Разработка тест-системы для количественного определения плацентарной щелочной фосфатазы Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

Погорелова Татьяна Николаевна, доктор биологических наук, профессор, руководитель отдела медикобиологических проблем ФГУ «Ростовский НИИ акушерства и педиатрии» Минздравсоцразвития России, Россия, 344012, г. Ростов-на-Дону, ул. Мечникова, 43, тел. (8632) 27-50-77.

Линде Виктор Анатольевич, доктор медицинских наук, профессор, директор ФГУ «Ростовский НИИ акушерства и педиатрии» Минздравсоцразвития России, Россия, 344012, г. Ростов-на-Дону, ул. Мечникова, 43, тел. (8632) 32-18-40.

УДК 577.152.313: 57.083.3 __________________

© А.В. Коханов, О.В. Мусатов, А.А. Мяснянкин, Р.И. Асфандияро~в1, И.С. Ямпольская, 2011

А.В. Коханов1, О.В. Мусатов1, А.А. Мяснянкин2, Р.И. Асфандияров1, И.С. Ямпольская1

РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЛАЦЕНТАРНОЙ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ

1ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России 2ГБУЗ АО «Александро-Мариинская областная клиническая больница», г. Астрахань

В сыворотках крови доноров, беременных различного срока гестации и больных с предполагаемым подъемом уровня плацентарной щелочной фосфатазы (ПЩФ) проведено сравнительное биохимическое исследование 4-х методов определения этого фермента. Даны характеристики для каждого из тестов индикации ПЩФ: специфичность, чувствительность, воспроизводимость. Наиболее эффективным признан иммуноферментный анализ ПЩФ.

Ключевые слова: плацентарная щелочная фосфатаза, иммуноферментный анализ.

A.V. Kokhanov, O.V. Musatov, A.A. Myasnyankin, R.I. Asfandiyarov, I.S. Yampolskaya

DEVELOPMENT OF TEST SYSTEM FOR QUANTITATIVE ESTIMATTION OF ALKALINE PHOSPHATASE PLACENTAL

In the blood sera of donors, pregnant women of different gestational ages and patients with an estimated rise of the level of placental alkaline phosphatase (PLAP), a comparative biochemical study of 4 methods of determination of this enzyme is conducted. The characteristics from each of the tests of indication of PLAP (specificity, sensitivity and reproducibility) is given. Enzyme-linked immunoassay of PLAP is recognized as the most effective.

Key words: placental alkaline phosphatase, enzyme immunoassay

Щелочные фосфатазы (ЩФ) являются Zn-содержащими гликопротеинами с серином в активном центре, гидролизующими различные фосфатные эфиры при щелочных значениях рН. Оптимум рН лежит в диапазоне рН 8,6—10,1, отсюда ЩФ получила название [1, 2]. Молекулярные массы ЩФ колеблются от 100 до 200 кД, как правило [3]. Повышенный интерес к ПЩФ возник после того, как Fishman W. в 1968 году [6] обнаружил в ткани аденокарциномы легкого, плевральном экссудате и сыворотке больного раком легкого термостабильную щелочную фосфатазу, иммунохимически идентичную плацентарной, которую он назвал по имени больного «изоэнзим Регана». Таким образом, обнаружение в кровотоке фермента плацентарной щелочной фосфатазы (ПЩФ) имеет важное диагностическое значение при различных физиологических и патологических состояниях организма [1, 3]. Однако, несмотря на установленную ценность данного маркера для диагностики [1, 3], до настоящего времени не налажено коммерческое производство теста на этот белок для нужд практического здравоохранения. Вместе с тем в клинической лабораторной практике давно и широко применяется определение общей ЩФ сыворотки, основанное на оценке его ферментативной активности. Так как нет взаимосвязи между активностью ЩФ и содержанием ПЩФ, неправильно ставить знак равенства между этими двумя анализами. В этой связи существует необходимость разработки тест-системы для индикации сывороточных уровней ПЩФ.

Цель исследования: сравнить эффективность и диагностическую ценность различных методов определения сывороточных уровней плацентарной изоформы щелочной фосфатазы.

Материалы и методы. Для количественного определения ПЩФ в 36 экстрактах тканей применяли методы: двойной радиальной иммунодиффузии (РИД) в агаре по О. Оухтерлони в модификации Н.И. Храмковой и Г.И. Абелева [5] (чувствительность этого классического метода 3-5 мкг/мл), встречного иммуноэлектрофореза по Кону (1970) (чувствительность метода 100-300 нг/мл), метод «ракетного» иммуноэлектрофореза [5] (чувствительность метода 1-3 мкг/мл). Активность ЩФ оценивали фотометрически с применением соответствующих субстратов и красителей после предварительного разделения изоформ различными методами электрофореза в агарозе или в полиакриламидном геле [2, 3].

