных остатков в мотивах РНП-1 и РНП-2 [92, 219]. Применение метода сайт-направленного

мутагенеза показало, что ароматические остатки в РНП-1 действительно очень важны для связывания с РНК [37, 153]. Участки в С-домене, связывающиеся с РНК, пока неизвестны, но, вероятно, они находятся в положительно заряженных кластерах с очень высоким содержанием аргинина. Было показано, что для специфического связывания белка лягушки FRGY2 с РНК необходим ДХШ, хотя С-домен, а также N-концевой А/П-домен значительно стабилизируют эту связь [37]. Сродство к РНК двух РНК-связывающих доменов белка FRGY2 по-разному меняется в ответ на изменение концентрации Mg2+ и гепарина [132]. Повышение концентрации Mg2+ подавляет связывание с РНК ДХШ, а повышение концентрации гепарина — связывание С-домена. Это позволяет предположить, что природа сил, обеспечивающих взаимодействие с РНК двух доменов, различается. В комплексах кроличьего р50 с мРНК, образованных при небольших молярных соотношениях белок/РНК, характерных для транслируемых полисомных мРНП, оба РНК-связывающих домена р50, ДХШ и С-домен, способны эффективно связываться с мРНК. Однако в неактивных в трансляции комплексах мРНК с р50 с высоким содержанием белка он связан с мРНК преимущественно доменом ДХШ, тогда как С-домен вытесняется из комплекса с РНК и олигомеризуется [8].

Белок р50 кролика способен значительно изменять вторичную структуру РНК. Подобно CspA E. coli, р50 может плавить до 60 % вторичной структуры глобино-вой РНК при физиологической температуре [72,215]. Но, кроме того, он способен при тех же условиях на три порядка ускорять образование дуплексов между взаимокомплементарными цепями РНК, т. е. ускорять их отжиг. Наконец, при физиологических условиях он может катализировать обмен комплементарных цепей РНК до получения наиболее протяженного и совершенного дуплекса. Оказалось, что соотношение между РНК-плавящей и РНК-отжигающей активностью р50 зависит от соотношения р50/РНК в комплексе: в ненасыщенных белком комплексах преобладает РНК-отжигающая, тогда как в насыщенных — РНК-плавящая активность [215].

YB-1 и его ближайшие гомологи присоединяются к мРНК еще во время транскрипции и сопровождают ее на всех этапах жизнедеятельности, вплоть до распада в цитоплазме [218, 221, 244]. К настоящему моменту четко установлено участие этих белков в трех процессах, зависимых от мРНК: в процессинге, в трансляции и стабилизации мРНК.

ДхШ-белки в процессинге мРНК

Установлено, что YB-1 принимает участие в процессах сплайсинга, включая альтернативный сплай-

синг [47, 225]. При этом показано, что YB-1 может присоединяться к транскрипционному комплексу за счет взаимодействия с протоонкобелком TLS [47, 191]. TLS входит в состав транскрипционного комплекса и обеспечивает сопряжение процессов транскрипции и сплайсинга путем одновременного взаимодействия с РНК-полимеразой II и факторами сплайсинга. Захватывая YB-1 в этот комплекс, TLS способствует его вовлечению в последующий сплайсинг мРНК. При некоторых злокачественных опухолях С-концевой домен TLS, взаимодействующий с YB-1, заменяется в результате генетических перестроек на последовательности факторов транскрипции CHOP (C/EBP) или ERG. Это приводит к подавлению связывания YB-1 с РНК-полимеразным комплексом и блокирует участие YB-1 в сплайсинге отдельных ядерных РНК [191]. На каких стадиях самой реакции сплайсинга участвует YB-1, точно неизвестно. Предполагают, что он действует посредством связывания с факторами сплайсинга, такими как SRp30c и SRrp86 [139, 188]. ДХШ-белки участвуют в процессинге мРНК не только в ядре, но и в митохондриях. Например, небольшой белок с доменом холодового шока RBP16 в митохондриях простейшего Trypanosoma brucei проявляет повышенное сродство к гидовой РНК (guide RNA) и способен стимулировать ее активность в редактировании некоторых мРНК, которая заключается в удалении или вставке уридиловых нуклеотидов [97, 185]. Выключение синтеза этого белка приводит к накоплению неотредак-тированных предшественников мРНК.

ДхШ-белки в регуляции трансляции мРНК

Белки YB-1 — р56/FRGY2 из Xenopus и его вариант р54 с укороченным С-концом являются основными упаковочными белками мРНК, накапливающимися при созревании ооцитов [57, 169, 170]. Сделали вывод, что эти белки отвечают и за репрессию мРНК в ооцитах до их оплодотворения. В пользу этого предположения можно привести следующие аргументы. Вовлечение зарезервированных мРНК в трансляцию сразу после оплодотворения сопровождается дефосфорилированием р54/р56 и диссоциацией их из комплексов с мРНК [123, 217]. Дальнейшая активация процесса трансляции в раннем эмбриогенезе происходит при постепенном снижении количества р54/р56 и заменой их на соматический белок — FRGY1 [46, 242]. В экспериментах in vitro и in vivo показано, что р54/р56 ингибирует трансляцию мРНК [36, 123, 153, 190, 192].

Установлено, что р50 в ретикулоцитах кролика является мажорным белком как нетранслируемых (свободных), так и транслируемых (полисомных) мРНП. Однако содержание этого белка в пересчете

транслируемых мРНП на то же количество полисом-ных мРНК вдвое ниже, чем в свободных [160]. р50 из ретикулоцитов кролика способен ингибировать процесс трансляции как в бесклеточных системах [160, 173], так и в культуре клеток млекопитающих [58]. р50 in vitro избирательно подавляет процесс трансляции некэпированных мРНК при более низких концентрациях, чем кэпированных мРНК [226]. Предполагается, что р50 может обеспечить селективное выключение трансляции тех мРНК, которые вступили на путь деградации, одним из первых этапов которой является отщепление кэпа от мРНК. Подавление трансляции кэпированных мРНК наступает при соотношениях р50/мРНК близких к таковому в свободных нетранслируемых мРНП, где содержание р50 очень высоко, и белок, по-видимому, насыщает мРНК. Ингибирование под действием р50 наблюдается исключительно на стадии инициации. Более детальное исследование этапа инициации трансляции, который ингибируется р50, показало, что это происходит до присоединения малой субчастицы рибосомы к мРНК так. что мРНК обнаруживается в присутствии ингибирующих количеств р50 в форме свободных мРНП [173]. За ингибирова-ние трансляции отвечает в основном С-домен р50. Этот домен, так же как и целый р50, вытесняет из комплекса с мРНК фактор инициации eIF4G [172] — наиболее крупную из субъединиц eIF4F, которая взаимодействует с мРНК и служит платформой для размещения двух других субъединиц этого фактора: АТФ-зависимой хеликазы eIF4A и кэп-связывающей субъединицы eIF4E, а также фактора инициации eIF3 и поли(А)-связывающего белка РАВР (Poly(A) Binding Protein), ассоциирующего с 3' концевой поли(А) последовательностью мРНК. Участие р50 в трансляции не ограничивается только одним ингибировани-ем этого процесса. При удалении p50 из лизата или при добавлении мРНК в высокой концентрации процесс трансляции также останавливается. Добавление р50 в такие лизаты, характеризующиеся очень низким соотношением р50/мРНК, ведет к активации трансляции [73, 226]. Процесс белкового синтеза стимулируется р50 исключительно на стадии инициации и не оказывает никакого влияния на элонгацию и терминацию полипептидных цепей. Удаление белка р50 из лизатов ретикулоцитов кролика приводит к накоплению 48S преинициаторного комплекса, т. е. остановка белкового синтеза в лизате, дефицитном по р50, может происходить или на этапе присоединения 60S субчастицы рибосом к 48S комплексу, или на предыдущей стадии сканирования 5' НТО мРНК малой субчастицей рибосом до инициирующего кодона. [73]. Опыты по реконструкции преинициа-торного комплекса 48S из очищенных компонентов

(мРНК, 40S субчастицы рибосом и факторов инициации трансляции) показали, что при ограниченном количестве факторов инициации р50 стимулирует появление 48S преинициаторного комплекса, в котором малая субчастица рибосом завершила сканирование 5' НТО мРНК и находится на инициирующем кодоне [186].

Совокупность этих данных позволяет предположить, что, скорее всего, р50 облегчает продвижение малой субчастицы рибосом вдоль 5' НТО мРНК к инициирующему кодону за счет своей способности вызывать плавление вторичной структуры мРНК. Нельзя исключить и более раннее предположение о механизме позитивного действия р50 на инициацию трансляции. Согласно этому предположению, р50 препятствует неспецифическому связыванию РНК-связывающих факторов инициации трансляции вдоль всей молекулы мРНК, что вызывает их концентрацию в районе кэпа и 5' НТО [160,186, 226]. Представленные данные свидетельствуют о двояком действии р50 на трансляцию: при относительно низком соотношении р50/мРНК (вплоть до соотношения, наблюдаемого в полисомных мРНП) р50 стимулирует трансляцию, а при насыщении мРНК белком (как в свободных мРНП) р50 проявляет активность ре-прессора трансляции.

Как уже отмечалось выше, эукариотические ДХШ-белки проявляют высокое неспецифическое сродство к РНК и являются единственными универсальными мажорными белками цитоплазматиче-ских мРНП различных организмов, как транслируемых, так и нетранслируемых. Вполне очевидно, что эти белки рассматриваются наиболее подходящими кандидатами на роль основных мРНП-формирующих белков, упаковывающих мРНК в цитоплазме [6, 8]. ДХШ-белки могли бы выполнять функцию, аналогичную той, которую выполняют гистоны в упаковке хромосомной ДНК. Цитоплазматические мРНП, выделенные из различных источников, характеризуются постоянным набором свойств, а именно: 1) они проявляют широкое седиментационное распределение, отражающее гетерогенность мРНК по размерам в большинстве клеток, причем коэффициенты седиментации мРНП обычно превышают коэффициент седиментации свободной мРНК в 2,5-3 раза; 2) они имеют высокое весовое соотношение белок/РНК, равное 3м для свободных цитоплазма-тических РНП и 2м для транслируемых полисомных РНП, что приводит к уникальной плавучей плотности в градиенте CsCl, равной 1,39-1,4 г/см3 для свободных цитоплазматических мРНП и 1,45 г/см3 для полисомных мРНП; 3) мРНК в составе мРНП обладает высокой чувствительностью к эндорибонуклеазам, что свидетельствует о ее поверхностном располо-

жении в частицах [187]. Исследования комплексов белка р50 и мРНК показали, что одного этого белка достаточно для образования частиц, полностью соответствующих по вышеперечисленным свойствам природным мРНП, полученным из различных объектов. Упаковывая мРНК, ДХШ-белки могут влиять на ее трансляционный статус, что достаточно четко следует из приведенных выше данных. Кроме того, эти исследования обнаружили, что упаковка мРНК в частицах, соответствующих по соотношению белок/ РНК свободным и полисомным мРНП, различна [7]. При относительно низком соотношении р50/мРНК р50 связан с мРНК в виде мономеров обоими РНК-связывающими доменами — ДХШ и С-доменом. Это приводит к разворачиванию мРНП, что делает содержащуюся в них мРНК доступной для взаимодействия с различными белками, другими РНК, а также рибосомными субчастицами (рис. 4). При высоком соотношении р50/мРНК, характерном для свободных мРНП, молекулы р50 взаимодействуют с мРНК только ДХШ, а С-домены вытесняются с мРНК и оли-гомеризуются, формируя крупный мультимерный комплекс. В таком комплексе мРНК становится недоступна для взаимодействия с белками аппарата инициации трансляции, хотя очень легко атакуется эндорибонуклеазами.

Участие ДхШ-белков в регуляции стабильности мРНК

Недавно было обнаружено, что YB-1 и его гомологи способны эффективно стабилизировать мРНК, содержащие кэп-структуру, препятствуя их распаду в клетках и клеточных лизатах [44, 49, 75]. Наибольшая стабилизация мРНК достигается при высоком соотношении YB-1/мРНК, что сопряжено с выходом мРНК из полисом и выключением их трансляции [75]. Кэп-зависимая стабилизация мРНК в клетке и лизатах не исключает чрезвычайно высокую чувствительность мРНК к эндорибонуклеазам. Парадокс легко объясняется тем, что деградация мРНК в клетке происходит обычно с концов под действием экзонуклеаз [60], а при высоких соотношениях YB-1/мРНК концы мРНК, вероятно, становятся недоступными для этих нуклеаз. Исследование роли различных доменов YB-1 в стабилизации мРНК показало, что стабилизация обеспечивается ДХШ, который вытесняет факторы инициации трансляции е^4Е, е^4А и е^4В с кэп-структуры мРНК. С-домен, обладающий наибольшей активностью в подавлении белкового синтеза и вытесняющий с тела мРНК, не повышает стабильности мРНК [75]. Способность YB-1 и его гомологов предохранять молекулы мРНК от деградации при их насыщении белком может объяснять высокую стабильность

маскированных мРНК, запасенных в виде комплексов с этими белками в половых клетках [57, 80]. Помимо специфической упаковки молекул мРНК в транслируемых и нетранслируемых мРНП, регуляции трансляции и стабильности мРНК в клетке, белок р50 может участвовать в локализации транс-ляционно активных мРНК на актиновом скелете. Как уже упоминалось выше, ^концевой А/П домен р50 имеет специфический участок для связывания актина. Белок взаимодействует как с мономерным, так и с полимерным актином и в модельных экспериментах декорирует актиновые микрофиламенты внутри клетки [194]. Белок сохраняет свою способность связываться с актином, находясь в комплексах с мРНК с относительно небольшим соотношением р50/мРНК, характерным для транслируемых мРНП. Однако белок утрачивает свою способность взаимодействовать с актином в составе комплексов, в которых мРНК насыщена белком р50, т. е. в составе свободных нетранслируемых мРНП [194]. Это означает, что белок р50 может локализовать только транслируемую мРНК на актиновом скелете и, возможно, участвует в специфической локализации мРНК в клетке, что служит самым первым шагом на пути к клеточной дифференцировке.

