Научная статья на тему 'Разработка тест-системы для обнаружения и дифференциации цирковируса свиней 2-го типа подтипов 2а и 2b на основе множественной ПЦР в реальном времени'

Разработка тест-системы для обнаружения и дифференциации цирковируса свиней 2-го типа подтипов 2а и 2b на основе множественной ПЦР в реальном времени Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

CC BY
366
198
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Аннотация научной статьи по ветеринарным наукам, автор научной работы — Елисеева Олеся Васильевна, Латышев Олег Евгеньевич, Зайкова Ольга Николаевна, Булгаков Александр Дмитриевич, Гребенникова Татьяна Владимировна

Цирковирус свиней 2 типа ассоциируется с различными заболеваниями свиней, такими как синдром послеотъемного мультисистемного истощения (СПМИ), синдром дерматита и нефропатии свиней (СДНС), комплексными репродуктивными и респираторными нарушениями. Разработана тест-система для выявления и дифференциации ЦВС-2 подтипов 2а и 2b на основе множественной ПЦР в реальном времени. Высокая специфичность и чувствительность тест-системы позволяют использовать ее в лабораторной диагностике при анализе биологических образцов от животных.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по ветеринарным наукам , автор научной работы — Елисеева Олеся Васильевна, Латышев Олег Евгеньевич, Зайкова Ольга Николаевна, Булгаков Александр Дмитриевич, Гребенникова Татьяна Владимировна

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Development of the Kit for Detection and Differentiation of Porcine Circovirus Type 2 Subtypes 2a and 2b Based on Multiplex Real Time PCR

Porcine circovirus-2 (PCV-2) is associated with several diseases in pig: postweaning multisystemic wasting syndrome, porcine dermatitis and nephropathy syndrome, reproductive failure and porcine respiratory disease complex. The kit for detection and differentiation subtypes PCV-2a and PCV-2b based on multiple real-time PCR has been developed. High sensitivity and specificity of the kit allows the analysis of samples from animals and use in laboratory diagnosis.

Текст научной работы на тему «Разработка тест-системы для обнаружения и дифференциации цирковируса свиней 2-го типа подтипов 2а и 2b на основе множественной ПЦР в реальном времени»

Разработка тест-системы для обнаружения и дифференциации цирковируса свиней 2-го типа подтипов 2а и 2Ь на основе множественной ПЦР в реальном времени

О.В. Елисеева1, кандидат биологических наук, О.Е. Латышев1, кандидат биологических наук,

О.Н. Зайкова3, А.Д. Булгаков2, Т.В. Гребенникова13, доктор биологических наук,

Е.А. Непоклонов2, доктор биологических наук

1 НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздрава России (Москва).

2 Московский государственный университет пищевых производств (Москва).

3 Научно-исследовательский институт диагностики и профилактики болезней человека и животных (Москва).

Ключевые слова: множественная ПЦР в реальном времени, ПЦР диагностика, подтипы ЦВС-2а/Ь, цир-ковирус свиней 2 типа

Сокращения: ВГС — вирус гриппа свиней, ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота, КЧС — классическая чума свиней, ПВС — парвовирус свиней, ПЦР-РВ — полимеразная цепная реакция в реальном времени, РНК — рибонуклеиновая кислота, РРСС — репродуктивно-респираторный синдром свиней, СДНС — синдром дерматита и нефропатии свиней, СПМИ— синдром послеотъемного мультисистемного истощения, ЦВБС — цирковирусная болезнь свиней, ЦВС-2 — цирковирус свиней 2-го типа

Введение

Цирковирусная болезнь свиней широко распространена в странах с развитым свиноводством и причиняет большие экономические убытки хозяйствам. Возбудитель — ЦВС-2; его обнаруживают при СПМИ, СДНС, репродуктивных нарушениях, респираторных болезнях свиней. В ходе массовых серологических исследований, проводимых в странах с развитым свиноводством (Бельгия, США, Канада, Испания, Германия, Великобритания), антитела к ЦВС-2 выявляются в 30.. .85 % исследуемых проб, что подтверждает широкую распространенность вируса в популяции свиней [5].

