CC BY
214
Разработка тест-системы для обнаружения и дифференциации цирковируса свиней 2-го типа подтипов 2а и 2Ь на основе множественной ПЦР в реальном времени
О.В. Елисеева1, кандидат биологических наук, О.Е. Латышев1, кандидат биологических наук,
О.Н. Зайкова3, А.Д. Булгаков2, Т.В. Гребенникова13, доктор биологических наук,
Е.А. Непоклонов2, доктор биологических наук
1 НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздрава России (Москва).
2 Московский государственный университет пищевых производств (Москва).
3 Научно-исследовательский институт диагностики и профилактики болезней человека и животных (Москва).
Ключевые слова: множественная ПЦР в реальном времени, ПЦР диагностика, подтипы ЦВС-2а/Ь, цир-ковирус свиней 2 типа
Сокращения: ВГС — вирус гриппа свиней, ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота, КЧС — классическая чума свиней, ПВС — парвовирус свиней, ПЦР-РВ — полимеразная цепная реакция в реальном времени, РНК — рибонуклеиновая кислота, РРСС — репродуктивно-респираторный синдром свиней, СДНС — синдром дерматита и нефропатии свиней, СПМИ— синдром послеотъемного мультисистемного истощения, ЦВБС — цирковирусная болезнь свиней, ЦВС-2 — цирковирус свиней 2-го типа
Введение
Цирковирусная болезнь свиней широко распространена в странах с развитым свиноводством и причиняет большие экономические убытки хозяйствам. Возбудитель — ЦВС-2; его обнаруживают при СПМИ, СДНС, репродуктивных нарушениях, респираторных болезнях свиней. В ходе массовых серологических исследований, проводимых в странах с развитым свиноводством (Бельгия, США, Канада, Испания, Германия, Великобритания), антитела к ЦВС-2 выявляются в 30.. .85 % исследуемых проб, что подтверждает широкую распространенность вируса в популяции свиней [5].
СПМИ поражает, в основном, поросят в возрасте 2.3 месяцев; характеризуется отставанием животных в росте, диареей, отдышкой, истощением, увеличением поверхностных лимфатических узлов, бледностью и иктеричностью слизистых оболочек и кожи. В различных хозяйствах заболеваемость обычно составляет 5.30 %, а смертность 4.20 % [7]. С возрастом у поросят увеличивается резистентность к СПМИ. Источником возбудителя инфекции служат больные и инфицированные свиньи всех возрастных групп, выделяющие вирус со слюной, носовыми и глазными секретами, молоком, мочой, фекалиями. В наибольших количествах вирус накапливается в печени, тимусе, селезенке и лимфоузлах. Наличие ассоциированных заболеваний, вызванных вирусом РРСС, ПВС, ВГС, а также PasteшeUa multocida,
Micoplasma hyopneumoшae, может осложнять течение СПМИ [1].
СДНС выявляется, как правило, у поросят в возрасте 1,5.4 мес, редко у взрослых свиней. Заболеваемость составляет около 1 %, летальность 70.100 % [6]. Клинически СДНС характеризуется угнетением, состоянием прострации, потерей аппетита, могут появляться красные некротические поражения кожи в области промежности и задних конечностей. Наиболее сильно поражаются почки: они плотные, увеличенные; иногда на вскрытии обнаруживают кровоизлияния, отечность почечной лоханки.
Репродуктивные нарушения при ЦВБС характеризуются рождением мертвых и слабых поросят, абортами во второй половине беременности. К репродуктивным нарушениям у свиней, обусловленным ЦВБС, можно отнести 10.20 % всех случаев инфекционной природы [2]. Зараженные хряки выделяют вирус вместе со спермой более 6 мес.
ЦВС-2, наряду с вирусами РРСС и ВГС, относится к основным возбудителям респираторных болезней свиней. В подавляющем большинстве случаев при респираторных поражениях свиней обнаруживается не один, а два (76.88 %) или даже 3 (28.33 %) вирусных патогена [3].