В завершение раздела об участии ДХШ-белков в РНК-зависимых процессах стоит упомянуть еще об одной недавно обнаруженной функции этих белков, вызывающей очень большой интерес. Оказалось, что белок ооцитов земноводных, FRGY2, отвечает за обратимую разборку ядрышек, которая происходит после овуляции ооцитов [88, 89, 95]. Пока механизм этого явления не установлен. Важно, что такая разборка не связана с ингибировани-ем транскрипции рибосомной РНК, хотя это могло бы быть наиболее естественным объяснением этого процесса.

взаимодействие дхш-белков С ДНК

Связывание ДХШ-белков с нуклеиновыми кислотами изучено очень подробно [219, 220, 243]. Поскольку YB-1 был впервые обнаружен благодаря взаимодействию с двухцепочечной ДНК, содержавшей Y-бокс мотив (CTGATTGGC/TC/TAA) промотора генов главного комплекса гистосовместимости II класса, белки этого семейства получили еще одно название — Y-бокс-связывающие белки или просто Y-бокс белки [63, 242]. В последующие годы в разных лабораториях было выделено несколько новых членов данного семейства с помощью фрагментов разных промоторов, также содержавших Y-бокс последовательности [182, 228, 243]. Соответственно,

эти белки стали рассматривать как белки, специфически связывающиеся с Y-бокс содержащей ДНК. Однако почти в то же время стали появляться сообщения о выделении ДХШ-белков, взаимодействующих с фрагментами ДНК, не содержащими Y-бокс мотива [90, 96, 119, 250]. Более того, при сравнении сродства ДХШ-белков к ДНК с разными последовательностями было обнаружено, что эти белки не проявляют особого предпочтения к Y-бокс ДНК [90, 96, 119, 128]. Они хорошо связывались с самыми разными последовательностями, включая апурини-зированную ДНК [136] и ДНК в H-форме [104]. Очень четко было показано, что ДХШ-белки проявляют заметно большее сродство к одноцепочечной форме ДНК по сравнению с двухцепочечной [96, 147]. Недавно, используя технологию микрочипов с иммобилизованными олигодезоксирибонуклеотидами, был проведен подробный анализ специфичности связывания кроличьего белка р50 с различными последовательностями одноцепочечных и двухцепо-чечных фрагментов ДНК [257]. Установлено, что р50 связывает очень широкий спектр различных последовательностей, обнаруживая наибольшее предпочтение к одноцепочечному мотиву GGGG, а затем к одноцепочечным и двуцепочечным мотивам CACC и CATC. В то же время к последовательностям, встречающимся в Y-боксах, белок проявлял лишь умеренное сродство. Обнаруженные в этом исследовании G-богатые мотивы присутствуют в промоторах некоторых генов, к которым ДХШ-белки имеют повышенное сродство [52, 119, 202]. На взаимодействие ДХШ-белков с ДНК очень сильно влияют различные типы нарушений вторичной структуры ДНК, вызываемые такими повреждающими агентами, как УФ-облучение, обработка лекарственными препаратами, окислительный стресс [125, 227]. Выделение некоторых членов семейства ДХШ-белков с использованием фрагментов ДНК, содержащих Y-бокс, можно объяснить относительно высоким сродством этих белков к ДНК по сравнению с другими клеточными белками, хотя для самих ДХШ-белков Y-бокс последовательность не является наиболее предпочтительной.

В опытах с фрагментами ДХШ-белков было показано, что для взаимодействия с ДНК необходим домен холодового шока [171, 229]. При помощи метода ЯМР установлено, что в связывание с одно-цепочечной ДНК вовлечены в основном остатки ароматических аминокислот, входящие в состав мотивов РНП-1 и РНП-2, а также ряд положительно заряженных остатков в петлях, соединяющих р-тяжи [124]. Эти остатки создают на поверхности домена участок связывания нуклеиновых кислот, аналогичный таковому у бактериальных белков. Этот уча-

сток ограничен петлями, соединяющими ß1 и ß2, а также ß4 и ß5-тяжи. Основную роль в связывании с ДНК играют электростатические силы и стэкинг-взаимодействия фенилаланиновых остатков с основаниями ДНК. Кроме того, было показано, что большая петля, соединяющая ß3 и ß4-тяжи в эука-риотических белках, при пересадке ее в белок CspA E. coli придает последнему способность связывать не только одноцепочечную, но и двуцепочечную ДНК [239].

При связывании YB-1 с ДНК в области промотора генов главного комплекса гистосовместимости II класса наблюдалось плавление двойной спирали ДНК. Появление одноцепочечных участков было зарегистрировано по увеличению чувствительности ДНК к эндонуклеазам, специфичным к одноцепочечной структуре ДНК [147]. Опыты на микрочипах показали, что р50 кролика наиболее эффективно дестабилизирует двуспиральные участки ДНК с мотивами GGTG, GATG и GTGG, в то время как GGGGG-содержащие дуплексы, наоборот, сильно стабилизировались белком р50 [257]. Кроме того, было обнаружено, что p50 может в тысячи раз ускорять ренатурацию двухцепочечной ДНК при физиологических условиях [215]. Будут ли ДХШ-белки плавить или, наоборот, стабилизировать вторичную структуру ДНК — по-видимому, сильно зависит от соотношения белок/ДНК, а также от состава нуклеотидов и протяженности комплементарных участков ДНК. Это означает, что эти белки могут по-разному взаимодействовать с ДНК с разной последовательностью нуклеотидов и оказывать разное влияние на ее пространственную структуру.

УЧАСТИЕ ДхШ-БЕЛКОВ

в днк-зависимых процессах

Взаимодействие ДХШ-белков с ДНК может приводить к изменению уровня транскрипции некоторых генов. С каждым годом список таких генов непрерывно растет. В их число входят важнейшие клеточные гены, продукты которых участвуют в регуляции клеточного роста, дифференцировки и апоптоза (Fas, p53, GMCSF, PDGF, ErbB-2, циклины А и В1), а также в регуляции экспрессии вирусных генов. ДХШ-белки могут оказывать как позитивное, так и негативное действие на промоторы различных генов. Хотя полностью механизм действия ДХШ-белков в транскрипции ни в одном из случаев окончательно пока невыяснен, было предложено несколько правдоподобных моделей такой регуляции. Функционирование ДХШ-белков в качестве активаторов транскрипции особенно подробно

изучено в случае регуляции генов полиомавируса человека JCV [189, 198, 199]. Промотор этого вируса является общим регуляторным элементом для ранних и поздних вирусных генов и состоит из большого числа участков связывания различных регуляторных факторов, включая YB-1. Активность промотора зависит от белкового комплекса, который собирается на нем в определенный момент жизненного цикла вируса. В состав комплекса может входить YB-1 и другие регуляторные белки, такие как Pura, Rel65 (p65), большой T-антиген. Связывая друг друга, белки могут взаимно влиять на ДНК-связывающую активность своих партнеров. Например, связываясь с Pura и Rel65 (p65), YB-1 способствует их посадке на промотор, что приводит к активации транскрипции соответствующих генов вируса [198]. Взаимодействие YB-1 с T-антигеном усиливает способность последнего стимулировать транскрипцию поздних генов, но ослабляет его активность в подавлении транскрипции ранних генов. Подобная схема активации промотора с участием YB-1 наблюдается и в случае TAR-зависимой транскрипции генов вируса HIV1 [15]. TAR-элемент представляет собой протяженную шпильку РНК, образующуюся на 5'-конце вирусных транскриптов. С TAR-элементом связывается вирусный белок Tat, и такое взаимодействие активирует транскрипцию вирусных РНК. Было показано, что YB-1 может образовывать комплекс с Tat и TAR, что ведет к усилению активности Tat в транскрипции. Аналогично YB-1 стимулирует транскрипцию гена гелатина-зы A, взаимодействуя в этом случае с факторами транскрипции p53 и AP2 на промоторе этого гена [158]. Высказано предположение, что ингибирую-щее действие ДХШ-белков на транскрипцию может быть связано с их способностью переводить ДНК в области промотора в одноцепочечную конформа-цию или стабилизировать такую конформацию благодаря повышенному сродству этих белков к одно-цепочечным участкам ДНК [53, 147, 227].

Переходу ДНК в одноцепочечную структуру может способствовать сильная асимметрия в распределении пуриновых и пиримидиновых нуклео-тидов, а также наличие инвертированных повторов нуклеотидов [116, 126]. Именно такие участки обнаружены в промоторах ряда генов, регулируемых ДХШ-белками [227]. Перевод ДНК в промоторных участках в одноцепочечную форму будет препятствовать посадке транскрипционных факторов, взаимодействующих с двухцепочечной ДНК, и приведет к ингибированию транскрипции. Такой механизм может лежать в основе негативного действия ДХШ-белков на транскрипцию гена белка Fas [134], белков MHC II [147], GM-CSF [51] и VEGF [53]. В

случае белка VEGF прямо показано, что посадка ДХШ-белка DbpA на промотор гена этого белка и следующая за этим репрессия транскрипции связаны с появлением в промоторе одноцепочечной формы ДНК [53]. Многие промоторы, даже при отсутствии заметной гомологии по нуклеотидной последовательности, могут содержать участки, склонные переходить в одноцепочечную форму, которая является высокоаффинным сайтом для связывания ДХШ-белков, что легко объясняет столь большое количество генов, контролируемых ДХШ-белками. Кроме того, в некоторых случаях ДХШ-белки могут ингибировать транскрипцию, связываясь непосредственно с факторами, активирующими транскрипцию, и препятствуя их посадке на промоторный участок ДНК [140, 142].

ДХШ-белки часто рассматриваются как факторы, участвующие в репликации и репарации ДНК [74,96,107]. Эти выводы основываются на косвенных данных, так как доказательства прямого участия ДХШ-белков в этих процессах отсутствуют. В пользу участия ДХШ-белков в репликации свидетельствует наличие четкой положительной корреляции между повышением их внутриклеточного уровня и уровня кофактора ДНК-полимеразы ст-циклина PCNA (proliferating cell nuclear antigen), циклинов А и В1, а также ДНК полимеразы IIa в активно делящихся клетках [93, 117,213]. Возможность участия ДХШ-белков в репарации ДНК основывается пока на двух фактах. Во-первых, эти белки проявляют повышенное сродство к ДНК, поврежденной различными внутри- и внеклеточными агентами, включая УФ-облучение и обработку противоопухолевыми препаратами [96,107,136]. И, во-вторых, in vitro они могут напрямую стимулировать активность эндонуклеазы III человека, участвующей в удалении пиримидиновых нуклео-тидов, модифицированных в результате эндогенного окисления или различных типов облучения [152].

РЕГУЛЯЦИЯ СОДЕРЖАНИЯ ДхШ-БЕЛКОВ В КЛЕТКЕ

Принимая во внимание, что ДХШ-белки осуществляют регуляцию многочисленных ДНК- и РНК-зависимых процессов, следует ожидать, что их содержание и функциональная активность в клетке должны строго контролироваться. Содержание ДХШ-белков в клетках позвоночных может меняться в зависимости от физиологического состояния клетки или стадии ее дифференцировки. Так, белки FGRY2 и MSY2 в ооцитах лягушки и сперматоцитах

мыши, где белковый синтез подавлен, присутствуют в очень большой концентрации, достигающей 2 % от суммарного белка [157, 252]. Содержание YB-1 достаточно велико в ретикулоцитах кролика и некоторых раковых клетках, активно синтезирующих белок [27, 58, 112]. Таким образом, корреляция между активностью белок-синтезирующего аппарата и содержанием в клетке YB-1 и его гомологов наблюдается далеко не всегда. Количество мРНК ДХШ-белков также сильно различается в разных тканях и типах клеток, например, оно высоко в сердце и поперечнополосатых мышцах как у эмбрионов, так и у взрослых организмов, но незначительно в почках, легких и печени [90, 130, 222]. Причем в печени уровень мРНК YB-1-подобных белков резко уменьшается по мере развития организма. Кроме того, уровень мРНК, кодирующих эти белки, а также уровень самих белков сильно меняется при стимуляции пролиферации клеток [90, 108] и при различных стрессовых воздействиях на клетки [179, 212, 231]. Изменение содержания мРНК ДХШ-белков может быть следствием как изменения скорости ее образования, так и скорости ее распада. В какой степени это содержание определяется первым или вторым фактором, в настоящее время сказать нельзя. Изменение содержания ДХШ-белков в клетке, в свою очередь, также зависит от скорости их синтеза и распада, а скорость синтеза определяется не только количеством мРНК в клетке, которое, как было сказано выше, может сильно варьировать, но и эффективностью трансляции мРНК. Показано, что в лизатах одних типов клеток мРНК р50 может присутствовать в нетранслируемой форме, в виде свободных информосом, тогда как в лизатах других типов она в значительной мере выявляется в активных полисомах [8]. Эти результаты свидетельствуют о существовании механизма, регулирующего поступление мРНК р50 в полисомы. В 3' НТО мРНК р50 был обнаружен участок, специфически связывающий два мажорных белка мРНП р50 и РАВР [216]. Было показано, что РАВР позитивно влияет на трансляцию мРНК р50 по механизму, независимому от 3' концевой поли(А) последовательности. Благодаря такому механизму регуляции экспрессии белка р50, может поддерживаться необходимое для эффективной трансляции соотношение двух мажорных белков мРНП, р50 и РАВР. С другой стороны, специфическое связывание р50 приводит к селективному подавлению трансляции мРНК р50 при относительно низких концентрациях р50, которые не оказывают ингибиторного действия на синтез других клеточных белков. Другими словами, экспрессия р50 авторегулируется на уровне трансляции мРНК р50 [9].