СПМИ поражает, в основном, поросят в возрасте 2.3 месяцев; характеризуется отставанием животных в росте, диареей, отдышкой, истощением, увеличением поверхностных лимфатических узлов, бледностью и иктеричностью слизистых оболочек и кожи. В различных хозяйствах заболеваемость обычно составляет 5.30 %, а смертность 4.20 % [7]. С возрастом у поросят увеличивается резистентность к СПМИ. Источником возбудителя инфекции служат больные и инфицированные свиньи всех возрастных групп, выделяющие вирус со слюной, носовыми и глазными секретами, молоком, мочой, фекалиями. В наибольших количествах вирус накапливается в печени, тимусе, селезенке и лимфоузлах. Наличие ассоциированных заболеваний, вызванных вирусом РРСС, ПВС, ВГС, а также PasteшeUa multocida,

Micoplasma hyopneumoшae, может осложнять течение СПМИ [1].

СДНС выявляется, как правило, у поросят в возрасте 1,5.4 мес, редко у взрослых свиней. Заболеваемость составляет около 1 %, летальность 70.100 % [6]. Клинически СДНС характеризуется угнетением, состоянием прострации, потерей аппетита, могут появляться красные некротические поражения кожи в области промежности и задних конечностей. Наиболее сильно поражаются почки: они плотные, увеличенные; иногда на вскрытии обнаруживают кровоизлияния, отечность почечной лоханки.

Репродуктивные нарушения при ЦВБС характеризуются рождением мертвых и слабых поросят, абортами во второй половине беременности. К репродуктивным нарушениям у свиней, обусловленным ЦВБС, можно отнести 10.20 % всех случаев инфекционной природы [2]. Зараженные хряки выделяют вирус вместе со спермой более 6 мес.

ЦВС-2, наряду с вирусами РРСС и ВГС, относится к основным возбудителям респираторных болезней свиней. В подавляющем большинстве случаев при респираторных поражениях свиней обнаруживается не один, а два (76.88 %) или даже 3 (28.33 %) вирусных патогена [3].

ЦВС-2 относится к роду Circovirus семейства Сгг-соviridае. Это мелкий безоболочечный икасаэдрический вирус, содержащий замкнутую односпиральную геномную ДНК размером около 1767 нуклеотидов. Не обладает гемагглютинирующей активностью, устойчив к инактивации посредством хлороформа и сохраняет инфекционность при 70 °С в течение 15 мин, стабилен в кислой среде (при рН 3). Диаметр вириона 16.21 нм. Капсид состоит из 32 капсомеров. В вирионах ЦВС-2 выявлен только один белок с молекулярной массой 30 кД, состоящий из 233 аминокислот [4]. Помимо патогенного ЦВС-2 известен непатогенный ЦВС-1, который был обнаружен как нецитопатогенный контаминант перевиваемой культуры клеток почки поросенка РК-15. Гомология между ними составляет 76 %. На основании генетических различий в области второй открытой рамки

Разработка тест-системы для обнаружения и дифференциации цирковируса свиней 2-го типа подтипов 2а и 2Ь на основе множественной ПЦР в реальном времени

считывания (ORF2) ЦВС-2 подразделяют на два подтипа: 2а и 2b. Тяжесть, с которой часто протекает ЦВС-2, многие исследователи связывают с переходом от ЦВС-2а к ЦВС-2Ь [6].

Диагноз базируется на трех критериях: клинической картине, эпизоотологических данных, результатах лабораторного исследования. Методы лабораторной диагностики основаны на обнаружении вируса или вирусного антигена в тканях и органах поросят с помощью ПЦР и ПЦР-РВ, гибридизации in situ, иммуногистохимии, непрямой иммунофлуоресценции [7]. При проведении исследований на обнаружение вирусного антигена в качестве материала используют сыворотку крови, сперму хряков, кусочки легких, печени, почек, селезенки, абортивные плоды.

В настоящее время важно не только обнаружить самого возбудителя ЦВБС, но также и его типиро-вать, что помогает прогнозировать характер и остроту течения заболевания, а также правильно выбрать профилактические препараты. Такое типирование возможно с использованием молекулярных методов анализа.

Цель исследования

Разработать тест-систему для обнаружения и дифференциации ЦВС-2а и ЦВС-2Ь на основе множественной ПЦР-РВ.

Материалы и методы

Исследуемые образцы. Для разработки тест-системы и проведения ПЦР-РВ использовали ЦВС-2 шт. «ISU-31», 20%-ю суспензию паренхиматозных органов мертворожденных, павших и вынужденно убитых просят, кровь поросят в возрасте 2, 4, 6, 8, 10, 12 и 14 недель, сыворотку крови поросят в возрасте 50.70 дней, полученные из свиноводческих хозяйств РФ (Владимирская область, Московская область, Сибирь, Дальний Восток). Для исследования специфичности тест-системы использовали вирус КЧС вакцинный шт. «КС», вирус РРСС шт. «Lelystad», «NADC-2», ПВС шт. «Ил-82», ВГС шт. «А A/swine/HongKong/9/98», «A/Moscow/01/09 swine-like».

