CC BY
110
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Вадим Сергеевич Покровский', Дарья Александровна Филоненко2, Наталья Юрьевна Анисимова3, Наталья Владимировна Андронова4, Гермес Григорьевич Чилов5, Алексей Александрович Зейфман6, Денис Юрьевич Логунов7, Ирина Юрьевна Грибова8, Дарья Андреевна Бурмистрова9, Михаил Валентинович Киселевский'0, Андрей Альбертович Мещеряков'', Елена Михайловна Трещалина'2
РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМЫ IN VITRO/IN VIVO С ПАНРЕЗИСТЕНТНОЙ МУТАЦИЕЙ Т3Ш ДЛЯ ДОКЛИНИЧЕСКОГО ИЗУЧЕНИЯ ИНГИБИТОРОВ
ТИРОЗИНКИНАЗЫ BСR-ABL
' К. м. н., старший научный сотрудник, лаборатория комбинированной терапии опухолей, НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24) 2 Аспирант, отделение химиотерапии и комбинированного лечения злокачественных опухолей, НИИ клинической онкологии ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН (И5478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24) 3 Д. б. н., старший научный сотрудник, лаборатория клеточного иммунитета, НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН (И5478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24) 4 К. м. н., ведущий научный сотрудник, лаборатория комбинированной терапии опухолей, НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН (И5478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24) 5 Генеральный директор, ООО «Фьюжн Фарма» (И5530, РФ, г. Москва, ул. Генерала Дорохова, д. '8/2) 6 Аспирант, ФГБУ науки «Институт органической химии им. Н. Д. Зелинского» РАН (И9334, РФ, г. Москва, Ленинский проспект, д. 47) 7 Д. б. н., .заведующий, лаборатория клеточной микробиологии ФГБУ «НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи» Минздрава России
('23098, РФ, г. Москва, ул. Гамалеи, д. '8)
8 Младший научный сотрудник, лаборатория молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи»
Минздрава России ('23098, РФ, г. Москва, ул. Гамалеи, д. '8)
9 Аспирант, лаборатория молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи» Минздрава России
(РФ, г. Москва, '23098, ул. Гамалеи, д. '8) '0 Д. м. н., профессор, заведующий, лаборатория клеточного иммунитета, НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН (И5478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24) '' Д. м. н., старший научный сотрудник отделения химиотерапии и комбинированного лечения злокачественных опухолей НИИ клинической онкологии ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН (И5478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24) '2 Д. м. н., профессор, заведующая, лаборатория комбинированной терапии опухолей, НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН (И5478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)
Адрес для переписки: 115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24, НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН, лаборатория комбинированной терапии опухолей, Покровский Вадим Сергеевич; e-mail: vadimpokrovsky@yandex.ru
С помощью рекомбинантных лентивирусных векторов LM-CMV, несущих ген Bci-Abl и ген Bci-Abl с верифицированной с помощью полимеразной цепной реакции транзиентной мутацией T315I, получена линия про-В-клеточного лейкоза BaF3-Bcr-Abl T315I с панрезистентностью к иматинибу, сохраняющая в отсутствие интерлейкина-3 пролиферативную активность in vitro в течение как минимум 20 пассажей.
На основе BaF3-Bcr-Abl T315I получен стабильный перевиваемый штамм, дающий подкожные ксено-графты у мышей Balb/c nude с латентным периодом роста 5—7 дней и периодом достижения среднего объема ^ср), равного 100 мм3, 10—14 дней. Показана чувствительность модели in vitro и in vivo к преодолевающему панрезистентность ингибитору Bcr-Abl понатинибу на фоне отсутствия чувствительности к иматинибу in vivo. Полученная модель может быть использована in vitro и на первом пассаже in vivo для поиска новых лекарственных препаратов, способных преодолевать резистентность опухолей с мутацией T315I в гене Bcr-Abl.
Ключевые слова: тирозинкиназа Bcr-Abl, мутация, доклиническая модель.