взаимообмен дхш-белков между ядром и цитоплазмой

ДХШ-белки являются ядерно-цитоплазматичес-кими белками, и их распределение между ядром и цитоплазмой может меняться в зависимости от физиологического состояния клетки и фазы митоти-ческого цикла. В клетках HeLa переход YB-1 из цитоплазмы в ядро осуществлялся начиная с конца G1 и в начале S фазы. Накопление YB-1 в ядре в этот достаточно короткий интервал времени коррелировало с запуском синтеза циклинов, гены которых, как оказалось, содержат в промоторах участки специфического связывания YB-1 ^-боксы) и активируются под действием YB-1 [117]. Переход ДХШ-белков в клеточное ядро стимулировался при воздействии на клетки УФ-света, отдельных противоопухолевых препаратов, повреждающих ДНК, например цис-платины, а также при гипертермии (повышении температуры инкубации клеток до 430 С) [127, 223, 236]. Стабильно высокая концентрация этих белков как в ядре, так и в цитоплазме, наблюдается у некоторых видов клеток с множественной лекарственной устойчивостью [27, 177]. Механизмы перераспределения ДХШ-белков между ядром и цитоплазмой в настоящее время активно исследуются. Достаточно давно было высказано предположение, что перераспределение ДХШ-белков из ядра в цитоплазму может происходить по мере выхода мРНК из ядра и ее накопления в цитоплазме [190, 230]. Понижение концентрации мРНК в цитоплазме за счет ослабления ее транскрипции и усиления деградации могло бы способствовать обратному переходу этих белков в клеточное ядро, что должно активировать процесс транскрипции. Благодаря описанному механизму, YB-1 и другие ДХШ-белки могут поддерживать баланс между скоростью транскрипции мРНК в ядре и ее содержанием в цитоплазме. Было показано, что в зрелых ооцитах Xenopus, в которых большое количество маскированной мРНК накоплено в цитоплазме, а клеточное ядро слабо активно в процессе транскрипции, подавляющее количество FRGY2 находится в цитоплазме [36]. Замена фенилаланина и тирозина в РНП-1 консенсусной последовательности YB-1, приводящая к утрате или сильному понижению сродства белка к РНК, вызывает переход мутированного белка из цитоплазмы в клеточное ядро [21]. Эти данные свидетельствуют о том, что цитоплазматическая локализация ДХШ-белков во многом определяется их взаимодействием с мРНК в цитоплазме. С другой стороны, в эндотелиальных клетках, обработанных тромбином, наблюдалось отщепление С-концевого фрагмента от YB-1 в районе 205-го а. о. и переход большого ^концевого фрагмента белка, включаю-

НАУЧНЫЕ ОБЗОРЫ

щего N-концевой A/П-домен, ДХШ и часть С-домена, в клеточное ядро [224]. Более сильное укорачивание этого N-концевого фрагмента приводило к потере его способности переходить в ядро. Полученный результат был интерпретирован следующим образом: YB-1 в первой половине С-домена (ближайшей к ДХШ) содержит сигнал ядерной локализации, который маскирован некой аминокислотной последовательностью, расположенной вблизи С-конца белка. Отщепление этой последовательности протеазой, активируемой через каскад регуляторных процессов, запускаемых тромбином, экспонирует сигнал ядерной локализации на YB-1. Перешедший в ядро большой фрагмент YB-1 сохраняет свою активность в качестве фактора транскрипции и запускает в ядре транскрипцию ряда генов, вызывающих процесс дифференцировки эндотелиальных клеток [25]. Детальный анализ роли различных участков молекулы YB-1 в ядерно-цитоплазматическом распределении белка был проведен в работе немецких авторов [117]. В ней исследовалось влияние различных фрагментов YB-1, слитых с GFP (Green Fluorescent Protein), на распределение репортерного белка внутри клеток, находящихся на разных стадиях мито-тического цикла. В молекуле YB-1 в районе аминокислотных остатков 186-205 был обнаружен сигнал ядерной локализации, что полностью соответствует полученным ранее результатам [225]. Добавление этой последовательности к флуоресцирующему репортерному белку GFP обеспечивает нерегулируемый по циклу переход слитого белка в клеточное ядро. Были найдены также два регуляторных сигнала в молекуле YB-1, ограничивающие поступление этого белка в ядро узким временным интервалом в клеточном цикле (переход из G1 в S). Один из этих сигналов был локализован в ДХШ, в то время как другой — в последнем положительно заряженном кластере С-домена [117]. Однако остается открытым вопрос, почему YB-1 переходит в ядро только на определенной стадии клеточного цикла. Вероятно, существуют какие-то дополнительные модификации ДХШ-белков, которые могут регулировать не только переход ДХШ-белков из ядра в цитоплазму, но также их активность в разнообразных РНК- и ДНК-зависимых процессах. Это могут быть некова-лентные взаимодействия ДХШ-белков с другими клеточными белками, такими как SRp30c [189] и p53 [258], а также ковалентные модификации. Ранее в ряде работ было показано, что YB-1-подобные белки фосфорилируются как in vivo, так и in vitro [20, 59, 120, 160, 168]. Более того, в составе цитоплазмати-ческих мРНП, наряду с ДХШ-белками, обнаруживается протеинкиназная активность, вызывающая их фосфорилирование in vitro [55,100,120,169], причем

выяснилось, что in vitro казеинкиназа II фосфорили-рует эти белки по сериновым остаткам [11]. В ряде работ сообщалось, что степень фосфорилирования ДХШ-белков может влиять на эффективность трансляции связанных с этими белками мРНК: фосфори-лированные ДХШ-белки вызывали ингибирование трансляции in vivo и in vitro, тогда как их дефос-форилирование снижало ингибирующий эффект [123,217]. Однако подробно эффект фосфорилиро-вания ДХШ-белков на трансляцию не исследован. Кроме того, до сих пор не установлена протеинки-наза (киназы), фосфорилирующая эти белки in vivo. Ряд данных указывают на то, что фосфорилирование задействовано в регуляции транспорта ДХШ-белков из цитоплазмы в ядро. Например, в фибробластах человека индуцируемый интерфероном g переход YB-1 в ядро подавлялся в присутствии специфического ингибитора казеинкиназы II [101], а в клетках KB индуцируемая УФ-облучением транслокация YB-1 в ядро не происходила при добавлении специфического ингибитора протеинкиназы С [127].

В 2001 г. было показано, что фосфорилирование белка p50 казеинкиназой II in vitro в несколько раз снижает его способность ускорять ренатурацию комплементарных цепей ДНК [215]. Однако роль фосфорилирования в регуляции перехода ДХШ-белков между ядром и цитоплазмой, так же как и влияние этой модификации на активность ДХШ-белков в ДНК-зависимых процессах, точно не установлены. Позже, в 2003 г., обнаружена еще одна ковалентная модификация ДХШ-белков — метилирование арги-ниновых остатков в митохондриальном белке RBP16 в Trypanosoma brucei [185]. Однако пока неясно, можно ли связать данную модификацию с каким-либо влиянием на функционирование ДХШ-белков эукариот.

перспективы применения дхш-белков

В МЕДИЦИНЕ

Пристальное внимание медиков к ДХШ-белкам привлекла публикация в журнале «Nature Medicine» в 1997 году сообщения об обнаружении прямой корреляции между локализацией YB-1 в ядре и появлением множественной лекарственной устойчивости клеток рака молочной железы человека [27]. Было также установлено, что в клетках, чувствительных к противоопухолевым препаратам, YB-1 обнаруживался только в цитоплазме. Дополнительный синтез YB-1 в таких чувствительных клетках вызывал повышение уровня гликопротеина P и устойчивость клеток к лекарственным препаратам [87]. Было найдено разумное объяснение обнаруженной корреляции.

2O

I ОБЗОРЫ ПО КЛИНИЧЕСКОЙ ФАРМАКОЛОГИИ И ЛЕКАРСТВЕННОЙ ТЕРАПИИ

ТОМ 9/2O11/3

Оказалось, что ген mdrl, кодирующий гликопро-теин Р (мембранный белок, обеспечивающий множественную лекарственную устойчивость), имеет Y-бокс в своем промоторе и его экспрессия находится под контролем YB-1 [87,180]. Переход YB-1 в ядро вызывает активацию синтеза мРНК с гена mdrl и приводит к появлению у клеток множественной лекарственной устойчивости. Было предложено рассматривать ядерную локализацию YB-1 как наиболее ранний маркер множественной лекарственной устойчивости клеток рака молочной железы человека [4, 112, 201].

Переход YB-1 в ядро наблюдается не только в случае рака молочной железы [3], но и при других типах раковых заболеваний: остеосаркоме [176], аденокарциноме яичника [118], раке легкого [211], синовиальной саркоме [177]. Опухоли, в клетках которых YB-1 обнаруживался в ядре, характеризовались как более агрессивные и более устойчивые к послеоперационной химиотерапии. Помимо активации гена mdr1, которая четко коррелировала с переходом YB-1 в ядро, оказалось, что эффект такого перехода на физиологию опухолевых клеток может быть связан с ингибированием гена белка p53 [135]. Уровень этого белка значительно повышается при различных экстремальных воздействиях на клетку, вызывающих повреждение ДНК (различные типы облучения, токсичные химические агенты и т. п.). p53 (ключевой элемент SOS-механизма) участвует в запуске процессов, позволяющих клетке восстановить целостность генома, а при наиболее тяжелых повреждениях активность р53 индуцирует апоптоз, препятствуя злокачественной трансформации клеток [138]. Оказалось, что YB-1, накапливаясь в ядре, способен ингибировать промотор гена p53, предотвращая его экспрессию. Ингибирование синтеза р53, наряду с запуском синтеза гликопротеина Р, при ядерной локализации YB-1, способствует более агрессивному поведению злокачественной опухоли, что, в свою очередь, свидетельствует о плохом прогнозе на выздоровление. Кроме того, YB-1 активирует промотор гена металлопротеиназы гелатиназы А, которая расщепляет белки базальных мембран и способствует инвазии раковых клеток в соседние ткани [158]. Таким образом, переход YB-1 в ядро приводит к ряду событий, способствующих росту и размножению раковых клеток.

В некоторых случаях ДХШ-белки могут, по-видимому, выступать в роли супрессоров опухоли. Онкогенная трансформация может быть вызвана различными причинами, одной из которых является повышение активности протоонкогенов и появления белков P3k (фосфоинозитол-3-киназы) и Akt, являющихся протеинкиназами инозитол-3-фосфат/АМ-

киназного пути, который запускается при обработке клеток некоторыми факторами роста и гормонами [40]. P3k и Akt вызывают трансформацию, стимулируя через каскад реакций процесс трансляции [17].

Следует также отметить особенности изменений экспрессии ДХШ-белков при раке легкого, которые коррелировали с изменениием активности топоизо-меразы IIa [93]. Ранее нами была предложена гипотеза о важности соотношения количества топоизо-мераз I и II в клетках при их реакциях на различные стрессорные воздействия [1]. В настоящее время общепризнано, что механизмом лечебного действия ряда препаратов при химиотерапии рака является ингибирование топоизомераз [2]. Однако внутриклеточные механизмы, запускающие и регулирующие уровень топоизомераз и переход ДХШ-белков из цитоплазмы в ядро, особенно при перерождении клеток, пока не изучены.

Не менее важным является и тот факт, что дополнительная продукция YB-1 c введенной плазмидой приводит к подавлению трансформации клетки, вызванной возросшей активностью P3k или Akt, и возвращает трансформированы^ клеткам нормальный фенотип [21]. Авторы статьи считают, что наиболее вероятным механизмом подавления трансформирующего действия P3k/Akt на клетки является ингиби-рование трансляции, вызванное повышением уровня белка YB-1. Однако супрессорный эффект YB-1 не наблюдался в случае трансформации другими онкобелками, такими как Src, Jun, Qin. В отличие от вышеприведенных примеров, когда YB-1 действовал в ядре на уровне транскрипции и стимулировал развитие рака, в данном случае YB-1 подавлял трансформацию, проявляя свое действие на уровне трансляции в цитоплазме.