ЦВС-2 относится к роду Circovirus семейства Сгг-соviridае. Это мелкий безоболочечный икасаэдрический вирус, содержащий замкнутую односпиральную геномную ДНК размером около 1767 нуклеотидов. Не обладает гемагглютинирующей активностью, устойчив к инактивации посредством хлороформа и сохраняет инфекционность при 70 °С в течение 15 мин, стабилен в кислой среде (при рН 3). Диаметр вириона 16.21 нм. Капсид состоит из 32 капсомеров. В вирионах ЦВС-2 выявлен только один белок с молекулярной массой 30 кД, состоящий из 233 аминокислот [4]. Помимо патогенного ЦВС-2 известен непатогенный ЦВС-1, который был обнаружен как нецитопатогенный контаминант перевиваемой культуры клеток почки поросенка РК-15. Гомология между ними составляет 76 %. На основании генетических различий в области второй открытой рамки
Разработка тест-системы для обнаружения и дифференциации цирковируса свиней 2-го типа подтипов 2а и 2Ь на основе множественной ПЦР в реальном времени
считывания (ORF2) ЦВС-2 подразделяют на два подтипа: 2а и 2b. Тяжесть, с которой часто протекает ЦВС-2, многие исследователи связывают с переходом от ЦВС-2а к ЦВС-2Ь [6].
Диагноз базируется на трех критериях: клинической картине, эпизоотологических данных, результатах лабораторного исследования. Методы лабораторной диагностики основаны на обнаружении вируса или вирусного антигена в тканях и органах поросят с помощью ПЦР и ПЦР-РВ, гибридизации in situ, иммуногистохимии, непрямой иммунофлуоресценции [7]. При проведении исследований на обнаружение вирусного антигена в качестве материала используют сыворотку крови, сперму хряков, кусочки легких, печени, почек, селезенки, абортивные плоды.
В настоящее время важно не только обнаружить самого возбудителя ЦВБС, но также и его типиро-вать, что помогает прогнозировать характер и остроту течения заболевания, а также правильно выбрать профилактические препараты. Такое типирование возможно с использованием молекулярных методов анализа.
Цель исследования
Разработать тест-систему для обнаружения и дифференциации ЦВС-2а и ЦВС-2Ь на основе множественной ПЦР-РВ.
Материалы и методы
Исследуемые образцы. Для разработки тест-системы и проведения ПЦР-РВ использовали ЦВС-2 шт. «ISU-31», 20%-ю суспензию паренхиматозных органов мертворожденных, павших и вынужденно убитых просят, кровь поросят в возрасте 2, 4, 6, 8, 10, 12 и 14 недель, сыворотку крови поросят в возрасте 50.70 дней, полученные из свиноводческих хозяйств РФ (Владимирская область, Московская область, Сибирь, Дальний Восток). Для исследования специфичности тест-системы использовали вирус КЧС вакцинный шт. «КС», вирус РРСС шт. «Lelystad», «NADC-2», ПВС шт. «Ил-82», ВГС шт. «А A/swine/HongKong/9/98», «A/Moscow/01/09 swine-like».
Выделение ДНК. Для выделения ДНК из вируссодержащей культуры клеток РК-15, органов и тканей, сывороток крови свиней использовали специальный набор с неорганическим сорбентом (ООО «Ветбиохим», Россия).
Праймеры и зонды. Нуклеотидную последовательность референтных штаммов ЦВС-2 подтипов 2а и 2b анализировали с использованием информационной базы данных GenBank при помощи программ Assem-blyLign, Oligo 4.0, BioEdit 7.0.1 (США). Специфические олигонуклеотиды для обнаружения и дифференциации ДНК ЦВС-2 подтипов 2а и 2b подбирали на участок генома ЦВС-2, кодирующий капсидный белок (ORF2). Специфические олигонуклеотиды для дифференциации ЦВС-2 подтипов 2а и 2b (зонды) метили на 5'-конце флуорофорами HEX и ROX, соответственно. На З'-конце оба зонда метили гаситетелем флуоресценции BHQ2.
