CC BY
67
УДК 628.394.6:582.26(262.5)
РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМЫ ОЦЕНКИ ТОКСИЧНОСТИ КОМПОНЕНТОВ ЭКОСИСТЕМ МОРСКИХ ВОДОЕМОВ НА ОСНОВЕ ФЛУОРИМЕТРИИ АБОРИГЕННЫХ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ
© 2012 г. Д. Ф. Афанасьев, И.Е. Цыбульский, А.А. Ларин, И.Г. Корпакова, М.А. Сазыкина, М.А. Морозова, С.П. Воловик
Афанасьев Дмитрий Федорович - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, лаборатория оценки последствий развития нефтегазового комплекса, Азовский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства, ул. Береговая, 21/2, г. Ростов н/Д, 344002; доцент, кафедра ботаники, Южный федеральный университет, ул. Б. Садовая, 105/42, г. Ростов н/Д, 344006, e-mail: Dafanas@mail.ru.
Цыбульский Игорь Евгеньевич - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, заведующий лабораторией оценки последствий развития нефтегазового комплекса, Азовский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства, ул. Береговая, 21/2, г. Ростов н/Д, 344002, e-mail: riasfp@aaanet.ru.
Ларин Андрей Александрович - кандидат химических наук, заведующий лабораторией аналитического контроля водных экосистем, Азовский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства, ул. Береговая, 21/2, г. Ростов н/Д, 344002, e-mail: Moch3@yandex.ru.
Корпакова Ирина Григорьевна - доктор биологических наук, старший научный сотрудник, заместитель директора, Азовский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства, ул. Береговая, 21/2, г. Ростов н/Д, 344002, e-mail: riasfp@aaanet.ru.
Сазыкина Марина Александровна - кандидат биологических наук, заведующая лабораторией промышленной микробиологии, Научно-исследовательский институт биологии Южного федерального университета, пр. Стачки, 194/1, г. Ростов н/Д, 344090, e-mail: submarinas@list.ru.
Afanasjev Dmitriy Fedorovich - Candidate of Biological Science, Leading Scientific Researcher, Laboratory of Estimation of Consequences of Development of Oil-and-Gas Bearing Complex, Azov Research Institute of Fish Industry, Beregovaya St., 21/2, Rostov-on-Don, 344002; Associate Professor, Department of Botany, Southern Federal University, B. Sadovaya St., 105/42, Rostov-on-Don, 344006, email: Dafanas@mail.ru.
Tsibulskiy Igor Evgenievich - Candidate of Biological Science, Senior Scientific Researcher, Head of the Laboratory of Estimation of Consequences of Development of Oil-and-Gas Bearing Complex, Azov Research Institute of Fish Industry, Beregovaya St., 21/2, Rostov-on-Don, 344002, e-mail: riasfp@aaanet.ru.
Larin Andrew Alexandrovich - Candidate of Chemical Science, Head of the Laboratory of Analytical Control ofAquat-ic Ecosystems, Azov Research Institute of Fish Industry, Beregovaya St., 21/2, Rostov-on-Don, 344002, e-mail: Moch3@yandex.ru.
Korpakova Irina Grigorjevna - Doctor of Biological Science, Senior Scientific Researcher, Deputy Director, Azov Research Institute of Fish Industry, Beregovaya St., 21/2, Rostov-on-Don, 344002, e-mail: riasfp@aaanet.ru.
Sazykina Marina Aleksandrovna - Candidate of Biological Science, Head of the Laboratory of Industrial Microbiology, Research Institute of Biology of Southern Federal University, Stachki Ave, 194/1, Rostov-on-Don, 344090, e-mail: submarinas@list.ru.
Морозова Марина Александровна — научный сотрудник, сектор болезней рыб, Азовский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства, ул. Береговая, 21/2, г. Ростов н/Д, 344002, e-mail: irbis-77@bk.ru.
Воловик Станислав Петрович — доктор биологических наук, профессор, Кубанский государственный университет, e-mail: Volovik@ice-group.ru.
Morozova Marina Aleksandrovna - Scientific Researcher, Sector of Fish Diseases, Azov Research Institute of Fish Industry, Beregovaya St., 21/2, Rostov-on-Don, 344002, e-mail: irbis-77@bk.ru.