заключение

Суммируя вышеизложенные данные, можно утверждать, что ДХШ-белки являются одними из ключевых регуляторов внутриклеточных процессов у про- и эукариот. Широкое распространение среди различных видов организмов и высокая степень гомологии свидетельствуют о древнем происхождении белков этого семейства. Несмотря на то, что ДХШ-белки были охарактеризованы сравнительно недавно и их детальное исследование началось лишь в последние годы, поражает все более расширяющийся с каждым годом спектр функций, обнаруживаемых у этих белков.

Пристальное внимание к себе БХШ бактерий привлекают, прежде всего, по причине их участия в стрессорных реакциях. Они помогают клеткам не

только преодолевать стресс, вызванный понижением температуры окружающей среды (холодовой шок), но и жить в этих экстремальных условиях. Эу-кариотические ДХШ-белки задействованы в более широком наборе внутриклеточных реакций, что, по-видимому, вызвало появление у них дополнительных доменов помимо ДХШ. Однако, как следует из приведенных работ, интенсивные исследования ДХШ-белков в течение последних лет пока не смогли ответить на ряд важных вопросов.

Во-первых, не установлена иерархия многих реакций, в которых участвуют ДХШ-белки, особенно таких, как транскрипция, трансляция или половая специализация, которые требуют строгой регуляции активности и количества этих белков.

Во-вторых, до сих пор имеется очень мало сведений как о ковалентных модификациях, которые могли бы регулировать их активность, так и о механизмах, запускающих или ингибирующих их синтез в клетке.

В третьих, практически ничего неизвестно о регуляции времени жизни ДХШ-белков в клетке.

Эти научные направления крайне перспективны, особенно в связи с их значением для понимания роли ДХШ-белков в таких важнейших процессах, как возникновение и развитие рака, эмбриональное развитие, дифференцировка клеток и их жизнеспособность.

Таким образом, ДХШ-белки являются чрезвычайно интересным и многообещающим объектом исследования не только для молекулярных биологов, но и для широкого круга специалистов практического здравоохранения.

Литература

1. Ващенко В. И., Щедрина Л. В., Комар В. Е. Топоизо-мераза II — ее роль в конформационных изменениях суперспиральной ядерной ДНК лимфоцитов после Y-облучения // Биополимеры и клетка. — 1985. — Т. 1, № 4. — С. 203-207.

2. Ващенко В. И. Ингибиторы топоизомераз как лекарственные средства. Механизм действия // Обзоры по клин. фармакол. и лек. тер. — 2003. — Т. 3, №1. — С. 2-15.

3. Генс Г. П., Стромская Т. П., Калита О. В. и др. Исследование белока УВ-1 в опухолях молочной железы // Клин. лаб. диагн. — 2009. — № 4. — С. 21-24.

4. Генс Г. П., Ставровская А. А. Белок УВ-1 как фактор прогноза при раке молочной железы // Весник РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН. — 2010. — Т. 21, № 1. — С. 3-10.

5. Головлев Е. Л. Реакция бактериальных клеток на холодовой шок на уровне динамики хромосомы, транскрипции и трансляции // Микробиология. — 2003. — Т. 72. — № 1, С. 5-13.

6. Овчинников Л. П., Скабкин М. А., Рузанов П. В., Евдокимова В. М. Мажорные белки мРНП в структурной

организации и функционировании мРНК в клетках эу-кариот // Мол. биол. — 2001. — Т. 35, вып. 4. — С. 548558.

7. Скабкин М. А., Скабкина О. В., Овчинников Л. П. Муль-тифункциональные белки с доменом холодового шока в регуляции экспрессии генов // Успехи биол. химии. — 2004. — Т. 44. — Вып. 4, C. 3-52.

8. Скабкин М. А., Лябин Д. Н., Овчинников Л. П. Неспецифическое и специфическое взаимодействие Y-бокс-связывающего белка 1 (YB-1) с мРНК и посттранскрипционная регуляция белкового синтеза в животных клетках // Мол. биол. — 2006. — Т. 40, вып. 4. — С. 620-633.

9. Скабкина О. В., Скабкин М. А., Лябин Д. Н., Овчинников Л. П. Мажорный белок цитоплазматических мРНП р50ДВ-1 регулирует свой синтез // ДАН. — 2004. — Т. 395, № 4. — C. 548-551.

10. Тычко Р. А., Опарина Н. Ю., Зиновьева О. Л. и др. Количественная оценка изменения уровня экспрессии гена YB-1 при немелкоклеточном раке легкого // ТРУДЫ МФТИ — 2009 — Том 1, № 1. — C. 111-119.

11. Устинов В. А., Скабкин М. А., Нащекин Д. В. и др. Мажорный белок р50 цитоплазматических мРНП соматических клеток: экспрессия в Escherichia coli, выделение и некоторые свойства рекомбинантно-го белка // Биохимия. — 1996. — Т. 61, вып. 3. — C. 559-566.

12. Al-Fageeh M. B., Smales C. M. Control and regulation of the cellular responses to cold shock: the responses in yeast and mammalian systems // Biochem. J. — 2006. — Vol. 397, N 2. — P 247-259.

13. Abaza I, Coll O, Patalano S, et al. 2006. Drosophila UNR is required for translational repression of male-specific lethal 2 mRNA during regulation of X-chromosome dosage compensation // Genes Dev. — 2006. — Vol. 20, N3. — P. 380-389.

14. Abaza I, Gebauer F. Functional domains of Drosophila UNR in translational control// RNA 2008. — 14: 48290.

15. Ansari S. A., Safak M., Gallia G. L. et al. Interaction of YB-1 withhuman immunodeficiency virus type 1 Tat and TAR RNA modulates viral promoter activity // J. Gen. Virol. — 1999. — Vol. 80 (Pt 10). — P. 2629-2638.

16. Anderson E. C., Hunt S. L., Jackson R. J. Internal initiation of translation from the human rhinovirus-2 internal ribosome entry site requires the binding of Unr to two distinct sites on the 5 (untranslated region // J. Gen. Virol. — 2007. — Vol. 88. — P. 3043-3052.

17. Aoki M., Blazek E., Vogt P. K. A role of the kinase mTOR in cellular transformation induce by the oncoproteins P3k and Akt // Proc. Natl. Acad. Sci. — 2001. — Vol. 98, N1. — P. 136-141.

18. Arcus V. L., Langley R., Proft T. et al. The Three-dimensional structure of a superantigen-like protein, SET3, from a pathogenicity island of the Staphylococcus aureus genome // J. Biol. Chem. — 2002. — Vol. 277, N 35. — P. 32274-32281.

19. Ashizuka M., Fukuda T., Nakamura T. et al. Novel trans-lational control through an iron-responsive element by interaction of multifunctional protein YB-1 and IRP2 // Mol. Cell Biol. — 2002. — Vol. 22, N 18. — P. 63756383.

20. Auerbach S., Pederson T. Phosphorylation of messenger RNA-bound proteins in HeLa cells // Biochem Bio-phys Res Commun. — 1975. — Vol. 63, N1. — P. 149156.

21. Bader A. G., Felts K. A., Jiang N. et al. Y box-binding protein 1 induces resistance to oncogenic transformation

by the phosphatidylinositol 3-kinase pathway // Proc. Natl. Acad. Sci. - 2003. - Vol. 100, N 21. - P. 1238412389.

22. Bader A. G., Vogt P. K. Inhibition of protein synthesis by Y box-binding protein 1 blocks oncogenic cell transformation // Mol. Cell. Biol. - 2005. - Vol. 25, N 6. - P. 20952106.

23. Bae W., Xia B., Inouye M., Severinov K. Escherichia coli CspA-family RNA chaperones are transcription antiterminators // Proc. Natl. Acad. Sci. - 2000. - Vol. 97, N14. -P. 7784-7789.

24. Balda M. S., MatterK. The tight junction protein ZO-1 and an interacting transcription factor regulate ErbB-2 expression // EMBO J. - 2000. - Vol. 19, N9. - P. 20242033.

25. Balda M. S., GarrettM. D., MatterK. The ZO-1-associated Y-box factor ZONAB regulates epithelial cell proliferation and cell density // J. Cell Biol. - 2003. - Vol. 160, N 3. -P. 423-432.

26. Bashaw G. J., Baker B. S. The regulation of the Droso-phila msl-2 gene reveals a function for Sex-lethal in translational control // Cell. - 1997. - Vol. 89, N5. -P. 789-98.

27. Bargou R. C., Jurchott K., WagenerC. etal. Nuclear localization and increased levels of transcription factor YB-1 in primary human breast cancers are associated with intrinsic MDR1 gene expression // Nat Med. - 1997. - Vol. 3, N4. - P. 447-450.

28. Bargou R. C., Jurchott K., Wagener C. et al. Nuclear localization and increased levels of transcription factor YB-1 in primary human breast cancers are associated with intrinsic MDR1 gene expression// Nat. Med. - 2001. - Vol. 3, N4. - P. 447-450.

29. Beran R. K., Simons R. W. Cold-temperature induction of Escherichia coli polynucleotide phosphorylase occurs by reversal of its autoregulation // Mol Microbiol. - 2001. -Vol. 39, N1. - P. 112-125.

30. Bergmann S., Royer-Pokora B., Fietze E. et al. YB-1 provokes breast cancer through the induction of chromosomal instability that emerges from mitotic failure and cen-trosome amplification //Cancer Res. - 2005. - Vol. 65, N 10. - P. 4078-4087.

31. Bevilacqua E., Wang X., Majumder M. et al. eIF2alpha phosphorylation tips the balance to apoptosis during osmotic stress // J. Biol Chem. - 2010. - Vol. 285, N22. -P. 17098-17111.

32. Blobel G. Protein tightly bound to globin mRNA // Bio-chem Biophys Res Commun. - 1972. - Vol. 47, N 1. -P. 88-95.

33. Boussadia O., Jacquemin-Sablon H., Dautry F. Exon skipping in the expression of the gene immediately upstream of N-ras (unr/NRU) // Biochim. Biophys. Acta. - 1993. -Vol. 1172, N1-2. - P. 64-72.

34. Boussadia O., Amiot F., Cases S. et al. Transcription of unr (upstream of N-ras) down-modulates N-ras expression in vivo // FEBS Lett. - 1997. - Vol. 420, N1. -P. 20-24.

35. Boussadia O., Niepmann M., Creancier L. et al. Unr is required in vivo for efficient initiation of translation from the internal ribosome entry sites of both rhinovirus and poliovirus // J. Virol. - 2003. - Vol. 77, N6. - P. 33533359.

36. Bouvet P., Wolffe A. P. A role for transcription and FRGY2 in masking maternal mRNA within Xenopus oocytes // Cell. 1994. - Vol. 77, N6. - P. 931-941.

37. Bouvet P., Matsumoto K., Wolffe A. P. Sequence-specific RNA recognition by the Xenopus Y-box proteins. An essential role for the cold shock domain // J. Biol. Chem. -1995. - Vol. 270, N 47. - P. 28297-28303.

38. Brandi A., Pietroni, P., Gualerzi C. O., Pon C. L. Post-tran-scriptional regulation of CspA expression in Escherichia coli // Mol Microbiol. - 1996. - Vol. 19, N2. - P. 231-240.

39. Brandi A., Spurio R., Gualerzi C. O., Pon C. L. Massive presence of the Escherichia coli 'major cold-shock protein' CspA under non-stress conditions // EMBO J. —

1999. — Vol. 18, N6. — P. 1653-1659.

40. Brazil D. P., Park J., Hemmings B. A. PKB binding proteins. Getting in on the Akt // Cell. — 2002. — Vol. 111, N3. — P. 293-303.

41. Brown E. C., Jackson R. J. All five cold-shock domains of unr (upstream of N-ras) are required for stimulation of human rhinovirus RNA translation // J. Gen. Virol. — 2004. — Vol. 85 (Pt8). — P. 2279-2287.

42. Bycroft M., Hubbard T. J., Proctor M. et al. The solution structure of the S1 RNA binding domain: a member of an ancient nucleic acid-binding fold // Cell — 1997 — Vol. 88, N 2. — P. 235-242.

43. Cairo G., Recalcati S. Iron-regulatory proteins: molecular biology and pathophysiological implications // Expert. Rev. Mol. Med. — 2007. — Vol. 9, N33. — P. 1-13.

44. Capowski E. E., Esnault S., Bhattacharya S., Malter J. S. Y box-binding factor promotes eosinophil survival by stabilizing granulocyte-macrophage colony-stimulating factor mRNA // J. Immunol. — 2001. — Vol. 167, N 10. — P. 5970-5976.

45. Chaikam V., Karlson D. T. Comparison of structure, function and regulation of plant cold shock domain proteins to bacterial and animal cold shock domain proteins // BMB ReP. — 2010. — Vol. 43, N1. — P. 1-8.

46. Chang B. E., Lin C. Y., Kuo C. M. Molecular cloning of a cold-shock domain protein, zfY1, in zebrafish embryo (1) // Biochim. Biophys. Acta. — 1999. — Vol. 1433 N 1-2. — P. 343-349.

47. Chansky H. A., Hu M., Hickstein D. D., Yang L. Oncogenic TLS/ERG and EWS/Fli-1 fusion proteins inhibit RNA splicing mediated by YB-1 protein // Cancer Res 2001. — Vol. 61, N9. — P. 3586-3590.

48. Chen B., Zhong D., Monteiro A. Comparative genomics and evolution of the HSP90 family of genes across all kingdom of organisms // BMC Genomics. — 2006. — Vol. 7, N156. — P. 1471-2164.