ПЩФ определяли количественными методами иммуноэлектрофореза или иммунодиффузии после окрашивания преципитатов на щелочную фосфатазу, остальные фосфатазы в единицах Боданского методом электрофореза на агарозе и в ПААГ с применением соответствующих ингибиторов и денситометрии [2].

Для проведения иммуноферментного анализа ИФА [4] на ПЩФ, из полученной на первом этапе моно-специфической антисыворотки выделяли антитела класса IgG сочетанием методов негативной ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе и осаждения сульфатом аммония 40% насыщения. Антитела к ПЩФ в концентрации 1 мкг/мл адсорбировались на стрипах или планшетах для иммуноферментного анализа. После инкубации стрипов с исследуемыми образцами сывороток и промывки планшетов, регистрацию результатов ИФА в стрипах или 96-луночных планшетах «Nunc» (Дания) проводили на фотометре с вертикальным ходом луча «Titertech Multiscan» фирмы «Flow Laboratories» (Англия) при длине волны 492 нм в случае использованием субстрата (паранитрофенилфосфата или БАПНА) и красителя из метода Боданского.

Результаты. Активность ЩФ выявлена в 100% во всех сыворотках беременных и доноров. После прогревания в сыворотках сохранялась только активность ПЩФ, ингибируемая фенилаланином. ПЩФ таким методом выявлялась в 68% сывороток беременных и в 3% сывороток доноров. В остальных методах определения щелочной фосфатазы использовался иммунохимический принцип, основанный на реакции антиген (ПЩФ) -антитело. Моноспецифические антисыворотки к ПЩФ получены нами самостоятельно путем гипериммунизации кроликов породы «шиншилла серая» очищенными и полуочищенными препаратами этого фермента. Мо-носпецифические антисыворотки на ПЩФ использованы для получения иммунодиффузионных и иммунофер-ментных наборов на ПЩФ.

Чувствительность иммунодиффузионного анализа (ИДА) ПЩФ не отличалась от первого метода, однако за счет иммунохимического принципа специфичность определения ПЩФ составила 100%. Следует обратить внимание, что по сравнению с классическим ИДА чувствительность метода для ТЩФ составила 0,1-0,5 мкг/мл. По сравнению с ИДА чувствительность ракетного иммуноэлектрофореза была в 2 раза, а встречного - в 5 раз выше (р<0,01). Оба метода выявляли ПЩФ во всех сыворотках беременных и у четверти доноров.

Методом иммуноферментного анализа (ИФА) на ПЩФ достигнуты наилучшие результаты: используя различные разведения чистого препарата ПЩФ, определена чувствительность метода ИФА, которая составила 50 нг/мл. Этот уровень чувствительности теста позволяет выявлять существенные различия в концентрациях ПЩФ в сыворотках беременных различного срока гестации и некоторых групп больных. В отличие от стандартного ИФА наша модификация проще, так как не требует этапа нанесения конъюгата белок-пероксидаза.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Асфандияров Р.И., Лазько А.Е., Коханов А.В. Изомеры щелочной фосфатазы и остеогенез // Морфология. - 2002. - Т. 121 - № 2-3. - С. 13.

2. Вилкинсон Д. Принципы и методы диагностической энзимологии. - М.: Медицина, 1981. - 624 с.

3. Голубев А.М. Изоферменты новообразований. - М.: Медицина, 1981. - 144 с.

4. Иммуноферментный анализ / под ред. Т. Нго, Г. Ленхоффа - М.: Мир, 1988. - 446 с.

5. Иммунохимический анализ / под ред. Л. А. Зильбера - М.: Медицина, 1968. - 238 с.

6. Fishman W.H. Immunologic and biochemical approaches alkaline phosphatase isoenzyme analysis: the

Regan isoenzyme. // Ann. N.Y. Acad. Sci. - 1969. - Vol. 166. - P. 745-749.

Коханов Александр Владимирович, доктор медицинских наук, доцент кафедры биохимии с курсом клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, Россия, 414000, г. Астрахань, ул. Бакинская, 121, тел. (8512) 52-51-64.

Мусатов Олег Валентинович, кандидат медицинских наук, докторант кафедры оперативной хирургии ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, Россия, 414000, г. Астрахань, ул. Бакинская 121, тел. (8512) 52-51-64

Мяснянкин Александр Алексеевич, врач-нейрохирург, нейрохирургическое отделение ГБУЗ АО «Александро-Мариинская областная клиническая больница», Россия, 414056, г. Астрахань, ул. Татищева 2, тел. (8512) 25-32-61, e-mail: lazer@astranet.ru__________________

Асфандияров Растям Измайлович], доктор медицинских наук, проф. кафедры анатомии человека ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, Россия, 414000, г. Астрахань, ул. Бакинская, 121., тел. (8512) 52-41-43, e-mail: agma@astranet.ru

Ямпольская Ирина Сергеевна, заочный аспирант кафедры биохимии ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, Россия, 414000, г. Астрахань, ул. Бакинская, 121., тел. (8512) 52-4143, e-mail: agma@astranet.ru