Volovik Stanislav Petrovich - Doctor of Biological Science, Professor, Kuban State University, e-mail: Volovik@ice-group.ru.
Из воды Азовского и Черного морей выделено 5 чистых культур зеленых и сине-зеленых водорослей. По результатам исследований чувствительности культур к действию стандартных токсикантов — бихромату калия, сульфату меди и фенолу — отобраны 2 вида водорослей — Scenedesmus apiculatus и Snowella rosea. Изучены спектры поглощений и флуоресценции отобранных культур. Разработана методика определения токсичности воды и экстрактов донных отложений по изменению флуоресценции в коротковолновой части спектра.
Ключевые слова: биотестирование, микроводоросли, флуориметрия, токсичность, морские экосистемы.
Five clean cultures of green and blue-geen algae have been extracted from the water of the Sea ofAzov and Black Sea. The algae species Scenedesmus apiculatus and Snowella rosea have been selected as the result of sensitivity test to standard toxicants. Spectral characteristics of microalgae cultures have been explored. The identification method of water and bottom sediment compounds' toxicity by the change in the fluorescence intensiveness in violet and blue-violet spectra was elaborated.
Keywords: biotesting, microalgae, fluorimetria, toxicity, sea ecosystem.
В настоящее время особое значение приобретает разработка тест-систем для контроля состояния водной среды, которая подвергается хроническому антропогенному воздействию, связанному с поступлением в водоем комплекса токсикантов в концентрациях индивидуальных веществ на уровне предельно допустимых концентраций (ПДК) и ниже. Стандартными международными методами биотестирования морской воды, разработанными под эгидой ISO (International Standard Organization), являются тест-системы с использованием микроводорослей Phaeodactylum tricornutum и Skeletonema costatum [1]. В России принята система оперативного мониторинга Росгидромета, включающая методы оценки острой токсичности, измеряемой по выживаемости и подвижности дафний, двигательной активности бентосных беспозвоночных (пиявки, моллюски), флюоресценции водорослей [2].
Для тестов с использованием различных микроорганизмов (в частности, микроводорослей) требуются намного меньшие объемы проб и времени тестирования. Содержание запасных культур вследствие их редкого пересевания и низкой требовательности к условиям культивирования не требует больших затрат труда и средств. Водоросли, как и все автотрофы, играют жизненно важную роль в пищевой сети экосистемы. Нарушение токсинами их физиологической активности, равно как и самой структуры альгоценоза, имеет серьезные последствия для экосистем. Анализы на микроводорослях дают статистическое преимущество перед анализами с высшими организмами, так как можно легко использовать большее количество клеток. Процесс тестирования легко автоматизировать.
Методы исследования фитопланктона, основанные на измерении флуоресценции, находят широкое применение как в лабораторных условиях на экспериментальных культурах водорослей, так на водоемах, в полевых условиях. Измеряя флуоресценцию фитопланктона, можно рассчитать концентрацию хлорофилла у микроводорослей [3, 4].
Объектами исследования, кроме экстракта пигментов, могут служить живые клетки водорослей, что позволяет in vivo судить о физиологическом состоянии фитопланктона. Флуоресцентные методы обладают
относительно высокой чувствительностью и обеспечивают регистрацию динамики процессов. Эти методы предпочтительны в качестве первичных тестов и способны ответить на вопрос: присутствуют или нет в среде токсические агенты в концентрациях, опасных для живых организмов?
Антропогенные факторы, в частности загрязнение среды, оказывают влияние не только на формирование альгоценоза, но и на организацию пигмент-белковых комплексов фотосинтезирующих организмов, что может быть зарегистрировано флуоресцентными методами. В этом случае изменяются не только интегральные показатели флуоресценции (интенсивность флуоресценции и время ее затухания, на чем основано биотестирование большинством предложенных ранее методов), но и сами спектры флуоресценции. Изучая изменение спектров флуоресценции под воздействием определенных токсикантов, можно определить изменение их физиологического состояния и в конечном итоге оценить качество среды обитания гидробионтов. Отличительной особенностью разрабатываемого метода является использование микроводорослей, выделенных из экологически чистых районов Азовского и Черного морей, как наиболее адаптированных к среде исследуемых водоемов.