49. Chen C. Y., Gherzi R., Andersen J. S. et al. Nucleolin and YB-1 are required for JNK-mediated interleukin-2 mRNA stabilization during T-cell activation // Genes Dev. —

2000. — Vol. 14, N 10. — P. 1236-1248.

50. Coburn G. A., Mackie G. A. Degradation of mRNA in Escherichia coli: an old problem with some new twists // Prog. Nucleic Acid. Res. Mol. Biol. — 1999. — Vol. 62. — P. 55-108.

51. Coles L. S., Diamond P., Occhiodoro F. et al. Cold shock domain proteins repress transcription from the GM-CSF promoter // Nucleic Acids Res. — 1996. — Vol. 24, N 12. — P. 2311-2317.

52. Coles L. S., Diamond P., Occhiodoro F. et al. An ordered array of cold shock domain repressor elements across tumor necrosis factor-responsive elements of the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor promoter// J Biol Chem. — 2000. — Vol. 275, N 19. — P. 14482-14493.

53. Coles L. S., Diamond P., Lambrusco L. et al. A novel mechanism of repression of the vascular endothelial growth factor promoter, by single strand DNA binding cold shock domain (Y-box) proteins in normoxic fibroblasts. // Nucleic Acids Res. — 2002. — Vol. 30, N 22. — P. 4845-4854.

54. Cornells S., Tinton S. A., Schepens B. et al. UNR translation can be driven by an IRES element that is negatively

regulated by polypyrimidine tract binding protein // Nucleic Acids Res. - 2005. - Vol. 33, N10. - P. 30953108.

55. Cummings A., Sommerville J. Protein kinase activity associated with stored messenger ribonucleoprotein particles of Xenopus oocytes // J. Cell Biol. — 1988. — Vol. 107, N1. — P. 45-56.

56. Dar A. C., Dever T. E., Sicheri F. Higher-order substrate recognition of eIF2alpha by the RNA-dependent protein kinase PKR // Cell. — 2005. — Vol. 122, N6. — P. 887900.

57. Darnbrough C. H., Ford P. J. Identification in Xenopus lae-vis of a class of oocyte-specific proteins bound to messenger RNA // Eur. J. Biochem. — 1981. — Vol. 113, N3.

— P. 415-424.

58. Davydova E. K., Evdokimova V. M., OvchinnikovL. P., Hershey J. W. Overexpression in COS cells of p50, the major core protein associated with mRNA, results in translation inhibition // Nucleic Acids Res. — 1997. — Vol. 25, N14. — P. 2911-2916.

59. Dearsly A. L., Johnson R. M., Barrett P., Sommerville J. Identification of a 60-kDa phosphoprotein that binds stored messenger RNA of Xenopus oocytes // Eur. J. Biochem. — 1985. — Vol. 150, N1. — P. 95-103.

60. Decker C. J., Parker R. mRNA decay enzymes: decap-pers conserved between yeast and mammals // Proc. Natl. Acad. Sci. — 2002. — Vol. 99, N20. — P. 1251212514.

61. De Maio A. Heat shock proteins: facts, thoughts, and dreams // Shock. — 1999. — Vol. 11, N1. — P. 1-12.

62. Deschamps S., Viel A., Garrigos M. et al. mRNP4, a major mRNA-binding protein from Xenopus oocytes is identical to transcription factor FRG Y2 // J. Biol. Chem. — 1992. — Vol. 267, N20. — P. 13799-138102.

63. Didier D. K., Schiffenbauer J., Woulfe S. L. et al. Characterization of the cDNA encoding a protein binding to the major histocompatibility complex class II Y box // Proc. Natl. Acad. Sci. — 1988. — Vol. 85, N19. — P. 7322-7326.

64. Dinur M., Kilav R., Sela-Brown A. et al. In vitro evidence that upstream of N-ras participates in the regulation of parathyroid hormone messenger ribonucleic acid stability // Mol. Endocrinol. — 2006. — Vol. 20, N7. — P. 16521660.

65. Doniger J., Landsman D., Gonda M. A., Wistow G. The product of unr, the highly conserved gene upstream of N-ras, contains multiple repeats similar to the cold-shock domain (CSD), a putative DNA-binding motif // New Biol. — 1992. — Vol. 4, N4. — P. 389-395.

66. Dormoy-Raclet V., Markovits J., Jacquemin-Sablon A. et al. Regulation of Unr expression by 5(- and 3(-untrans-lated regions of its mRNA through modulation of stability and IRES mediated translation // RNA Biol. — 2005. — Vol. 2, N3. — P. e27-35.

67. Dormoy-Raclet V., Markovits J., Malato Y. et al. Unr, a cy-toplasmic RNA-binding protein with cold-shock domains, is involved in control of apoptosis in ES and HuH7 cells // Oncogene. — 2007. — Vol. 26, N18. — P. 2595-2605.

68. Duncan K., Grskovic M., Strein C. et al. 2006. Sex-lethal imparts a sex-specific function to UNR by recruiting it to the msl-2 mRNA 3(UTR: translational repression for dosage compensation // Genes Dev. — 2006. — Vol. 20, N3.

— P. 368-379.

69. Duncan K., Strein C., Hentze M. W. The SXL-UNR core-pressor complex uses a PABP-mediated mechanism to inhibit ribosome recruitment to msl-2 mRNA // Mol. Cell. — 2009. — Vol. 36, N4. — P. 571-582.

70. Ermolenko D. N., Makhatadze G. I. Bacterial cold-shock proteins // Cell Mol. Life Sci. — 2002. — Vol. 59, N11. — P. 1902-1913.

71. Evans J. R., Mitchell S. A., Spriggs K. A. et al. Members of the poly (rC)binding protein family stimulate the activity of the c-myc internal ribosome entry segment in vitro and in vivo // Oncogene. - 2003. - Vol. 22, N39. - P. 8012-8020.

72. Evdokimova V. M., Wei C. L., Sitikov A. S. et al. The major protein of messenger ribonucleoprotein particles in somatic cells is a member of the Y-box binding transcription factor family // J. Biol. Chem. - 1995. - Vol. 270, N7. -P. 3186-3192.

73. Evdokimova V. M., Kovrigina E. A., Nashchekin D. V. et al. The major core protein of messenger ribonucleoprotein particles (p50) promotes initiation of protein biosynthesis in vitro // J. Biol. Chem. - 1998. - Vol. 273. - N6. -P. 3574-3581.

74. Evdokimova V. M., OvchinnikovL. P. Translational regulation by Y-box transcription factor: involvement of the major mRNA-associated protein, p50 // Int. J. Biochem. Cell Biol. - 1999. - Vol. 31, N1. - P. 139-149.

75. Evdokimova V., Ruzanov P., Imataka H. et al. The major mRNA-associated protein YB-1 is a potent 5' cap-dependent mRNA stabilizer // EMBO J. - 2001. - Vol. 20, N19.

- P. 5491-5502.

76. Evdokimova V., Ovchinnikov L. P., Sorensen P. H. Y-box binding protein 1: providing a new angle on translational regulation // Cell Cycle. - 2006. - Vol. 5, N. 11. -P. 1143-1147.

77. Evdokimova V., Tognon C., Ng T. et al. Translational activation of snail1 and other developmentally regulated transcription factors by YB-1 promotes an epithelial-mesen-chymal transition // Cancer Cell. - 2009. - Vol. 15, N 5.

- P. 402-415.

78. Fekete C. A., Mitchell S. F., Cherkasova V. A. et al. N- and C-terminal residues of eIF1A have opposing effects on the fidelity of start codon selection // EMBO J. - 2007. -Vol. 26, N6. - P. 1602-1614.

79. Ferrer N., Garcia-Espana A., Jeffers M. et al. 1999. The unr gene: evolutionary considerations and nucleic acid-binding properties of its long isoform product // DNA Cell Biol. - 1999. - Vol. 18. - N3. - P. 209-218.

80. Ford P. J., Mathieson T., Rosbash M. Very long-lived messenger RNA in ovaries of Xenopus laevis // Dev Biol. -1977. - Vol. 57, N2. - P. 417-426.

81. Gahura O., Abrhâmovâ K., Skruzny M. Prp45 affects Prp22 partition in spliceosomal complexes and splicing efficiency of non-consensus substrates //J. Cell Biochem. 2009. - Vol. 106, N1. - P. 139-151.

82. Gaudreault I., Guay D., Lebel M. YB-1 promotes strand separation in vitro of duplex DNA containing either mi-spaired bases or cisplatin modifications, exhibits en-donucleolytic activities and binds several DNA repair proteins // Nucleic Acids Res. - 2004. - Vol. 32, N1. -P. 316-327.

83. Gebauer F., Corona D. F., Preiss T. et al. Translational control of dosage compensation in Drosophila by Sex-lethal: cooperative silencing via the 5' and 3' UTRs of msl-2 mRNA is independent of the poly(A) tail // EMBO J. -1999. - Vol. 18, N21. - P. 6146-6154.

84. Gessner C., Woischwill C., Schumacher A. et al. Nuclear YB-1 expression as a negative prognostic marker in nons-mal cell lung cancer // Eur. Respir. J. - 2004. - Vol. 23, N1. - P. 14-19.

85. Gimenez-Bonafe, P., Fedoruk, M. N., Whitmore, T. G. et al. YB-1 is unregulated during prostate cancer tumor progression and increase P-glycoprotein activity // Prostate. - 2004. - Vol. 59. - N 3. - P. 337-349.

86. GiorginiF., Davies H. G., Braun R. E. MSY2 and MSY4 bind a conserved sequence in the 3' untranslated region of protamine 1 mRNA in vitro and in vivo // Mol. Cell Biol. -2001. - Vol. 21, N 20. - P. 7010-7019.

87. Goldsmith M. E., Madden M. J., Morrow C. S., Cowan K. H. A Y-box consensus sequence is required for basal expression of the human multidrug resistance (mdr1) gene // J. Biol. Chem. — 1993. — Vol. 268, N8. — P. 5856-5860.

88. Gonda K., Fowler J., Katoku-Kikyo N. et al. Reversible disassembly of somatic nucleoli by the germ cell proteins FRGY2a and FRGY2b // Nat. Cell Biol. — 2003. — Vol. 5, N3. — P. 205-210.

89. Gonda K., Kikyo N. Nuclear remodeling assay in Xenopus egg extract. // Methods Mol. Biol. — 2006. — Vol. 348. — P. 247-258.

90. Grant C. E., Deeley R. G. Cloning and characterization of chicken YB-1: regulation of expression in the liver // Mol Cell Biol. — 1993. — Vol. 13, N7. — P. 4186-4196.

91. Graumann P., Wendrich T. M., Weber M. H. et al. A family of cold shock proteins in Bacillus subtilis is essential for cellular growth and for efficient protein synthesis at optimal and low temperatures // Mol. Microbiol. — 1997. — Vol. 25, N 4. — P. 741-756.

92. Graumann P. L., Marahiel M. A. A superfamily of proteins that contain the cold-shock domain // Trends Biochem. Sci. — 1998. — Vol. 23, N8. — P. 286-290.

93. Gu C., Oyama T., Osaki T. et al. Expression of Y box-binding protein-1 correlates with DNA topoisomerase Ilalpha and proliferating cell nuclear antigen expression in lung cancer // Anticancer Res. — 2001. — Vol. 21 (4A). — P. 2357-2362.

94. Gualerzi C. O., Giuliodori A. M., Pon C. L. Transcriptional and post-transcriptional control of cold-shock genes // J. Mol. Biol. — 2003. — Vol. 331, N 3. — P. 527-539.

95. Gurdon J. B., Brown D. D. Cytoplasmic regulation of RNA synthesis and nucleolus formation in developing embryos of Xenopus laevis // J. Mol. Biol. — 1965. — Vol. 12, N 1. — P. 27-35.

96. Hasegawa S. L., Doetsch P. W., Hamilton K. K. et al. DNA binding properties of YB-1 and dbpA: binding to double-stranded, single-stranded, and abasic site containing DNAs // Nucleic Acids Res. — 1991. — Vol. 19, N18. — P. 4915-4920.

97. Hayman M. L., Read L. K. Trypanosoma brucei RBP16 is a mitochondrial Y-box family protein with guide RNA binding activity // J. Biol. Chem. — 1999. — Vol. 274, N17. — P. 12067-12074.

98. Hellen C. U., Sarnow P. Internal ribosome entry sites in eukaryotic mRNA molecules // Genes Dev. — 2001. — Vol. 15, N 13. — P. 1593-1612.

99. Heo I., Joo C., Cho J. et al. 2008. Lin28 mediates the terminal uridylation of let-7 precursor microRNA // Mol. Cell. — Vol. 32, N 2. — P. 276-284.

100. Herbert T. P., Hecht N. B. The mouse Y-box protein, MSY2, is associated with a kinase on non-polysomal mouse testicular mRNAs // Nucleic Acids Res. — 1999. — Vol. 27, N7. — P. 1747-1753.

101. Higashi K., Inagaki Y., Fujimori K. et al. Interferon-gamma interferes with transforming growth factor-beta signaling through direct interaction of YB-1 with Smad3 // J. Biol. Chem. — 2003. — Vol. 278, N44. — P. 43470-43479.