Выделение ДНК. Для выделения ДНК из вируссодержащей культуры клеток РК-15, органов и тканей, сывороток крови свиней использовали специальный набор с неорганическим сорбентом (ООО «Ветбиохим», Россия).

Праймеры и зонды. Нуклеотидную последовательность референтных штаммов ЦВС-2 подтипов 2а и 2b анализировали с использованием информационной базы данных GenBank при помощи программ Assem-blyLign, Oligo 4.0, BioEdit 7.0.1 (США). Специфические олигонуклеотиды для обнаружения и дифференциации ДНК ЦВС-2 подтипов 2а и 2b подбирали на участок генома ЦВС-2, кодирующий капсидный белок (ORF2). Специфические олигонуклеотиды для дифференциации ЦВС-2 подтипов 2а и 2b (зонды) метили на 5'-конце флуорофорами HEX и ROX, соответственно. На З'-конце оба зонда метили гаситетелем флуоресценции BHQ2.

Множественная ПЦР-РВ. Реакцию проводили в объеме 25 мкл. Реакционная смесь содержала 10 ммоль Tris-HCl (pH=9,0), 50 ммоль KCl, 0,1% Triton X-100, 1,5 ммоль MgCl2, 10 пмоль каждого праймера, 5 пмоль каждого зонда, 0,25 ммоль каждого dNTP, 1,25 ед. Taq-полимеразы и 5 мкл матрицы ДНК. Использовали следующий температурно-временной режим: 50 °С — 2 мин, 95 °С — 10 мин; 40 циклов: 95 °С — 15 с, 60 °С — 1 мин. Детекцию флуоресцентного сигнала осуществляли при 60 °С в течение 1 мин.

При постановке множественной ПЦР-РВ и учете результатов использовали детектирующий амплифика-тор ДТ-96 (НПО «ДНК-Технология», Россия).

Результаты

В настоящее время для диагностики заболеваний, вызванных ЦВС-2, используют методы ПЦР и ПЦР-РВ. Оба метода высокочувствительные и специфичные. Однако ПЦР-РВ обладает рядом преимуществ по сравнению с обычной ПЦР: сокращает время анализа и снижает риск контаминации. Вариант множественной ПЦР-РВ позволяет одновременно выявлять и дифференцировать подтипы ЦВС-2. Была разработана диагностическая тест-система для выявления и дифференциации ДНК ЦВС-2 подтипов 2а и 2b на основе множественной ПЦР-РВ.

Для исследования чувствительности разработанной тест-системы были взяты пробы полевого материала (№1, №2), содержащие ДНК ЦВС-2а и ЦВС-2Ь, соответственно. Концентрацию ДНК в исследуемых пробах определяли с помощью количественной ПЦР-РВ для обнаружения ДНК ЦВС-2. Концентрация ДНК в пробе №1 составила 5,34x105 копий/мл, в пробе №2 —

4,06x10 копий/мл.

Далее готовили разведения исследуемых проб и проводили ПЦР-РВ для выявления и дифференциации ДНК ЦВС-2 подтипов 2а и 2b. Пределом чувствительности считали последнее разведение ДНК, при котором наблюдали положительный результат ПЦР-РВ (табл. 1).

1. Чувствительность тест-системы для выявления и дифференциации ДНК ЦВС-2 подтипов 2а и 2Ь на основе множественной ПЦР-РВ

Исследуемый Наличие ДНК ЦВС-2

образец Подтип 2а Подтип 2b

Проба №1 (неразведенная) + -

1:5 + -

1:25 + -

1:50 + -

1:100 + -

1:500 + -

1:1000 - -

Проба №2 (неразведенная) - +

1:5 - +

1:25 - -

1:50 - -

1:100 - -

1:500 - -

1:1000 - -

РВЖ • СХЖ • № 3/2013

О.В. Елисеева, О.Е. Латышев, О.Н. Зайкова, А.Д. Булгаков, Т.В. Гребенникова, Е.А. Непоклонов

Результаты исследований показали, что чувствительность множественной ПЦР-РВ для выявления и дифференциации ЦВС-2 подтипов 2а и 2Ь составляет:

1,07x10 копий/мл для подтипа ЦВС-2а и 8,12x10 копий/мл для подтипа ЦВС-2Ь. Данная чувствительность является достаточной для выявления и дифференциации ЦВС-2 в материале от животных.