Материалы и методы исследований
Пробы воды и соскобы микроскопических водорослей с прибрежных камней для последующего выделения из них культур микроводорослей отбирали в период активной вегетации (май-июнь 2008 г.) основных видов микроводорослей в Азовском и Черном морях. Определение видов проводили по справочной литературе [5-8].
Для выделения и культивирования водорослей использовали 10 сред со специально подобранным составом. Среды подготавливались с учетом солености воды в районах отбора проб (от 10 до 17 %о). Для оптимизации развития отдельных видов микроводорослей культивирование проводили при различных температурах (15, 20 и 25 °С); апробировано несколько режимов освещения, а также выращивание как с до-
полнительной аэрацией (встряхивание колб 2-3 раза в день), так и без него. Вначале выращивали накопительные смешанные культуры микроводорослей, для чего к отобранным пробам добавляли среду Бристоля в модификации Голлербаха [9] и инкубировали их в течение недели. Полученные накопительные культуры стерильно высевали на чашки Петри с различными агаризованными питательными средами. Чашки помещали на свет и инкубировали до появления интенсивного роста водорослей. Далее из накопительной культуры с использованием микробиологических методов пересевов и разведений получали альгологиче-ски чистые культуры. Выделенные культуры выращивали на специально подобранной питательной среде, оптимально для них подходящей. Музейные культуры хранили в холодильнике с температурой 6 °С и постоянным слабым освещением 300 лк [9]. С целью проверки чистоты полученных культур водорослей делали посевы из жидких культур на агаризованные питательные среды.
Спектры люминесценции суспензии водорослей снимали на спектрофлуорофотометре RF-5301PC фирмы Shimadzu (Япония). Определение оптимальных условий измерения интенсивности люминесценции, используемой для регистрации отклика культур водорослей на воздействие токсикантов, проведено с помощью программы Panorama fluorescence 1.1 в режиме сканирования (2D synchro measurement), позволяющем провести анализ спектров возбуждения и люминесценции, их синхронизацию и выбрать длины волн с характерными максимумами возбуждения.
Методика определения токсичности отдельных соединений (а также биотестирования воды и экстрактов донных отложений) заключалась в исследовании спектров флуоресценции суспензии микроводорослей в норме (контроль) и при токсической нагрузке, вызванной внесением в среду исследуемого соединения либо тестируемой пробы.
Перспективные для биотестирования виды водорослей (Scenedesmus apiculatus, Snowella rosea) отбирали по результатам исследований чувствительности всех выделенных культур микроводорослей к действию стандартных токсикантов - бихромату калия, сульфату меди (концентрации от 0,0001 до 100 мг/л) и фенолу (5^-1500 мг/л). Параллельно отрабатывалась мето- у е-дика определения токсичности отдельных соединений и биотестирования проб воды и донных отложений, отобранных в морских водоемах.
Собственно методика тестирования включала получение суспензии культуры микроводорослей с оптической плотностью 0,200^-0,250 (при 15 /.=500 нм), экспозицию в течение 10-КЮ мин, флуориметрию контрольной суспензии водорослей (без токсиканта), раствора токсиканта без водорослей (либо тестируемой воды, экстракта) и 10 собственно суспензии водорослей с исследуемым веществом (пробой).
Результаты и их обсуждение
an) Gom. (= Phormidium laetevirens (Crouan et Gom.) Anagn. et Kom.), Oscillatoria Agardhii Gom. (= Planktothrix Agardhii (Gom.) Anagn. et Kom.), Snowella rosea (Snow), Oocystis borgei Snow и Scenedesmus apiculatus (W. et W.) Chod.
Были подобраны оптимальные условия их содержания в лаборатории, включающие культивирование на питательных средах Тамия, Ягужинского, Гусевой и Уолна при температуре 25 °С, интенсивности освещения 2500 лк (лампы дневного света) и периодическом перемешивании.
По результатам исследований спектров флуоресценции при токсической нагрузке отобраны наиболее чувствительные и перспективные для биотестирования виды водорослей - Scenedesmus apiculatus и Snowella rosea.