102. Hillier B. J., Rodriguez H. M., Gregoret L. M. Coupling protein stability and protein function in Escherichia coli CspA // Fold Des. — 1998. — Vol. 3, N2. — P. 87-93.

103. Horn G., Hofweber R., Kremer W., et al. Structure and function of bacterial cold shock proteins // Cell Mol. Life Sci. — 2007. — Vol. 64. — P. 1457-1470.

104. Horwitz E. M., Maloney K. A., Ley T. J. A human protein containing a "cold shock" domain binds specifically to H-DNA upstream from the human gamma-globin genes // J. Biol. Chem. — 1994. — Vol. 269, N19. — P. 1413014139.

105. Hunt S. L., Hsuan J. J., TottyN., Jackson R. J. Unr, a cellular cytoplasmic RNA-binding protein with five cold-shock domains, is required for internal initiation of translation of human rhinovirus RNA // Genes Dev. — 1999. — Vol. 13, N4. — P. 437-448.

106. Irwin D., Kumar A., Malt R. A. Messenger ribonucleopro-tein complexes isolated with oligo(dT)-cellulose chromatography from kidney polysomes // Cell. — 1975. — Vol. 4, N2. — P. 157-165.

107. Ise T., Nagatani G., Imamura T. et al. Transcription factor Y-box binding protein 1 binds preferentially to cisplatin-modified DNA and interacts with proliferating cell nuclear antigen // Cancer Res. — 1999. — Vol. 59, N2. — P. 342346.

108. Ito K., Tsutsumi K., Kuzumaki T. et al. A novel growth-inducible gene that encodes a protein with a conserved cold-shock domain // Nucleic Acids Res. — 1994. — Vol. 22, N11. — P. 2036-2041.

109. Iuchi Y., Kobayashi T., Kaneko T. Expression of a Y-box protein, YB2/RYB-a, precedes protamine 2 expression during spermatogenesis in rodents // Mol. Hum. Re-prod. — 2001. — Vol. 7, N11. — P. 1023-31.

110. Jacquemin-Sablon H., Triqueneaux G., Deschamps S. et al. Nucleic acid binding and intracellular localization of unr, a protein with five cold shock domains // Nucleic Acids Res. — 1994. — Vol. 22, N13. — P. 2643-2650.

111. Jain S. K., Pluskal M. G., Sarkar S. Thermal chromatography of eukaryotic messenger ribonucleoprotein particles on oligo (dT)-cellulose. Evidence for common mRNA-associated proteins in various cell types // FEBS Lett. — 1979. — Vol. 97, N1. — P. 84-90.

112. Janz M., Harbeck N., Dettmar P. et al. Y-box factor YB-1 predicts drug resistance and patient outcome in breast cancer independent of clinically relevant tumor biologic factors HER2, uPA and PAI-1 //Int. J. Cancer. — 2002. — Vol. 97, N3. — P. 278-282.

113. Jiang W., Fang L., Inouye M. Complete growth inhibition of Escherichia coli by ribosome trapping with truncated cspA mRNA at low temperature // Genes Cells. — 1996. — Vol. 1, N11. — P. 965-976.

114. Jeffers M., PaciucciR., Pellicer A. Characterization of unr; a gene closely linked to N-ras // Nucleic Acids Res. — 1990. — Vol. 18. — P. 4891-4899.

115. Jones P. G., VanBogelen R. A., Neidhardt F. C. Induction of proteins in response to low temperature in Escherichia coli // J. Bacteriol. — 1987. — Vol. 169, N5. — P. 2092-2095.

116. Juan G., Pan W., Darzynkiewicz Z. DNA segments sensitive to single-strand-specific nucleases are present in chromatin of mitotic cells // Exp. Cell Res. — 1996. — Vol. 227, N2. — P. 197-202.

117. Jurchott K., Bergmann S., Stein U. et al. YB-1 as a cell cycle-regulated transcription factor facilitating cyclin A and cyclin B1 gene expression // J. Biol. Chem. — 2003. — Vol. 278, N30. — P. 27988-27996.

118. Kamura T., Yahata H., Amada S. et al. Is nuclear expression of Y box-binding protein-1 a new prognostic factor in ovarian serous adenocarcinoma? // Cancer. — 1999. — Vol. 85, N11. — P. 2450-2454.

119. Kandala J. C., Guntaka R. V. Cloning of Rous sarcoma virus enhancer factor genes. I. Evidence that RSV-EF-I is related to Y-box (inverted CCAAT) binding proteins and binds to multiple motifs in the RSV enhancer // Virology. — 1994. — Vol. 198, N2. — P. 514-523.

120. Kandror K. V., Stepanov A. S. RNA-binding protein kinase from amphibian oocytes is a casein kinase II // FEBS Lett. — 1984. — Vol. 170, N1. — P. 33-37.

121. Karlson D., Imai R. Conservation of the cold shock domain protein family in plants // Plant Physiol. — 2003. — Vol. 131, N1. — P. 12-15.

122. Kelley R. L., Wang J., Bell L. et al. Sex lethal controls dosage compensation in Drosophila by a non-splicing mechanism // Nature. — 1997. — Vol. 387, N6629. — P. 195-199.

123. Kick D., Barrett P., Cummings A., Sommerville J. Phosphorylation of a 60 kDa polypeptide from Xenopus oocytes blocks messenger RnA translation // Nucleic Acids Res. — 1987. — Vol. 15, N10. — P. 4099-4109.

124. Kloks C. P., Spronk C. A., Lasonder E. et al. The solution structure and DNA-binding properties of the cold-shock domain of the human Y-box protein YB-1 // J. Mol. Biol. —

2002. — Vol. 316, N2. — P. 317-326.

125. Kohno K., Izumi H., Uchiumi T. et al. The pleiotropic functions of the Y-box-binding protein, YB-1 // BioEssays. —

2003. — Vol. 25, N 7. — P. 691-698.

126. Kohwi-Shigematsu T., Kohwi Y. Poly(dG)-poly(dC) sequences, under torsional stress, induce an altered DNA conformation upon neighboring DNA sequences // Cell. — 1985. — Vol. 43, N1. — P. 199-206.

127. Koike K., Uchiumi T., Ohga T. et al. Nuclear translocation of the Y-box binding protein by ultraviolet irradiation // FEBS Lett. — 1997. — Vol. 417, N3. — P. 390-394.

128. Kolluri R., Torrey T. A., Kinniburgh A. J. A CT promoter element binding protein: definition of a double-strand and a novel single-strand DNA binding motif // Nucleic Acids Res. — 1992. — Vol. 20, N1. — P. 111-116.

129. Kremer W., Schuler B., Harrieder S. et al. Solution NMR structure of the cold-shock protein from the hyperther-mophilic bacterium Thermotoga maritima // Eur. J. Biochem. — 2001. — Vol. 268, N9. — P. 2527-2539.

130. Kudo S., Mattei M. G., Fukuda M. Characterization of the gene for dbpA, a family member of the nucleic-acid-binding proteins containing a cold-shock domain // Eur. J. Biochem. — 1995. — Vol. 231, N 1. — P. 72-82.

131. Kumar A, Pederson T. Comparison of proteins bound to heterogeneous nuclear RNA and messenger RNA in HeLa cells // J. Mol. Biol. — 1975. — Vol. 96, N3. — P. 353365.

132. Ladomery M., Sommerville J. Binding of Y-box proteins to RNA: involvement of different protein domains // Nucleic Acids Res. — 1994. — Vol. 22, N25. — P. 5582-5589.

133. Landsman D. RNP-1, an RNA-binding motif is conserved in the DNA-binding cold shock domain // Nucleic Acids Res. — 1992. — Vol. 20, N 11. — P. 2861-2864.

134. Lasham A., Lindridge E., Rudert F. et al. Regulation of the human fas promoter by YB-1, Puralpha and AP-1 transcription factors // Gene. — 2000. — Vol. 252, N1-2. — P. 1-13.

135. Lasham A., Moloney S., Hale T. et al. The Y-box-binding protein, YB1, is a potential negative regulator of the p53 tumor suppressor // J. Biol. Chem. — 2003. — Vol. 278, N37. — P. 35516-35523.

136. Lenz J., Okenquist S. A., LoSardo J. E. et al. Identification of a mammalian nuclear factor and human cDNA-encoded proteins that recognize DNA containing apurinic sites // Proc. Natl. Acad. Sci. — 1990. — Vol. 87, N 9. — P. 3396-3400.

137. Leshkowitz D., Rozenblatt O., Nakamura T. et al. ALL-1 interacts with unr, a protein containing multiple cold shock domains // Oncogene. — 1996. — Vol. 13. — P. 20272031.

138. Levine A. J. p53, the cellular gatekeeper for growth and division // Cell. — 1997. — Vol. 88, N3. — P. 323-331.

139. Li J., Hawkins I. C., Harvey C. D. et al. Regulation of alternative splicing by SRrp86 and its interacting proteins // Mol. Cell Biol. — 2003. — Vol. 23, N21. — P. 7437-7447.

140. Li W. W., Hsiung Y., Wong V. et al. Suppression of grp78 core promoter element-mediated stress induction by the dbpA and dbpB (YB-1) cold shock domain proteins //Mol. Cell Biol. — 1997. — Vol. 17, N1. — P. 61-68.

141. Lima W. R., Parreira K. S., Devuyst O, et al., ZONAB promotes proliferation and represses differentiation of proximal tubule epithelial cells // J. Am. Soc. Nephrol. — 2010. — Vol. 21, N3. — P. 478-488.

142. Lloberas J., MakiR. A., Celada A. Repression of major histocompatibility complex I-A beta gene expression by dbpA and dbpB (mYB-1) proteins // Mol. Cell Biol. — 1995. — Vol. 15, N9. — P. 5092-5099.

143. Lindberg U., Sundquist B. Isolation of messenger ribo-nucleoproteins from mammalian cells // J. Mol. Biol. — 1974. — Vol. 86, N2. — P. 451-468.

144. Lorentzen E., Basquin J., Tomecki R. et al. Structure of the active subunit of the yeast exosome core, Rrp44: diverse modes of substrate recruitment in the Rnase II nuclease family // Mol. Cell. — 2008. — Vol. 29. — P. 717-728.

145. Lu Z. H., Books J. T., Ley T. J. YB-1 is important for late-stage embryonic development, optimal cellular stress responses, and the prevention of premature senescence // Mol. Cell. Biol. — 2005. — Vol. 25, N 11. — P. 4625-4637.

146. Lu Z. H., Books J. T., Ley T. J. Cold shock domain family members YB-1 and MSY4 share essential functions during murine embryogenesis // Mol. Cell. Biol. — 2006. — Vol. 26, N. 22. — P. 8410-8417.

147. MacDonald G. H., Itoh-LindstromY., Ting J. P. The transcriptional regulatory protein, YB-1, promotes single-stranded regions in the DRA promoter // J. Biol. Chem. — 1995. — Vol. 270, N8. — P. 3527-3533.

148. Makino Y., Ohga T., Toh S. et al. Structural and functional analysis of the human Y-box binding protein (YB-1) gene promoter // Nucleic Acids Res. — 1996. — Vol. 24, N10. — P. 1873-1878.

149. ManiA., Gupta D. K. Molecular Phylogeny of Y-Box Proteins and their Cold Shock Domains // Internet J. Genom. Proteomics. — 2010. — Vol. 5, N2. — P. 1540-2630.

150. Manival X., Ghisolfi-Nieto L., Joseph G. et al. RNA-binding strategies common to cold-shock domain- and RNA recognition motif-containing proteins // Nucleic Acids Res. — 2001. — Vol. 29, N11. — P. 2223-2233.

151. Marello K., LaRovere J., Sommerville J. Binding of Xenopus oocyte masking proteins to mRNA sequences // Nucleic Acids Res. — 1992. — Vol. 20, N21. — P. 55935600.

152. Marenstein D. R., Ocampo M. T.,Chan M. K. et al. Stimulation of human endonuclease III by Y box-binding protein 1 (DNA-binding protein B). Interaction between a base excision repair enzyme and a transcription factor // J. Biol. Chem. — 2001. — Vol. 276, N24. — P. 2124221249.

153. Matsumoto K., Meric F., Wolffe A. P. Translational repression dependent on the interaction of the Xenopus Y-box protein FRGY2 with mRNA. Role of the cold shock domain, tail domain, and selective RNA sequence recognition // J. Biol. Chem. — 1996. — Vol. 271, N37. — P. 2270622712.

154. Matsumoto K., Wolffe A. P. Gene regulation by Y-box proteins: coupling control of transcription and translation // Trends Cell Biol. — 1998. — Vol. 8, N8. — P. 318-323.

155. Matsumoto K., Tanaka K. J., Aoki K. et al. Visualization of the reconstituted FRGY2-mRNA complexes by electron microscopy // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 2003. — Vol. 306, N1. — P. 53-58.

156. Matsumoto K., Bay B. H. Significance of the Y-box protein in human cancer // Mol. Gen. Med. — 2005. — Vol. 1, N1. — P. 11-17.

157. Meric F., Matsumoto K., Wolffe A. P. Regulated unmasking of in vivo synthesized maternal mRNA at oocyte maturation. A role for the chaperone nucleoplasmin // J. Biol. Chem. — 1997. — Vol. 272, N19. — P. 1284012846.