Белок Bcr-Abl, продукт экспрессии мутантного гена, входящего в состав филадельфийской хромосомы, приводит к активации путей внутриклеточной передачи пролиферативного сигнала и является ключевым патогенетическим фактором развития хронического миело-лейкоза. Использование различных механизмов блокады передачи сигнала, связанного с Bcr-Abl, дает клинически доказанный противоопухолевый эффект при остром лимфобластном лейкозе в случае наличия филадельфийской хромосомы, при миелодиспластических и миело-пролиферативных заболеваниях, связанных с мутациями гена PDGF-R, при плексиформных нейрофибромах, а также при гастроинтестинальных стромальных опухолях (GIST) [1—7].
К настоящему времени получен ряд ингибиторов ти-розинкиназы Bcr-Abl, из которых наиболее известен има-тиниб (Гливек). Он блокирует сайт Bcr-Abl, связывающий АТФ, что приводит к ингибированию ферментативной (киназной) функции Bcr-Abl. Указанный механизм определяет высокую зависимость эффективности иматиниба от определенной пространственной структуры белка, а точковые мутации в тирозинкиназном участке Bcr-Abl с заменой одной из аминокислот в том домене, где происходит связывание с АТФ, приводят к формированию резистентности к иматинибу [8]. Причиной резистентности могут быть также другие хромосомные и генные мутации, определяющие развитие дисбаланса между пролиферацией и апоптозом с выключением генов-супрессоров (например, при изменении длинного плеча 17-й хромосомы). В процессе селекции опухолевых клонов резистентность формируется более чем у 50% пациентов даже в случае изначальной чувствительности опухоли [2].
Для решения проблемы лечения резистентных к иматинибу опухолей, механизм формирования которых связан с наличием Bcr-Abl, создан ряд препаратов, прежде всего дазатиниб и нилотиниб. Доказана их эффективность при различных видах мутаций, в частности при М244V, М351Т и TO96P, за исключением панрезистент-ной T315I [3]. В литературе описан лишь один препарат, способный преодолевать резистентность опухолей с мутацией T315I и одобренный недавно для применения в клинической практике, — понатиниб [9]. Вместе с тем низкая селективность понатиниба в отношении ингиби-рования различных киназ человека обусловливает тяжелые побочные эффекты данного препарата. Мутация
© Покровский В. С., Филоненко Д. А., Анисимова Н. Ю., Андронова Н. В., Чилов Г. Г., Зейфман А. А., Логунов Д. Ю., Грибова И. Ю., Бурмистрова Д. А., Киселевский М. В., Мещеряков А. А., Трещалина Е. М., 2013 УДК 616-006.6-092.4:577.15:575.224.2
T315I не является уникальной для Bcr-Abl. При GIST определяется также гомологичная мутация T670I в 14-м экзоне c-kit, ответственная за резистентность к иматинибу, нилотинибу и дазатинибу [4—6]. При возникновении вторичных мутаций умеренно эффективны сорафениб, сунитиниб и регорафениб [7; 10], два последних препарата зарегистрированы в Российской Федерации в качестве препаратов второй и третьей линий лечения больных GIST соответственно.
Учитывая перечисленное, можно считать, что на первом этапе разработки новых средств, способных преодолевать панрезистентность к иматинибу, необходимо иметь адекватную опухолевую модель in vitro/in vivo с мутацией Т315! оцененную по чувствительности к пона-тинибу.
Цель исследования — создание и валидация тест-системы in vitro/in vivo для доклинического изучения новых препаратов, нацеленных на преодоление резистентности к иматинибу, которая обусловлена мутацией Т315К
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Ингибиторы тирозинкиназы Bcr-Abl Понатиниб. В настоящем исследовании использован понатиниб производства компании «Selleck» (США). Для тестов in vitro использовали стоковый раствор понатини-ба в диметилсульфоксиде — ДМСО («ПанЭко», Россия), из которого готовили ряд десятикратных разведений в среде RPMI 1640. В опытах in vivo понатиниб в разовых дозах 1,0, 5,0 и 10,0 мг/кг вводили мышам ежедневно в желудок (перорально) в течение 10 дней в виде 0,5% взвеси с метилцеллюлозой. Рабочие растворы понатиниба готовили ex tempore, расчет доз выполняли индивидуально на массу тела мыши.