Для Scenedesmus apiculatus максимумы в спектрах возбуждения обнаружены при 220, 234 и 288 нм. При Хвозб = 220 нм в спектре флуоресценции зарегистрированы 2 максимума, при 330 и 360 нм. При X^g = 234 и 288 нм максимумы флуоресценции культуры водорослей были отмечены при 330 и 325 нм соответственно.
Для Snowella rosea максимумы в спектрах возбуждения обнаружены при 220, 288 и 340 нм. При длине волны возбуждения 220 и 288 нм максимумы флуоресценции культуры водорослей отмечены соответственно при 370 и 340 нм. При Хвозб = 340 нм отмечено 2 максимума флуоресценции - при 387 и 440 нм.
Исследования показали, что для регистрации спектров флуоресценции оптимально подходят суспензии клеток микроводорослей с оптической плотностью 0,200^0,250 (X=500 нм), которые готовили из выращенной заранее маточной культуры, фильтровали через мельничное капроновое сито (№10-Х) и разбавляли до указанной плотности чистой морской водой, профильтрованной через бактериальный фильтр.
Определение времени экспозиции суспензии Scenedesmus apiculatus в растворах бихромата калия в концентрациях до 10 мг/л показало, что отклонения спектров флуоресценции относительно контроля (суспензия без токсиканта) регистрируются уже через 10 мин, незначительно изменяются в последующие 20 мин и несколько снижаются через 60 мин экспозиции (рис. 1).
В результате выполненной работы из воды Азовского и Черного морей выделены 5 альголо-гически и бактериологически чистых культур аборигенных микроводорослей отделов Суапо-phyta и СЫогорЬуа: OscШatoria laetevirens (Сгои-
Для суспензии с Snowella rosea под воздействием того же токсиканта в концентрациях 0,1^10 мг/л зарегистрировано постепенное увеличение интенсивности люминесценции в процессе 10, 30 и 60 мин экспозиции (рис. 2).
Под воздействием высоких концентраций токсикантов (выше 10 мг/л) наблюдалось заметное тушение свечения, причем обнаруженный эффект не зависел от времени экспозиции.
Отклик культур микроводорослей на воздействие выбранных токсикантов исследовали, возбуждая свечение в области установленных для каждой водоросли максимумов. При этом регистрировали спектры флуоресценции, фиксируя изменения интенсивности свечения при установленных максимумах эмиссии.
В целом, как показали исследования, под влиянием K2Cr2O7 (0,01^10 мг/л) (ПДК 0,05 мг/л) интенсивность флуоресценции культуры Scenedesmus apiculatus снижалась до 45^50 % от контрольного уровня (в зависимости от времени экспозиции и условий флуориметрии).
Для культуры Snowella rosea в присутствии таких же концентраций K2Cr2O7 установлено увеличение интенсивности флуоресценции до 60 % (Хвозб=340 нм, ^эмисс=440 нм).
Более высокие концентрации K2Cr2O7 (на уровне 50^100 мг/л) на 45 - 99 % подавляли флуоресценцию обеих культур водорослей.
В растворах CuSO4 (0,01^10 мг/л) Scenedesmus apiculatus проявлял аналогичную чувствительность, о чем свидетельствовало снижение интенсивности флуоресценции (до 50 % от контроля). В растворе с концентрацией CuSO4 100 мг/л наблюдалось практически полное тушение флуоресценции суспензии Scenedesmus apiculatus.
Под влиянием низких концентраций CuSO4 (0,0001^1,0 мг/л) спектры флуоресценции Snowella rosea заметно не изменялись, максимальная индукция свечения (до 25 % от контроля) зарегистрирована при Хвозб= 220 нм и Хэмисс=370 нм. При этом выявлен эффект стимуляции флуоресценции клеток водорослей in vivo низкими концентрациями токсикантов.
При содержании в культуральной среде CuSO4 в концентрации 10 мг/л наблюдается стойкое тушение свечения (но не более чем на 25 %) во всех экспериментальных вариантах. Следовательно, чувствительность культуры Snowella rosea к CuSO4 была приблизительно в 2 раза ниже, чем Scenedesmus apiculatus.
Фенол в концентрации 5 мг/л ингибировал флуоресценцию Scenedesmus apiculatus на 10^55 %, а в растворе с содержанием фенола 50 мг/л тушение флуоресценции достигало 100 %.