158. Mertens P. R., Steinmann K., Alfonso-Jaume M. A. et al. Combinatorial interactions of p53, activating protein-2, and YB-1 with a single enhancer element regulate gelatinase A expression in neoplastic cells // J. Biol. Chem. —

2002. — Vol. 277, N28. — P. 24875-24882.

159. Mihailovich M., Militti C., Gabaldon T., Gebauer F. Eukary-otic cold shock domain proteins: highly versatile regulators of gene expression // BioAssays. 2010. — Vol. 32, N2.

— P. 109-118.

160. Minich W. B., OvchinnikovL. P. Role of cytoplasmic mRNP proteins in translation // Biochimie. — 1992. — Vol. 74, N5. — P. 477-483.

161. Minich W. B., Maidebura I. P., Ovchinnikov L. P. Purification and characterization of the major 50-kDa repressor protein from cytoplasmic mRNP of rabbit reticulocytes // Eur. J. Biochem. — 1993. — Vol. 212, N 3. — P. 633-638.

162. Mitchell S. A., Brown E. C., Coldwell M. J. et al. Protein factor requirements of the Apaf-1 internal ribosome entry segment: roles of polypyrimidine tract binding protein and upstream of N-ras // Mol. Cell Biol. — 2001. — Vol. 21, N10. — P. 3364-3374.

163. Mitchell S. A., Spriggs K. A., Coldwell M. J. et al. The Apaf-1 internal ribosome entry segment attains the correct structural conformation for function via interactions with PTB and unr //Mol. Cell. — 2003. — Vol. 11, N3. — P. 757-771.

164. Morel C., Kayibanda B., Scherrer K. Proteins associated with globin messenger RNA in avian erythroblasts: Isolation and comparison with the proteins bound to nuclear messenger-likie RNA // FEBS Lett. — 1971. — Vol. 18, N1.

— P. 84-88.

165. Morel C., Gander E. S., Herzberg M. et al. The duck-globin messenger-ribonucleoprotein complex. Resistance to high ionic strength, particle gel electrophoresis, composition and visualisation by dark-field electron microscopy // Eur. J. Biochem. — 1973. — Vol. 36, N2. — P. 455-464.

166. Moss E. G., Lee R. C., Ambros V. The cold shock domain protein LIN-28 controls developmental timing in C. ele-gans and is regulated by the lin-4 RNA // Cell. — 1997. — Vol. 88, N5. — P. 637-646.

167. MossE. G., TangL. Conservation of the heterochronic regulator Lin-28, its developmental expression and microRNA complementary sites // Dev. Biol. — 2003. — Vol. 258, N2.

— P. 432-442.

168. Mueller U., Perl, D., Schmid F. X., Heinemann U. Thermal stability and atomic-resolution crystal structure of the Bacillus caldolyticus cold shock protein // J. Mol. Biol. — 2000. — Vol. 297, N4. — P. 975-988.

169. Murray M. T., Krohne G., Franke W. W. Different forms of soluble cytoplasmic mRNA binding proteins and particles in Xenopus laevis oocytes and embryos // J. Cell Biol. — 1991. — Vol. 112, N1. — P. 1-11.

170. MurrayM. T., SchillerD. L., Franke W. W. Sequence analysis of cytoplasmic mRNA-binding proteins of Xenopus oocytes identifies a family of RNA-binding proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. — 1992. — Vol. 89, N1. — P. 11-15.

171. Murray M. T. Nucleic acid-binding properties of the Xenopus oocyte Y box protein mRNP3+4 // Biochemistry. — 1994. — Vol. 33, N46. — P. 13910-13917.

172. Murzin A. G. OB(oligonucleotide/oligosaccharide bind-ing)-fold: common structural and functional solution for non-homologous sequences // EMBO J. — 1993. — Vol. 12, N3. — P. 861-867.

173. Nekrasov M. P., Ivshina M. P., Chernov K. G. et al. The mR-NA-binding protein YB-1 (p50) prevents association of the eukaryotic initiation factor eIF4G with mRNA and inhibits protein synthesis at the initiation stage // J. Biol. Chem. —

2003. — Vol. 278, N16. — P. 13936-13943.

174. Neuhaus K., Rapposch S., Francis K. P., Scherer S. Restart of exponential growth of cold-shocked Yersinia enterocolitica occurs after down-regulation of cspAl/ A2 mRNA // J. Bacteriol. - 2000. - Vol. 182, N11. -P. 3285-3288.

175. Newkirk K., Feng W., Jiang W. et al. Solution NMR structure of the major cold shock protein (CspA) from Escherichia coli: identification of a binding epitope for DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. - 1994. - Vol. 91, N11. - P. 51145118.

176. Oda Y., Sakamoto A., Shinohara N. et al. Nuclear expression of YB-1 protein correlates with P-glycoprotein expression in human osteosarcoma // Clin. Cancer Res. -1998. - Vol. 4, N9. - P. 2273-2277.

177. Oda Y., Ohishi Y., Saito T. et al. Nuclear expression of Y-box-binding protein-1 correlates with P-glycoprotein and topoisomerase II alpha expression, and with poor prognosis in synovial sarcoma // J. Pathol. - 2003. - Vol. 199, N2. - P. 251-258.

178. Oddone A., Lorentzen E., Basquin J. et al. Structural and biochemical characterization of the yeast exosome component Rrp40 // EMBO Rep. - 2007. - Vol. 8, N1. -P. 63-69.

179. Ohga T., Koike K., Ono M. et al. Role of the human Y box-binding protein YB-1 in cellular sensitivity to the DNA-dam-aging agents cisplatin, mitomycin C, and ultraviolet light // Cancer Res. - 1996. - Vol. 56, N18. - P. 4224-4228.

180. Ohga T., Uchiumi T., Makino Y. et al. Direct involvement of the Y-box binding protein YB-1 in genotoxic stress-induced activation of the human multidrug resistance 1 gene // J. Biol. Chem. - 1998. - Vol. 273, N11. - P. 5997-6000.

181. Okamoto T., Izumi H., Imamura T. et al. Direct interaction of p53 with the Y-box binding protein, YB-1: a mechanism for regulation of human gene expression // Oncogene. -2000. - Vol. 19, N54. - P. 6194-202.

182. Ozer J., Faber M., Chalkley R.,Sealy L. Isolation and characterization of a cDNA clone for the CCAAT transcription factor EFIA reveals a novel structural motif // J. Biol. Chem. - 1990. - Vol. 265, N 36. - P. 2214322152.

183. Patalano S, Mihailovich M, Belacortu Y, et al. Dual sex-specific functions of Drosophila upstream of N-ras in the control of X chromosome dosage compensation // Development. - 2009. - Vol. 136, N4. - P. 689-698.

184. Patel G. P., Ma S., Bag J. The autoregulatory translational control element of poly(A)-binding protein mRNA forms a heteromeric ribonucleoprotein complex // Nucleic Acids Res. - 2005. - Vol. 33, N22. - P. 7074-7089.

185. Pelletier M., Read L. K. RBP16 is a multifunctional gene regulatory protein involved in editing and stabilization of specific mitochondrial mRNAs in Trypanosoma brucei // RNA. - 2003. - Vol. 9, N4. - P. 457-468.

186. Pisarev A. V., Skabkin M. A., Thomas A. A. et al. Positive and negative effects of the major mammalian messenger ribonucleoprotein p50 on binding of 40 S ribosomal sub-units to the initiation codon of beta-globin mRNA // J. Biol. Chem. - 2002. - Vol. 277, N18. - P. 15445-15451.

187. Preobrazhensky A. A., Spirin A. S. Informosomes and their protein components: the present state of knowledge // Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. - 1978. - Vol. 21. - P. 1-38.

188. Raffetseder U., Frye B., Rauen T. et al. Splicing factor SRp30c interaction with Y-box protein-1 confers nuclear YB-1 shuttling and alternative splice site selection // J. Biol. Chem. - 2003. - Vol. 278, N20. - P. 1824118248.

189. Raj G. V., Safak M., MacDonald G. H., Khalili K. Transcriptional regulation of human polyomavirus JC: evidence for a functional interaction between RelA (p65) and the Y-

box-binding protein, YB-1 // J. Virol. — 1996. — Vol. 70, N9. — P. 5944-5953.

190. Ranjan M., Tafuri S. R., Wolffe A. P. Masking mRNA from translation in somatic cells // Genes Dev. — 1993. — Vol. 7, N9. — P. 1725-1736.

191. Rapp T. B., Yang L., Conrad E. U. et al. RNA splicing mediated by YB-1 is inhibited by TLS/CHOP in human myxoid liposarcoma cells // J. OrthoP. Res. — 2002. — Vol. 20, N4. — P. 723-729.

192. Richter J. D., Smith L. D. Reversible inhibition of translation by Xenopus oocyte-specific proteins // Nature. — 1984. — Vol. 309, N5966. — P. 378-380.

193. Rodriguez H. M., Vu D. M., Gregoret L. M. Role of a solvent-exposed aromatic cluster in the folding of Escherichia coli CspA // Protein Sci. — 2000. — Vol. 9, N10. — P. 1993-2000.

194. Ruzanov P. V., Evdokimova V. M., Korneeva N. L. et al. Interaction of the universal mRNA-binding protein, p50, with actin: a possible link between mRNA and microfilaments // J. Cell Sci. — 1999. — Vol. 112 (Pt 20). — P. 3487-3496.

195. Rybak A, Fuchs H, Smirnova L. et al. A feedback loop comprising lin-28 and let-7 controls pre-let-7 maturation during neural stem-cell commitment // Nat. Cell Biol. — 2008. — Vol. 10. — P. 987-993.

196. Sasaki K., Kim M. H., Imai R. Arabidopsis cold shock domain protein 2 is a RNA chaperone that is regulated by cold and developmental signals // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 2007. — Vol. 364, N3. — P. 633-8.

197. Safak M., Gallia G. L., Khalili K. Reciprocal interaction between two cellular proteins, Puralpha and YB-1, modulates transcriptional activity of JCVCy in glial cells //Mol Cell Biol. — 1999. — Vol. 19, N4. — P. 2712-2723.

198. Safak M., Gallia G. L., Ansari S. A., Khalili K. Physical and functional interaction between the Y-box binding protein YB-1 and human polyomavirus JC virus large T antigen // J. Virol. — 1999. — Vol. 73, N12. — P. 10146-10157.

199. Safak M., Khalili K. Physical and functional interaction between viral and cellular proteins modulate JCV gene transcription // J. Neurovirol. — 2001. — Vol. 7, N4. — P. 288-292.

200. Saini P., Eyler D. E., Green R. et al. Hypusine-containing protein eIF5A promotes translation elongation // Nature. — 2009. — Vol. 459, N7243. — P. 118-121.

201. Saji H., Toi M., Saji S. et al. Nuclear expression of YB-1 protein correlates with P-glycoprotein expression in human breast carcinoma // Cancer Lett. — 2003. — Vol. 190, N2. — P. 191-197.

202. Sawaya B. E., Khalili K., Amini S. Transcription of the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) promoter in central nervous system cells: effect of YB-1 on expression of the HIV-1 long terminal repeat // J. Gen. Virol. — 1998. — Vol. 79 (Pt 2). — P. 239-246.

203. Schepens B., Tinton S. A., Bruynooghe Y. et al. A role for hnRNP C1/C2 and Unr in internal initiation of translation during mitosis // EMBO J. — 2007. — Vol. 26. — P. 158-169.

204. Shibao K., Takano H., Nakayama Y. et al. Enhanced coex-pression of YB-1 and DNA topoisomerase II alpha genes in human colorectal carcinomas // Int. J. Cancer. — 1999. — Vol. 83, N6. — P. 732-737.

205. Schindelin H., Marahiel M. A., Heinemann U. Universal nucleic acid-binding domain revealed by crystal structure of the B. subtilis major cold-shock protein // Nature. — 1993. — Vol. 364, N6433. — P. 164-168.

206. Schindelin H., Jiang W., Inouye M., Heinemann U. Crystal structure of CspA, the major cold shock protein of Escherichia coli // Proc. Natl. Acad. Sci. 1994. — Vol. 91, N11. — P. 5119-5123.

207. Schindler T., Perl D., Graumann P. et al. Surface-exposed phenylalanines in the RNP1/RNP2 motif stabilize the cold-shock protein CspB from Bacillus subtilis // Proteins. — 1998. — Vol. 30, N4. — P. 401-406.

208. Schittek B., Psenner K., Sauer B. et al. The increased expression of Y box-binding protein 1 in melanoma stimulates proliferation and tumor invasion, antagonizes apoptosis and enhances chemoresistance // Int. J. Cancer. — 2007. — Vol. 120, N10. — P. 2110-2118.

209. Schnuchel A., Wiltscheck R., Czisch M. et al. Structure in solution of the major cold-shock protein from Bacillus subtilis // Nature. — 1993. — Vol. 364, N6433. — P. 169171.

210. Schrader R, Young C, Kozian D, et al. 2006. Temperature-sensitive eIF5A mutant accumulates transcripts targeted to the nonsense-mediated decay pathway // J. Biol. Chem. — 2006. — Vol. 281, N46. — P. 35336-35346.

211. Shibahara K., Sugio K., Osaki T. et al. Nuclear expression of the Y-box binding protein, YB-1, as a novel marker of disease progression in non-small cell lung cancer // Clin. Cancer Res. — 2001. — Vol. 7, N10. — P. 3151-3155.