Иматиниб. В качестве отрицательного контроля резистентной опухоли in vivo использован иматиниб («Novartis», Швейцария) в капсулах, который вводили перорально десятикратно в разовой дозе 25 мг/кг, суммарная доза — 250 мг/кг.
О переносимости терапии судили по состоянию, поведению, изменению массы тела и гибели мышей, а также по наличию патологических изменений во внутренних органах при аутопсии.
Тестирование in vitro Культуральные модели. Для исследований использовали описанную в литературе линию незрелых мышиных кроветворных клеток BaF3, несущую ген Bcr-Abl (BaF3-Bcr-Abl) и мутантный вариант BaF3-Bcr-Abl T315I, полученные с помощью трансдукции рекомбинантны-ми лентивирусными векторами LM-CMV-Bcr-Abl и LM-CMV-Bcr-Abl T315I.
Методика получения трансдуцированных клеточных линий. Для получения рекомбинантного лентиви-русного вектора LM-CMV-Bcr-Abl, несущего ген Bci-Abl, под контролем CMV-промотора клеточную линию 293Т трансфецировали методом кальциево-фосфатной преципитации смесью трех плазмид: pVSVG (кодирует поверхностный гликопротеин), pCMVR8.2 (пакующая плазмида) и pLM-CMV-Bcr-Abl, взятых в соотношении 1:3:3. Культуральную среду трансфецированных клеток, содержащую рекомбинантный лентивирусный LM-CMV-Bcr-Abl, собирали через 48 ч после трансфекции и фильтровали через нейлоновый фильтр с порами диаметром 0,45 мкм. Аналогично получали препарат ленти-вирусного вектора LM-CMV-Bcr-Abl T315I. Трансдукцию линии клеток BaF3 проводили в культуральных флаконах с площадью культивирования 25 см2 для чего суспензию клеток BaF3 (около 106 клеток на трансдукцию) осаждали центрифугированием (1500 об/мин) и осадок ресуспен-дировали в 5 мл лентивирусного препарата. Через 24 ч клеточную суспензию из каждого культурального флакона осаждали центрифугированием и ресуспендиро-вали в ростовой среде RPMI 1640 (10% фетальная бычья сыворотка, бензилпенициллин, 50 ЕД/мл; стрептомицин, 50 мкг/мл). Селекцию проводили по способности трансдуцированных клеток к выживанию в отсутствие экзогенного интерлейкина-3 (ИЛ-3). В качестве контроля процесса селекции использовали нетрансдуцированные клетки BaF3, которые также культивировали в отсутствие ИЛ-3. В полученных линиях клеток проверяли наличие последовательности генов Bci-Abl и Bci-Abl T315I в геномной ДНК методом полимеразной цепной реакции.
Оценка выживаемости клеточной линии in vitro. Выживаемость клеточных линий BaF3, BaF3-Bcr-Abl и BaF3-Bcr-Abl T315I определяли с помощью автоматического счетчика клеток («Invitrogen Corporation», США) в соответствии с инструкцией производителя через 0, 24, 48 и 72 ч культивирования в среде RPMI 1640 без ИЛ-3. Жизнеспособность клеток оценивали по исключению красителя трипанового синего («ПанЭко», Россия). Количество живых клеток в лунках по окончании периода инкубации с исследуемым веществом определяли с помощью колориметрического метода, основанного на способности дегидрогеназ живых клеток восстанавливать 3-(4,5-диметил-2-триацил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиума бромид (MTT) до фиолетовых кристаллов формазана, растворимых в диметилсульфоксиде [11]. Оптическое поглощение окрашенных растворов ДМСО измеряли на планшетном фотометре Multiskan MS («Labsystem», Финляндия) при длине волны X = 540 нм.