Использование показателя ЕС50 (эффективная концентрация токсиканта, снижающая люминесценцию на 50 %) позволило сравнить чувствительность выделенных водорослей с чувствительностью биолюминесцентных бактерий Е. coli C600(pBA-5), Ph. phosphoreum (Cohn) Ford и выделенных ранее штаммов Vibrio fischeri ВКПМ В-9579 и Vibrio fischeri
Рис. 2. Спектр флуоресценции Snowella rosea в растворе бихромата калия (1,0 мг/л) в течение 10 - 60 мин экспозиции (1возб=340 нм)
ВКПМ В-9580 [10]. Полученные данные свидетельствуют, что по средним значениям ЕС50 Scenedesmus apiculatus и Snowella rosea чувствительней к фенолу в 25^60 раз, проявляют аналогичную чувствительность к K2Cr2O7, но уступают по чувствительности к CuSO4.
Разработка метода биотестирования экстрактов донных отложений с использованием микроводорослей в качестве биосенсоров заключалась в определении оптимальных соотношений грунт/экстрагент, объема вводимого в тест-систему экстракта, условий постановки реакции, калибрации методики. Исследования показали, что чистая морская вода, профильтрованная через бактериальный фильтр в весовом соотношении с грунтом 10:1 является эффективным растворителем адсорбированных донными отложениями токсикантов. Оптимальным является встряхивание проб на орбитальном шейкере при 65 об/мин при комнатной температуре в течение 1 ч с последующим отстаиванием до оседания взвеси и фильтрацией экстрактов через сифон (капроновая сеть № 76).
Метод биотестирования с использованием в качестве биосенсора аборигенной микроводоросли Scenedesmus apiculatus был успешно апробирован при исследованиях токсичности проб воды и донных отложений, отобранных в районах с высокой антропогенной нагрузкой.
Разработанная тест-система определения токсичности отличается от подобных систем высокой чувствительностью к токсикантам (возможна регистрация токсического эффекта токсиканта на уровне ПДК в воде рыбохозяйственных водоемов), экспресс-реакцией (результаты анализа регистрируются в 1 ч), низкой стоимостью анализа. Кроме того, свет, возбуждающий флуоресценцию, мало меняет физиологическое состояние нативного объекта, что позволяет минимизировать влияние условий эксперимента на получаемые результаты.
Разработанный метод биотестирования может применяться как для экспресс-оценки содержания токсических веществ в воде, так и для непрерывного контроля окружающей среды.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 08-04-99108).
Литература
1. Water quality - Algal growth inhibition test with Skele-tonema costatum and Phaeodactylum tricornutum : Draft International Standard ISO/DIS 10253.2. 1994. 12 p.
2. Никаноров А.М. Научные основы мониторинга качества вод. СПб., 2005. С. 117 - 124.
3. Гольд В.М., Гаевский Н.А., Шатров И.Ю., Попель-ницкий В.А., Рубцов С.А. Опыт использования флуоресценции для дифференциальной оценки содержания хлорофилла «а» у планктонных водорослей // Гидробиол. журн. 1986. Т. 22, № 3. С. 37 - 44.
4. Гаевский Н.А., Шатров И.Ю., Гольд В.М. Флуоресцентный анализ пигментов фитопланктона // Методические
Поступила в редакцию
вопросы изучения первичной продукции планктона внутренних водоемов. СПб., 1993. С. 48 - 53.
5. Еленкин А.А. Синезеленые водоросли СССР. Т. 1-3. М.;Л., 1936. 673 с.
6. Косинская Е.К. Определитель морских синезеленых водорослей. М.;Л., 1948. 278 с.
7. Зинова А.Д. Определитель зеленых, бурых и красных водорослей южных морей СССР. Л., 1967. 220 с.
8. Царенко П.М. Краткий определитель хлорококковых водорослей Украинской ССР. Киев, 1990. 208 с.
9. Экологическая физиология морских планктонных водорослей (в условиях культуры). Киев, 1971. С. 5 - 22.
10. Цыбульский И.Е., Сазыкина М.А. Новые биосенсоры для мониторинга токсичности среды на основе морских люминесцентных бактерий // Прикладная биохимия и микробиология. 2010. Т. 46, № 5. С. 1 - 6.
14 февраля 2012 г.