212. Shibao K., Takano H., Nakayama Y. et al. Enhanced coex-pression of YB-1 and DNA topoisomerase II alpha genes in human colorectal carcinomas // Int. J. Cancer. — 1999. — Vol. 83, N6. — P. 732-737.

213. Shannon M. F., Coles L. S., Attema J., Diamond P. The role of architectural transcription factors in cytokine gene transcription // J. Leukoc. Biol. — 2001. — Vol. 69, N1. — P. 21-32.

214. Shnyreva M., Schullery D. S, Suzuki H. et al. Interaction of two multifunctional proteins. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K and Y-box-binding protein // J. Biol. Chem. — 2000. — Vol. 275, N20. — P. 15498-15503.

215. Skabkin M. A., Evdokimova V. M., Thomas A. A., Ovchinnikov L. P. The major messenger ribonucleoprotein particle protein p50 (YB-1) promotes nucleic acid strand annealing // J. Biol. Chem. — 2001. — Vol. 276, N48. — P. 44841-44847.

216. Skabkina O. V., Skabkin M. A., Popova N. V. et al. Poly(A)-binding protein positively affects YB-1 mRNA translation through specific interaction with YB-1 mRNA // J. Biol. Chem. — 2003. — Vol. 278, N20. — P. 18191-18198.

217. Sommerville J. RNA-binding phosphoproteins and the regulation of maternal mRNA in Xenopus // J. Reprod. Fertil Suppl. — 1990. — Vol. 42. — P. 225-233.

218. Sommerville J., Baird J., Turner B. M. Histone H4 acety-lation and transcription in amphibian chromatin // J. Cell Biol. — 1993. — Vol. 120, N2. — P. 277-290.

219. Sommerville J., Ladomery M. Masking of mRNA by Y-box proteins // FASEB J. — 1996. — Vol. 10, N4. — P. 435443.

220. Sommerville J. Activities of cold-shock domain proteins in translation control // Bioessays. — 1999. — Vol. 21, N4. — P. 319-325.

221. Soop T., Nashchekin D., Zhao J. et al. A p50-like Y-box protein with a putative translational role becomes associated with pre-mRNA concomitant with transcription // J. Cell Sci. — 2003. — Vol. 116 (Pt 8). — P. 1493-1503.

222. Spitkovsky D. D., Royer-Pokora B., Delius H. et al. Tissue restricted expression and chromosomal localization of the YB-1 gene encoding a 42 kD nuclear CCAAT binding protein // Nucleic Acids Res. — 1992. — Vol. 20, N4. — P. 797-803.

223. Stein U., Jurchott K., Walther W. et al. Hyperthermia-in-duced nuclear translocation of transcription factor YB-1 leads to enhanced expression of multidrug resistance-related ABC transporters // J. Biol. Chem. — 2001. — Vol. 276, N30. — P. 28562-28569.

224. Stenina O. I., Shaneyfelt K. M., DiCorleto P. E. Thrombin induces the release of the Y-box protein dbpB from mRNA: a mechanism of transcriptional activation // Proc. Natl. Acad. Sci. — 2001. — Vol. 98, N13. — P. 7277-7282.

225. Stickeler E., Fraser S. D., Honig A. et al. The RNA binding protein YB-1 binds A/C-rich exon enhancers and stimulates splicing of the CD44 alternative exon v4 // EMBO J. — 2001. — Vol. 20, N14. — P. 3821-3830.

226. Svitkin Y. V., OvchinnikovL. P., Dreyfuss G., Sonenberg N. General RNA binding proteins render translation cap dependent // EMBO J. — 1996. — Vol. 15, N24. — P. 71477155.

227. Swamynathan S. K., Nambiar A., Guntaka R. V. Role of single-stranded DNA regions and Y-box proteins in transcriptional regulation of viral and cellular genes // FASEB J. — 1998. — Vol. 12, N7. — P. 515-522.

228. Tafuri S. R., Wolffe A. P. Xenopus Y-box transcription factors: molecular cloning, functional analysis and developmental regulation // Proc. Natl. Acad. Sci. — 1990. — Vol. 87, N22. — P. 9028-9032.

229. Tafuri S. R., Wolffe A. P. DNA binding, multimerization, and transcription stimulation by the Xenopus Y box proteins in vitro // New Biol. — 1992. — Vol. 4, N4. — P. 349-359.

230. Tafuri S. R., Wolffe A. P. Dual roles for transcription and translation factors in the RNA storage particles of Xeno-pus oocytes // Trends Cell Biol. — 1993. — Vol. 3, N3. — P. 94-98.

231. Tanaka T., Kondo S., Iwasa Y. et al. Expression of stress-response and cell proliferation genes in renal cell carcinoma induced by oxidative stress // Am. J. Pathol. — 2000. — Vol. 156, N6. — P. 2149-2157.

232. Theobald D. L., Cervantes R. B., Lundblad V., Wuttke D. S. Homology among telomeric end-protection proteins // Structure. — 2003. — Vol. 11, N 9. — P. 1049-1050.

233. Tinton S. A., Schepens B., Bruynooghe Y. et al. Regulation of the cell-cycle-dependent internal ribosome entry site of the PITSLRE protein kinase: roles of Unr (upstream of N-ras) protein and phosphorylated translation initiation factor eIF-2alpha // Biochem J. — 2005. — Vol. 385 (Pt1). — P. 155-163.

234. Toh S., Nakamura T., Ohga T. et al. Genomic organization of the human Y-box protein (YB-1) gene // Gene. — 1998. — Vol. 206, N 1. — P. 93-97.

235. Triqueneaux G., Velten M., Franzon P. et al. RNA binding specificity of Unr, a protein with five cold shock domains // Nucleic Acids Res. — 1999. — Vol. 27, N8. — P. 19261934.

236. Uchiumi T., Kohno K., Tanimura H. et al. Enhanced expression of the human multidrug resistance 1 gene in response to UV light irradiation // Cell Growth Differ. — 1993. — Vol. 4, N3. — P. 147-157.

237. Uramoto H., Izumi H., Ise T. et al. p73 Interacts with c-Myc to regulate Y-box-binding protein-1 expression // J. Biol. Chem. — 2002. — Vol. 277, N 35. — P. 31694-31702.

238. Wang H. W., Wang J., Ding F. et al. Architecture of the yeast Rrp44 exosome complex suggests routes of RNA recruitment for 3' end processing // Proc. Natl. Acad. Sci. — 2007. — Vol. 104, N 43. — P. 16844-16849.

239. Wang N., Yamanaka K., Inouye M. Acquisition of double-stranded DNA-binding ability in a hybrid protein between Escherichia coli CspA and the cold shock domain of human YB-1 // Mol. Microbiol. — 2000. — Vol. 38, N3. — P. 526-534.

240. Weber M. H., Beckering C. L., Marahiel M. A. Complementation of cold shock proteins by translation initiation factor IF1 in vivo // J. Bacteriol. — 2001. — Vol. 183, N24. — P. 7381-7386.

241. Wistow G. Cold shock and DNA binding // Nature. — 1990. — Vol. 344, N6269. — P. 823-824.

242. Wolffe A. P., Tafuri S., Ranjan M., Familari M. The Y-box factors: a family of nucleic acid binding proteins conserved from Escherichia coli to man // New Biol. — 1992. — Vol. 4, N4. — P. 290-298.

243. Wolffe A. P. Structural and functional properties of the evolutionary ancient Y-box family of nucleic acid binding proteins //Bioessays. — 1994. — Vol. 16, N4. — P. 245-251.

244. Wolffe A. P., Meric F. Coupling transcription to translation: a novel site for the regulation of eukaryotic gene expression // Int. J. Biochem. Cell Biol. — 1996. — Vol. 28, N3. — P. 247-257.

245. WuL., Belasco J. G. Micro-RNA regulation of the mammalian lin-28 gene during neuronal differentiation of embryonal carcinoma cells // Mol. Cell Biol. — 2005. — Vol. 25, N21. — P. 9198-9208.

246. Xia B., Etchegaray J. P., Inouye M. Nonsense mutations in cspA cause ribosome trapping leading to complete growth inhibition and cell death at low temperature in Escherichia coli // J. Biol. Chem. — 2001. — Vol. 276, N38.

— P. 35581-35588.

247. Yamanaka K., Fang L., Inouye M. The CspA family in Escherichia coli: multiple gene duplication for stress adaptation // Mol Microbiol. — 1998 — Vol. 27, N2. — P. 247-255.

248. Yamanaka K., Inouye M. Selective mRNA degradation by polynucleotide phosphorylase in cold shock adaptation in Escherichia coli // J. Bacteriol. — 2001. — Vol. 183, N9.

— P. 2808-2816.

249. Yamanaka K., Inouye M. Induction of CspA, an E. coli major cold-shock protein, upon nutritional upshift at 37 degrees C // Genes Cells. — 2001. — Vol. 6, N4. — P. 279-290.

250. Yokoyama H., Harigae H., Takahashi S. et al. Regulation of YB-1 gene expression by GATA transcription factors // Biochem Biophys Res Commun. — 2003. — Vol. 303, N1.

— P. 140-145.

251. Yu J., Hecht N. B., Schultz R. M. Expression of MSY2 in mouse oocytes and preimplantation embryos //Biol. Re-prod. — 2001. — Vol. 65, N4. — P. 1260-1270.

252. Yu J., Hecht N. B., Schultz R. M. RNA-binding properties and translation repression in vitro by germ cell-specific MSY2 protein // Biol. Reprod. — 2002. — Vol. 67, N4. — 1093-1098.

253. Yu Y., Marintchev A., Kolupaeva V. G. et al. Position of eukaryotic translation initiation factor eIF1A on the 40S ribosomal subunit mapped by directed hydroxyl radical probing // Nucleic Acids Res. — 2009. — Vol. 37, N. 15. — P. 5167-5182.

254. Zangrossi S., Briani, F., Ghisotti, D. et al. Transcriptional and post-transcriptional control of polynucleotide phos-phorylase during cold acclimation in Escherichia coli // Mol. Microbiol. — 2000. — Vol. 36, N6. — P. 1470-1480.

255. van Venrooij W. J., van Eekelen C. A., Jansen R. T., Prin-cen J. M. Specific poly-A-binding protein of 76,000 molecular weight in polyribosomes is not present on poly A of free cytoplasmic mRNP // Nature. — 1977. — Vol. 270, N5633. — P. 189-191.

256. Vogt P. K., Hart J. R., Gymnopoulos M. et al. Phos-phatidylinositol 3-kinase: the oncoprotein // Curr. Top. Microbiol. Immunol. — 2010. — Vol. 347, N. — P. 79-104.

257. Zasedateleva O. A., KrylovA. S., Prokopenko D. V. et al. Specificity of mammalian Y-box binding protein p50 in interaction with ss and ds DNA analyzed with generic oligonucleotide microchip // J. Mol. Biol. — 2002. — Vol. 324, N1. — P. 73-87.

258. Zhang Y. F., Homer C., Edwards S. J. et al. Nuclear localization of Y-box factor YB1 requires wild-type p53 // Oncogene. — 2003. — Vol. 22, N 18. — P. 2782-2794.

DEVELOPMENT OF REPRESENTATIONS ABOUT THE COLD SHOCK DOMAIN PROTEINS. APPLICATION PROSPECTS IN MEDICINAL THERAPY

Vashchenkо V. I., Vilyaninov V. N., Shabanov P. D.

♦ Summary: Cold shock domain (CSD-containing) proteins have been found almost in all forms of life and their functions have been shown in a variety of processes that are related to posttranscriptional gene regulation. The CSD is an spatial p-barrel fold that serves to bind nucleic acids. The CSD is structurally and functionally similar to CspA the cold-shock protein (CSP) prokaryotic, and it is homologous to the primary sequence. This review summarizes the current knowledges on eukaryotic CSD domain with a emphasis on YB-1 and UNR. Ref. 258.

♦ Key words: cold-shock protein; cold-shock domein protein; cellular cold stress response; YB-1; UNR.

♦ Информация об авторах

Ващенко Владимир Иванович — д. б. н., с. н. с., НИО крови и тканей научно-исследовательского центра ВмедА. Санкт-Петербург, 194044, ул. акад. Лебедева, 6. E-mail: [email protected]

Вильянинов Владимир Николаевич — к. м. н., доцент, начальник НИО крови и тканей научно-исследовательского центра ВмедА. Санкт-Петербург, 194044, ул. акад. Лебедева, 6. E-mail: [email protected]

Шабанов Петр Дмитриевич — д. м. н., профессор, заведующий кафедрой фармакологии Военно-медицинской академии им. С. М. Кирова. Санкт-Петербург, 194044, ул. акад. Лебедева, 6. E-mail: [email protected]

Vashchenkc Vladimir Ivanovich — Doctor of Biological Sciences, Senior Researcher. Kirov Military Medical Academy. St.Petersburg, 194044, Acad. Lebedev street, 6, Russia. E-mail: [email protected]

Vilyaninov Vladimir Nikolaevich — PhD. Kirov Military Medical Academy, St. Petersburg, 194044, Acad. Lebedev street, 6, Russia. E-mail: [email protected]

Shabanov Petr Dmitrievich — Doctor of Medical Sciences, Professor, Head of the Dept. of Pharmacology. Kirov Military Medical Academy. St.Petersburg, 194044, Acad. Lebedev street, 6, Russia. E-mail: [email protected]