Оценка чувствительности клеточных линий к по-натинибу in vitro. Опухолевые клетки культивировали при температуре 37°С в присутствии 5% СО2 в среде RPMI 1640 («ПанЭко», Россия), содержащей 2 ммоль L-глутамина («ПанЭко», Россия) и 10% феталь-ной бычьей сыворотки («HyClone Laboratories», Logan, UK). Клетки, достигшие логарифмической фазы роста, пассировали в плоскодонные 96-луночные микропланшеты («Costar») по 50 000—60 000 клеток на лунку и преинкубировали в указанных выше условиях в течение 24 ч перед добавлением тестируемого вещества. Световую микроскопию клеток проводили с помощью
системы «AxioVision 4» («Zeiss», Германия). Полученные ex tempore растворы понатиниба постепенно уменьшающихся концентраций добавляли в лунки с культурой клеток (20 мкл к 180 мкл клеточной суспензии) и коинкубировали в течение 72 ч. В контрольные лунки добавляли среду RPMI 1640 с ДМСО в том же объеме. Антипролиферативную активность понатиниба оценивали по формуле:
(1 - №Жк) х 100%, где No — оптическое поглощение в опытных пробах; Nк — оптическое поглощение в контроле с аналогичной концентрацией ДМСО.
После этого рассчитывали стандартный критерий ци-тотоксичности вещества — ингибируюшую концентрацию, вызывающую уменьшение числа жизнеспособных клеток до 50% (ИК50, inhibition concentration, IC50).
Тестирование in vivo Иммунодефицитные мыши. Использованы мыши-самки Balb/c nude с массой тела 18—22 г разведения ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН, которых содержали в специализированном кондиционированном отсеке со стерильной принудительной вентиляцией на входе, на стерильном экструдированном корме «МЭСТ», на воде и на бумажной подстилке. В день начала опыта мышей взвешивали на электронных весах MW-T series, User's Manual («CAS», США), цена деления 0,01 г, после чего распределяли на группы. Опытные группы включали по 10—12 мышей, контрольные — по 5—12 мышей. После завершения экспериментов мышей умерщвляли с соблюдением методов гуманного обращения с лабораторными животными, регламентированными в Российской Федерации.
Опухолевая модель. Для получения модели были использованы вышеописанные культуры клеток BaF3-Bcr-Abl и BaF3-Bcr-Abl T315I. Подкожные ксенографты у мышей-самок Balb/c nude получали с использованием соответствующей культуры клеток. Для первого пассажа BaF3-Bcr-Abl T315I под кожей прослежена кинетика роста опухоли с определением сроков латентной, экспоненциальной и стационарной фаз.
Оценка чувствительности опухоли. Оценка выполнена на основании торможения роста опухоли (ТРО, %) под действием понатиниба по сравнению с иматинибом. Для расчета стандартного показателя использованы Vср в динамике после лечения [12].
РЕЗУЛЬТАТЫ Характеристика линий клеток BaF3 Выживаемость. При культивировании без ИЛ-3 выживаемость клеток BaF3 в среде снижалась через 24 ч, полная гибель наступала через 72 ч культивирования (рис. 1). Линии клеток BaF3-Bcr-Abl и BaF3-Bcr-Abl T315I в этих условиях сохраняли пролиферативную активность в течение как минимум 20 пассажей.
Чувствительность к понатинибу. В 5 последовательных сериях опытов клетки, культивированные в описанных условиях, практически не изменяли своей чувствительности к цитопатогенному действию понатиниба. Колебания величины IC50 составили 1,9—8,9 х 10-8 моль, однако при тестировании более поздних пассажей отме-
1CC 9C 8C 7C 6C 5C 4C 30 2C 1C
1CC,C
1CC,C_
24 48
Время культивирования, ч
72
Рисунок 1. Относительная выживаемость клеточных линий, экспрессирующих гены Bcr-Abl и Bcr-Abl T315I, в отсутствие экзогенного ИЛ-3. 1 — BaF3-Bcr-Abl T315I; 2 — BaF3-Bcr-Abl; 3 — BaF3.
чена тенденция к увеличению ингибирующей концентрации, что свидетельствует об ослаблении эффекта (см. таблицу).
Характеристика подкожных ксенографтов BaF3-Bcr-Abl T315I Прививаемость. В серии экспериментов оценена прививаемость мутантного и дикого вариантов BaF3 мышам-самкам Balb/c nude. Показано, что 100% прививаемость обеих культур достигается имплантацией 3,0 млн клеток на мышь. Латентный период роста полученных в результате такой имплантации подкожных ксенографтов составил 7—12 дней, период достижения Vср, равного 100 мм3, — 11 дней. Кинетика роста ксенографтов дикого и мутантного штаммов была сопоставимой, длительность латентной фазы составила 5—7 дней, экспоненциальной фазы — около 20 дней, стационарная фаза роста не была достигнута (рис. 2).