Множественная ПЦР-РВ. Реакцию проводили в объеме 25 мкл. Реакционная смесь содержала 10 ммоль Tris-HCl (pH=9,0), 50 ммоль KCl, 0,1% Triton X-100, 1,5 ммоль MgCl2, 10 пмоль каждого праймера, 5 пмоль каждого зонда, 0,25 ммоль каждого dNTP, 1,25 ед. Taq-полимеразы и 5 мкл матрицы ДНК. Использовали следующий температурно-временной режим: 50 °С — 2 мин, 95 °С — 10 мин; 40 циклов: 95 °С — 15 с, 60 °С — 1 мин. Детекцию флуоресцентного сигнала осуществляли при 60 °С в течение 1 мин.
При постановке множественной ПЦР-РВ и учете результатов использовали детектирующий амплифика-тор ДТ-96 (НПО «ДНК-Технология», Россия).
Результаты
В настоящее время для диагностики заболеваний, вызванных ЦВС-2, используют методы ПЦР и ПЦР-РВ. Оба метода высокочувствительные и специфичные. Однако ПЦР-РВ обладает рядом преимуществ по сравнению с обычной ПЦР: сокращает время анализа и снижает риск контаминации. Вариант множественной ПЦР-РВ позволяет одновременно выявлять и дифференцировать подтипы ЦВС-2. Была разработана диагностическая тест-система для выявления и дифференциации ДНК ЦВС-2 подтипов 2а и 2b на основе множественной ПЦР-РВ.
Для исследования чувствительности разработанной тест-системы были взяты пробы полевого материала (№1, №2), содержащие ДНК ЦВС-2а и ЦВС-2Ь, соответственно. Концентрацию ДНК в исследуемых пробах определяли с помощью количественной ПЦР-РВ для обнаружения ДНК ЦВС-2. Концентрация ДНК в пробе №1 составила 5,34x105 копий/мл, в пробе №2 —
4,06x10 копий/мл.
Далее готовили разведения исследуемых проб и проводили ПЦР-РВ для выявления и дифференциации ДНК ЦВС-2 подтипов 2а и 2b. Пределом чувствительности считали последнее разведение ДНК, при котором наблюдали положительный результат ПЦР-РВ (табл. 1).
1. Чувствительность тест-системы для выявления и дифференциации ДНК ЦВС-2 подтипов 2а и 2Ь на основе множественной ПЦР-РВ
Исследуемый Наличие ДНК ЦВС-2
образец Подтип 2а Подтип 2b
Проба №1 (неразведенная) + -
1:5 + -
1:25 + -
1:50 + -
1:100 + -
1:500 + -
1:1000 - -
Проба №2 (неразведенная) - +
1:5 - +
1:25 - -
1:50 - -
1:100 - -
1:500 - -
1:1000 - -
РВЖ • СХЖ • № 3/2013
О.В. Елисеева, О.Е. Латышев, О.Н. Зайкова, А.Д. Булгаков, Т.В. Гребенникова, Е.А. Непоклонов
Результаты исследований показали, что чувствительность множественной ПЦР-РВ для выявления и дифференциации ЦВС-2 подтипов 2а и 2Ь составляет:
1,07x10 копий/мл для подтипа ЦВС-2а и 8,12x10 копий/мл для подтипа ЦВС-2Ь. Данная чувствительность является достаточной для выявления и дифференциации ЦВС-2 в материале от животных.
Для исследования специфичности проводили множественную ПЦР-РВ, используя материал, содержащий РНК и ДНК вирусных патогенов, вызывающих сходные с ЦВС-2 клинические признаки: ПВС, вирус РРСС, вирус КЧС, ВГС. В качестве положительного контроля на наличие ДНК ЦВС-2 подтипа 2а использовали пробу №1, а на наличие ДНК ЦВС-2 подтипа 2Ь — пробу №2. Отрицательным контролем служил физиологический раствор (таблица 2).