Для исследования специфичности проводили множественную ПЦР-РВ, используя материал, содержащий РНК и ДНК вирусных патогенов, вызывающих сходные с ЦВС-2 клинические признаки: ПВС, вирус РРСС, вирус КЧС, ВГС. В качестве положительного контроля на наличие ДНК ЦВС-2 подтипа 2а использовали пробу №1, а на наличие ДНК ЦВС-2 подтипа 2Ь — пробу №2. Отрицательным контролем служил физиологический раствор (таблица 2).

Результаты исследований показали, что специфичность исследуемой тест-системы составила 100 %.

С помощью разработанной тест-систем на основе множественной ПЦР-РВ исследовали пробы от животных на наличие ЦВС-2 подтипов 2а и 2b. Из свиновод-

Библиография

1. Красочко n.A., Якубовский М.В., Ятусевич A.^ Болезни сельскохозяйственных животных. — Минск: Бизнесофсет, 2005.

2. Орлянкин Б.Г. Инфекционные респираторные болезни свиней // Свиноферма, 2006; 10: 60-62.

3. Орлянкин Б.Г., Мишин AM., Aлипер Т.И. Специфическая профилактика цирковирусных болезней свиней // Свиноводство, 2011; 2: 67-68.

4. Тимина A.M., Щербаков A.B., Ковалишин В.Ф. Выявление и дифференциация цирковирусов свиней методом мультиплексной ПЦР

□ отрицательные пробы 00 0

Рис. Обнаружение и типирование проб от животных на наличие ДНК ЦВС-2 подтипов 2а и 2Ь

ческих хозяйств РФ были предоставлены 73 пробы цельной крови поросят 2.12-недельного возраста, образцы сывороток крови поросят 50.70-дневного возраста, пробы органов и тканей от животных. Данные пробы были типированы на ЦВС-2 подтипы 2а и 2Ь с помощью разработанной тест-системы на основе ПЦР-РВ (рис.). Полученные нами данные подтверждают большее распространение ЦВС-2 подтипа 2Ь по сравнению с подтипом 2а в популяции животных на территории РФ.

Выводы

Таким образом, результаты исследования показали, что разработанная тест-система для выявления и дифференциации ЦВС-2 подтипов 2а и 2Ь на основе множественной ПЦР-РВ обладает высокой чувствительностью, специфичностью и может быть использована для лабораторной диагностики с целью одновременного выявления или дифференцирования ДНК ЦВС-2 в пробах биологического материала разного происхождения.

// Труды Федерального центра охраны здоровья животных, 2006; 4: 91-101.

5. Gillespie T., Opriessnig T., Meng X.J. et. al. Porcine circovirus type 2 and porcine circovirus-associated desease // J. Vet. Intern. Ved., 2009; 23:1151-1163.

6. Segales J. Porcine circovirus type 2 (PCV2) infections: Clinical signs, pathology and laboratory diagnosis // Virus Res., 2012; 164: 10-19.

7. Trible B.R., Rowland R.R.R. Genetic variation of porcine circovirus type 2 (PCV2) and its relevance tovaccination, pathogenesis and diagnosis // Virus Res., 2012; 164: 68-77.

2. Cпецифичность тест-системы на основе множественной ПЦР РВ для выявления и дифференциации ЦВС-2 подтипов 2а и 2Ь

Исследуемый образец ПЦР-РВ для дифференциации ЦВС-2 a/b a b

Культура клеток ППЭС, зараженная ПВС - -

Культура клеток MARC-15, зараженная вирусом РРСС - -

Культура клеток РК-15, зараженная вирусом КЧС - -

Культура клеток MDCK, зараженная вирусом гриппа свиней - -

Проба №1 + -

Проба №2 - +

Физиологический раствор - -

Summary

O.V. Eliseeva, O.E. Latyshev, O.N. Zajkova, A.D. Bulgakov, T.V. Grebennikova, E.A. Nepoklonov. Development of the Kit for Detection and Differentiation of Porcine Circovirus Type 2 Subtypes 2a and 2b Based on Multiplex Real Time PCR. Porcine circovirus-2 (PCV-2) is associated with several diseases in pig: postweaning mul-tisystemic wasting syndrome, porcine dermatitis and nephropathy syndrome, reproductive failure and porcine respiratory disease complex. The kit for detection and differentiation subtypes PCV-2a and PCV-2b based on multiple real-time PCR has been developed. High sensitivity and specificity of the kit allows the analysis of samples from animals and use in laboratory diagnosis.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.