Таблица
Чувствительность клеток линии Bcr-Abl T315I к действию понатиниба
Cерия эксперимента IC50, моль
1 9,2 x 1C-9
2 1,9 x 1C-8
З 8,9 x 1C-9
4 1,8 x 1C-8
5 1,1 x 1C-8
18CC
16CC
14CC
12CC
с 1CCC
112C
S
е р
С
8CC
6CC
4CC
2CC
10 15 20
Сутки после трансплантации
25
30
Рисунок 2. Кинетика роста дикого и мутантного штаммов BaF3 in vivo. 1 — BaF3-Bcr-Abl; 2 — BaF3-Bcr-Abl T315I.
Сравнительная чувствительность опухоли к има-тинибу и понатинибу. На фоне относительно быстрого роста опухолей в контрольной группе BaF3-Bcr-Abl T315I, достигающих без специфического лечения Vср 275 мм3 (10—540 мм3) на 15-е сутки и Vcp 634 мм3 (97—1171 мм3) на 21-е сутки после имплантации, иматиниб был совершенно неактивен. В то же время понатиниб в разовых дозах 5 и 10 мг/кг после окончания 10-дневного курса оказал выраженное действие в виде ТРО до 97—98% на 4-е сутки и до 85—89% (p < 0,05) на 10-е сутки, сохранявшееся до 23-го дня опыта (рис. 3).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
С помощью рекомбинантных лентивирусных векторов LM-CMV, несущих ген Bcr-Abl и ген Bcr-Abl с верифицированной с помощью полимеразной цепной реакции транзиентной мутацией T315I, получена линия про-В-клеточного лейкоза BaF3-Bcr-Abl T315I с панрезистент-ностью к иматинибу, сохраняющая в отсутствие ИЛ-3 in vitro пролиферативную активность в течение как минимум 20 пассажей. На основе BaF3-Bcr-Abl T315I получен стабильный перевиваемый штамм, дающий подкожные ксенографты у мышей Balb/c nude с латентным периодом роста 5—7 дней и периодом достижения Vcp, равного 100 мм3, 10—14 дней. Показана чувствительность модели in vitro и in vivo к преодолевающему панрезистентность ингибитору Bcr-Abl понатинибу на фоне отсутствия чувствительности к иматинибу in vivo. Полученная модель может быть использована in vitro и на первом пассаже in vivo для поиска новых аналогов иматиниба, способных преодолевать резистентность опухолей с мутацией T315I в гене Bcr-Abl.
Авторы благодарят. А. Фрадкова (ЗАО «Евроген») за предоставление плазмид, несущих гены Bcr-Abl и Bcr-Abl T315I.
З
C
5
C
Рисунок 3. Сравнительная чувствительность подкожных ксенографтов BaF3-Bcr-Abl T315I.
А. К иматинибу. 1 — контроль; 2 — иматиниб, 25 мг/кг. Б. К понатинибу. 1 — контроль; 2 — понатиниб, 5 мг/кг; 3 — понатиниб, 10 мг/кг.
ЛИТЕРАТУРА
1. Druker B. J., Lydon N. B. Lessons learned from the development of an abl tyrosine kinase inhibitor for chronic myelogenous leukemia // J. Clin. Invest. —2000. — Vol. 105, N 1. — P. 3—7.
2. Karvela M., Helgason G. V., Holyoake T. L. Mechanisms and novel approaches in overriding tyrosine kinase inhibitor resistance in chronic myeloid leukemia // Expert. Rev. Anticancer Ther. — 2012. — Vol. 12, N 3. — P. 381—392.
3. Lu X. Y., Cai Q., Ding K. Recent developments in the third generation inhibitors of Bcr-Abl for overriding T315I mutation // Curr. Med. Chem. — 2011. — Vol. 18, N 14. — P. 2146—2157.
4. A new mutation in the KIT ATP pocket causes acquired resistance to imatinib in a gastrointestinal stromal tumor patient / Tamborini E., Bonadiman L., Greco A., Albertini V., Negri T., Gronchi A., Bertulli R., Colecchia M., Casali P. G., Pierotti M. A., Pilotti S. // Gastroenterology. — 2004. — Vol. 127, N 1. — P. 294—299.
