CC BY
14
УДК 661.124
Мохова Е.К., Пальчикова В.В., Соколова Е.А., Гордиенко М.Г.
РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ МАТЕРИАЛОВ ДЛЯ ГЕМОСОРБЦИИ И КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК
Мохова Елизавета Константиновна, студентка 4 курса факультета цифровых технологий и химического инжиниринга;
Пальчикова Вера Викторовна, аспирант 2 года обучения факультета цифровых технологий и химического инжиниринга, e-mail: vverapalchik@gmail.com;
Соколова Екатерина Алексеевна, студентка 2 курса факультета цифровых технологий и химического инжиниринга;
Гордиенко Мария Геннадьевна, к.т.н., доцент кафедры кибернетики химико-технологических процессов; Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д.20.
Полученные материалы, представляют собой полимерные, гидрогелевые микросферы (частицы) размером 200-900 мкм, состоящие из альгината натрия и хитозана различной молекулярной массы. Экспериментально установлено, что полученные образцы проявляют высокую сорбционную способность, хорошую гидрофильность, и не проявляют цитотоксические свойства, что позволяет использовать их в качестве сорбентов, а также матриц для культивирования клеток.
Ключевые слова: гемосорбция, биополимеры, сорбционная емкость, культивирование клеток, микросферы.
DEVELOPMENT OF TECHNOLOGY FOR PRODUCING MATERIALS FOR HEMOSORPTION AND CULTIVATION OF CELLS
Mokhova E.K., Palchikova V.V., Sokolova E.A., Gordienko M.G. D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia
The resulting materials are polymer, hydrogel microspheres (particles) of 200-900 microns in size, consisting of sodium alginate and chitosan of various molecular weights. It was experimentally established that the obtained samples exhibit high sorption ability, good hydrophilicity, and do not exhibit cytotoxic properties, which allows them to be used as sorbents, as well as matrices for cell cultivation.
Keywords: hemosorption, biopolymers, sorption capacity, cell cultivation, microspheres.
Введение
Микросферы на основе биополимеров могут быть использованы в медицине в качестве гемосорбентов. Благодаря высокой сорбционной емкости материал способен впитывать большое количество жидкости, а входящие в его состав полисахариды обеспечивают такие свойства материала как: биосовместимость,
биодеградируемость, гипоаллергенность и биоцидность [1].
В настоящее время бурно развивается такое направление, как 2D и 3D культивирование клеток. В отличие от двумерных (2D) систем выращивания, в которых клетки растут, прикрепляясь к поверхности пластикового субстрата, трехмерные (3D) системы обеспечивают имитацию внеклеточного матрикса, что позволяет клеткам, растущим в условиях in vitro, приобретать фенотипы и реагировать на раздражители, аналогично биологическим системам in vivo. Разработанные гидрогелевые микросферы, помимо применения в медицине в качестве гемосорбентов, также могут быть использованы и в качестве 3D культуральной системы, благодаря своей макропористой структуре, которая обеспечивает пролиферацию и дифференцировку клеток в условиях in vitro. Входящие в состав микроносителей природные полисахариды, такие
как, альгинат натрия и хитозан могут служить питательной средой для роста и развития клеток. Для успешного применения микросфер в области биотехнологии и тканевой инженерии они должны обладать высокими адгезионными свойствами, быть биосовместимыми и биодеградируемыми.
Составляющий основу полимерных частиц альгинат натрия является ионогенным полисахаридом природного происхождения. Его получают путем щелочной экстракции бурых водорослей. Благодаря своим ценным свойствам, альгинат натрия пользуется широким спросом в медицине, фармакологии, косметической и пищевой промышленностях, как стабилизатор,
гелеобразователь и пищевая добавка Е401. Высокая водоудерживающая способность, отсутствие токсичности, биодеградируемость и
гипоаллергенность альгинатных гидрогелей позволяет разрабатывать на их основе новые материалы биотехнологического,
фармакологического и медицинского назначения. В частности, такие гидрогели могут быть использованы при создании систем доставки лекарств и ранозаживляющих покрытий [2]. Также, не мало важной особенностью альгината натрия является его способность образовывать нерастворимые гели с растворами солей
бивалентных металлов, которые содержат ионы Са2+, Ва2+, бг2+.
Для создания полупроницаемой мембраны, частицы покрывают слоем хитозана, который представляет собой линейный аминополисахарид, являющийся продуктом процесса щелочного деацетилирование хитина. Хитин, в свою очередь, получают из экзоскелетов насекомых и ракообразных. Хитозан можно охарактеризовать как биосовместимый, биоцидный, фунгицидный и биодеградируемый природный материал. Большое количество свободных аминогрупп в молекуле хитозана, позволяет ему связывать ионы водорода и приобретать избыточный положительный заряд, именно поэтому хитозан способен ускорять свертываемость крови в области ранения, т.к. эритроциты имеют отрицательный заряд. Биологически активные свойства хитозана, в первую очередь, связывают с его молекулярной массой (степенью полимеризации). Установлено, что низкомолекулярный хитозан в большей степени проявляет биоцидные свойства, по сравнению с среднемолекулярным хитозаном, это связано с тем, что молекулам меньшего размера легче проникать в цитоплазму клеток. Также хитозан является перспективным материалом для получения новых биологически активных форм в комплексе с другими биополимерами или низкомолекулярными веществами [3].