Результаты исследований показали, что специфичность исследуемой тест-системы составила 100 %.
С помощью разработанной тест-систем на основе множественной ПЦР-РВ исследовали пробы от животных на наличие ЦВС-2 подтипов 2а и 2b. Из свиновод-
Библиография
1. Красочко n.A., Якубовский М.В., Ятусевич A.^ Болезни сельскохозяйственных животных. — Минск: Бизнесофсет, 2005.
2. Орлянкин Б.Г. Инфекционные респираторные болезни свиней // Свиноферма, 2006; 10: 60-62.
3. Орлянкин Б.Г., Мишин AM., Aлипер Т.И. Специфическая профилактика цирковирусных болезней свиней // Свиноводство, 2011; 2: 67-68.
4. Тимина A.M., Щербаков A.B., Ковалишин В.Ф. Выявление и дифференциация цирковирусов свиней методом мультиплексной ПЦР
□ отрицательные пробы 00 0
Рис. Обнаружение и типирование проб от животных на наличие ДНК ЦВС-2 подтипов 2а и 2Ь
ческих хозяйств РФ были предоставлены 73 пробы цельной крови поросят 2.12-недельного возраста, образцы сывороток крови поросят 50.70-дневного возраста, пробы органов и тканей от животных. Данные пробы были типированы на ЦВС-2 подтипы 2а и 2Ь с помощью разработанной тест-системы на основе ПЦР-РВ (рис.). Полученные нами данные подтверждают большее распространение ЦВС-2 подтипа 2Ь по сравнению с подтипом 2а в популяции животных на территории РФ.
Выводы
Таким образом, результаты исследования показали, что разработанная тест-система для выявления и дифференциации ЦВС-2 подтипов 2а и 2Ь на основе множественной ПЦР-РВ обладает высокой чувствительностью, специфичностью и может быть использована для лабораторной диагностики с целью одновременного выявления или дифференцирования ДНК ЦВС-2 в пробах биологического материала разного происхождения.
// Труды Федерального центра охраны здоровья животных, 2006; 4: 91-101.
5. Gillespie T., Opriessnig T., Meng X.J. et. al. Porcine circovirus type 2 and porcine circovirus-associated desease // J. Vet. Intern. Ved., 2009; 23:1151-1163.
6. Segales J. Porcine circovirus type 2 (PCV2) infections: Clinical signs, pathology and laboratory diagnosis // Virus Res., 2012; 164: 10-19.
7. Trible B.R., Rowland R.R.R. Genetic variation of porcine circovirus type 2 (PCV2) and its relevance tovaccination, pathogenesis and diagnosis // Virus Res., 2012; 164: 68-77.
2. Cпецифичность тест-системы на основе множественной ПЦР РВ для выявления и дифференциации ЦВС-2 подтипов 2а и 2Ь
Исследуемый образец ПЦР-РВ для дифференциации ЦВС-2 a/b a b
Культура клеток ППЭС, зараженная ПВС - -
Культура клеток MARC-15, зараженная вирусом РРСС - -
Культура клеток РК-15, зараженная вирусом КЧС - -
Культура клеток MDCK, зараженная вирусом гриппа свиней - -
Проба №1 + -
Проба №2 - +
Физиологический раствор - -
Summary
O.V. Eliseeva, O.E. Latyshev, O.N. Zajkova, A.D. Bulgakov, T.V. Grebennikova, E.A. Nepoklonov. Development of the Kit for Detection and Differentiation of Porcine Circovirus Type 2 Subtypes 2a and 2b Based on Multiplex Real Time PCR. Porcine circovirus-2 (PCV-2) is associated with several diseases in pig: postweaning mul-tisystemic wasting syndrome, porcine dermatitis and nephropathy syndrome, reproductive failure and porcine respiratory disease complex. The kit for detection and differentiation subtypes PCV-2a and PCV-2b based on multiple real-time PCR has been developed. High sensitivity and specificity of the kit allows the analysis of samples from animals and use in laboratory diagnosis.