5. Discovery of a small-molecule type II inhibitor of wild-type and gatekeeper mutants of BCR-ABL, PDGF-R alpha, Kit, and Src kinases: novel type II inhibitor of gatekeeper mutants / Weisberg E., Choi H. G., Ray A., Barrett R., Zhang J., Sim T., Zhou W., Seeliger M., Cameron M., Azam M., Fletcher J. A., Debiec-Rychter M., Mayeda M., Moreno D., Kung A. L., Janne P. A., Khosravi-Far R., Melo J. V., Manley P. W., Adamia S., Wu C., Gray N., Griffin J. D. // Blood. — 2010. — Vol. 115, N 21. — P. 4206—4216.
6. George S., Wang Q., Heinrichetal M. C. Efficacy and Safety of Regorafenib in Patients With Metastatic and/or Unresectable GIStromal Tumor After Failure of Imatinib and Sunitinib: A Multicenter Phase II Trial // JCO. — 2012. — Vol. 30, N 19. — P. 2401—2407.
7. Efficacy and safety of sunitinib in patients with advanced gastrointestinal stromal tumor after failure of imatinib: a randomized controlled trial / Demetri G. D., van Oosterom A. T., Garrett C. R., Blackstein M. E., Shah M. H., Verweij J., McArthur G., Judson I. R., Heinrich M. C., Mor-
gan J. A., Desai J., Fletcher C. D., George S., Bello C. L., Huang X., Baum C. M., Casali P. G. // Lancet. — 2006. — Vol. 368. — P. 1329— 1338.
8. Molecular mechanisms of resistance to imatinib in Philadelphia-chromosome-positive leukaemias / Gambacorti-Passerini C. B., Gun-by R. H., Piazza R., Galietta A., Rostagno R., Scapozza L. // Lancet Oncol. — 2003. — Vol. 4, N 2. — P. 75—85.
9. AP24534, a Pan-BCR-ABL Inhibitor for Chronic Myeloid Leukemia, Potently Inhibits the T315I Mutant and Overcomes Mutation-Based Resistance / O'Hare T., Shakespeare W. C., Zhu X., Eide C. A., Rivera V. M., Wang F., Adrian L. T., Zhou T., Huang W. S., Xu Q., Metcalf C. A. 3rd, Tyner J. W., Loriaux M. M., Corbin A. S., Wardwell S., Ning Y., Keats J. A., Wang Y., Sundaramoorthi R., Thomas M., Zhou D., Snodgrass J., Commodore L., Sawyer T. K., Dalgarno D. C., Deininger M. W., Druker B. J., Clackson T. // Cancer Cell. — 2009. — Vol. 16. — P. 401—412.
10. Sorafenib inhibits the imatinib-resistant KITT670I gatekeeper mutation in gastrointestinal stromal tumor / Guo T., Agaram N. P., Wong G. C., Hom G., D'Adamo D., Maki R. G., Schwartz G. K., Veach D., Clarkson B. D., Singer S., DeMatteo R.P., Besmer P., Antonescu C.R. // Clin. Cancer Res. — 2007. — Vol. 13, N 16. — P. 4874—4881.
11. Mossman T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays // J. Immunol. Methods. — 1983. — Vol. 65. — P. 55—63.
12. Методические указания по изучению противоопухолевой активности фармакологических веществ / Трещалина Е. М., Жукова О. С., Герасимова Г. К., Андронова Н. В., Гарин А. М. // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общей ред. А. Н. Миронова. — М.: Гриф и К, 2012. — С. 642—657.
Поступила 27.05.2013
Vadim Sergeyevich Pokrovsky1, Daria Alexandrovna Filonenko2, Natalia Yurievna Anisimova3, Natalia Vladimirovna Andronova4, Hermes Grigorievich Chilov5, Alexey Alexandrovich Zeifman6, Denis Yurievich Logunov7, Irina Yurievna Gribova8, Daria Andreyevna Burmistrova9, Mikhail Valentinovich Kiselevsky10, Andrey Albertovich Mescheryakov11, Elena Mikhailovna Treschalina12
DEVELOPMENT OF AN IN VITRO/IN VIVO TEST WITH T315I PANRESISTANT MUTATION FOR PRECLINICAL TRIAL OF BCR-ABL TYROSINE KINASE INHIBITORS
1 MD, PhD, Senior Researcher, Laboratory of Combined Cancer Treatment, Tumor Experimental Diagnosis and Therapy Research Institute, N. N. Blokhin RCRC RAMS (24, Kashirskoye sh., Moscow, RF, 115478) 2 MD, Postgraduate Student, Chemotherapy and Multimodality Treatment Department, Clinical Oncology Research Institute, N. N. Blokhin RCRC RAMS
(24, Kashirskoye sh., Moscow, RF, 115478) 3 MSc, PhD, DSc, Senior Researcher, Cellular Immunity Laboratory, Tumor Experimental Diagnosis and Therapy Research Institute, N. N. Blokhin RCRC RAMS (24, Kashirskoye sh., Moscow, RF, 115478) 4 MD, PhD, Leading Researcher, Laboratory of Combined Cancer Treatment, Tumor Experimental Diagnosis and Therapy Research Institute, N. N. Blokhin RCRC RAMS
(24, Kashirskoye sh., Moscow, RF, 115478) 5 Director General, OOO Fusion Pharma, (18/2, ul. Generala Dorohova, Moscow, RF, 115530) 6 MD, Postgraduate Student, N. D. Zelinsky Organic Chemistry Institute (47, Leninsky pr., Moscow, RF, 119334) 7 MSc, PhD, DSc, Head, Cell Microbiology Laboratory, N. F. Gamaleya EMRI (18, ul. Gamaleyi, Moscow, RF, 123098) 8 MD, Junior Researcher, Molecular Biotechnology Laboratory, N. F. Gamaleya EMRI (18, ul. Gamaleyi, Moscow, RF, 123098) 9 MD, Postgraduate Student, Molecular Biotechnology Laboratory, N. F. Gamaleya EMRI (18, ul. Gamaleyi, Moscow, RF, 123098) 10 MD, PhD, DSc, Professor, Head, Cellular Immunity Laboratory, Tumor Experimental Diagnosis and Therapy Research Institute, N. N. Blokhin RCRC RAMS (24, Kashirskoye sh., Moscow, RF, 115478) 11 MD, PhD, DSc, Senior Researcher, Cancer Chemotherapy and Multimodality Treatment Department, Clinical Oncology Research Institute, N. N. Blokhin RCRC RAMS (24, Kashirskoye sh., Moscow, RF, 115478) 12 MD, PhD, DSc, Professor, Head, Laboratory of Combined Cancer Treatment, Tumor Experimental Diagnosis and Therapy Research Institute, N. N. Blokhin RCRC RAMS (24, Kashirskoye sh., Moscow, RF, 115478)
Address for correspondence: Pokrovsky Vadim Sergeyevich, Laboratory of Combined Cancer Treatment, Tumor Experimental Diagnosis and Therapy Research Institute, N. N. Blokhin RCRC RAMS, 24, Kashirskoye sh., Moscow, RF, 115478; e-mail: vadimpokrovsky@yandex.ru
An imatinib-panresistant pro-B-cell leukemia BaF3-Bcr-Abl T315I line that preserved in vitro proliferative activity at least for 20 passages has been produced by polymerase chain reaction using recombinant lentiviral vectors LM-CMV bearing Bcr-Abl and Bcr-Abl with verified transient T315I mutation. A stable transplantable strain has been developed on the basis of BaF3-Bcr-Abl T315I that produced subcutaneous xenografts in Balb/c nude mice with a 5 to 7 day latency and a 10 to 14 day period to reach a 100 mm3 mean volume (Vm). The model was in vitro and in vivo sensitive to pan-Bcr-Abl inhibitor ponatinib while demonstrating no in vivo response to imatinib. The model may be used in vitro and at the first in vivo passage to develop novel drugs able to override resistance of T315I mutant Bcr-Abl-bearing tumors.
Key words: tyrosine kinase Bcr-Abl, mutation, preclinical model.