В работе были проведены исследования по оценке сорбционной емкости полученных гидрогелевых частиц в зависимости от молекулярной массы используемого хитозана и концентрации вводимой соды. Дополнительно полимерные микросферы исследовали на растворимость, рН и цитотоксичность.
Материалы и методы
Для приготовления сферических частиц использовали реактивы, такие как:
низкомолекулярный хитозан (50 - 190 кДа), (Б1§ша-АЫгюЬ); среднемолекулярный хитозан (190 - 310 кДа), (81§ша-АЫгюЬ); натрий альгинат (РусХим); этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) (РусХим); кальций хлористый (СаС12) б/в, «Ч» (Химмед); натрий хлористый (ЫаС1) «ХЧ» (Химмед); натрий гидрокарбонат (ЫаНС03) «ХЧ» (Химмед); уксусная кислота (81§ша-АЫгюЬ).
Гидрогелевые микросферы получали следующим образом. Готовили 100 мл 2% раствора альгината натрия и 100 мл 2% раствора СаС12. После чего, раствор альгината натрия с помощью перистальтического насоса (скорость подачи 0,28 мл/мин) или шприца прокапывали в раствор СаС12 при постоянном перемешивании. Сформированные кальций-альгинатные частицы промывали несколько раз 0,9% раствором №С1 и инкубировали в 0,2% растворе хитозана (рН=1) в течение 10 минут. Полученные кальций-альгинат-хитозановые частицы обрабатывали раствором ЭДТА (0,1М) в течение 30 минут для удаления ионов кальция и создания более
жидкого геля внутри частиц. Затем, полученные альгинат-хитозановые частицы заливали 0,9% раствором КаС1 и помещали в холодильник при температуре +6°С на сутки для полной промывки. По истечении времени гидрогелевые микросферы замораживали в скороморозильном шкафу при температуре -20°С для создания состояния, подходящего для дальнейшей вакуумной сублимационной сушки, которую проводили с помощью лиофилизатора CoolSafe (Дания).
Для создания более пористой структуры материала в образцы, на стадии их приготовления, добавляли КаНС03 в следующих соотношениях к объему альгината натрия:
1. Образец «а» - 0%.
2. Образец «б» - 0,5%.
3. Образец «в» - 0,75%.
4. Образец «г» - 1%.
В случае образцов «б» - «г» в раствор СаС12 добавляли уксусную кислоту в количестве 5% от общего объема СаС12. Уксусная кислота вступала в химическую реакцию с КаНС03, при этом наблюдалось интенсивное выделение углекислого газа. Часть образцов инкубировали в растворе низкомолекулярного хитозана, другую часть в растворе среднемолекулярного хитозана.
После того, как все образцы были получены, проводился тест на растворимость. Для этого микросферы заливали водой (10 мл) в чашке Петри и оставляли их на 5 суток, при комнатной температуре.
Значения активности ионов водорода у всех образцов были приблизительно одинаковы - рН ~ 5.
Измерение сорбционной емкости микросфер проходило следующим образом. На аналитических весах взвешивали сухие частицы, затем их заливали водой и оставляли на 30 минут. По истечении времени образцы, адсорбировавшие воду, также взвешивали. Сорбцию рассчитывали по формуле (1):
т1
где о - сорбционная емкость, %; ш1 - масса сухого материала, г; ш2 - масса материала, впитавшего воду, г.
Результаты и обсуждения
Было наработано 4 образца с содержанием низкомолекулярного хитозана - образцы «а - 1» - «г - 1», и 4 образца с среднемолекулярным хитозаном -образцы «а - 2» - «г - 2». Тесты на растворимость показали, что все образцы по истечении времени не растворились, кроме того, образцы «а» - «в» не утратили своей структурной целостности, однако у образцов «г» наблюдалась потеря формы. Можно предположить, что данные результаты связаны с тем, что в образцах «г» было наибольшее содержание соды, и дальнейшее выделение углекислого газа приводило к разрыву структуры частиц.
Образцы «а - 1» были переданы в отдел биомедицинских технологий и лаборатории клеточных технологий ФГБУ «НМИЦ РК» Минздрава России для испытаний с
мультипотентными мезенхимальными
стромальными клетками. Результаты показали, что образцы не проявляют цитотоксические свойства и среду не закисляют.
На рисунке 1 представлены низкомолекулярные образцы («а - 1» - «г - 1» слева на право) и среднемолекулярные образцы («а - 2» - «г - 2» слева
на право) до и после добавления воды.
Визуально можно наблюдать как микросферы значительно увеличились в объеме.
По результатам исследований образцов на сорбционную способность была составлена диаграмма, представленная на рисунке 2.
б г
Рис. 1. Образцы до и после добавления воды, а - низкомолекулярные образцы в сухом состоянии; б -низкомолекулярные образцы, адсорбировавшие воду; в - среднемолекулярные образцы в сухом состоянии; г -
среднемолекулярные образцы, адсорбировавшие воду
Рис. 2. Диаграмма сорбционной емкости образцов
Стоит отметить, что образцы на основе среднемолекулярного хитозана проявляют большую сорбционную способность по сравнению с низкомолекулярными образцами. Предполагается, что с увеличением молекулярной массы хитозана растет и сорбционная способность материала. Образцы «б - 1» и «б - 2», каждый в своей группе, показали наилучшие результаты сорбционной способности, поэтому концентрацию соды, равной 0,5% можно считать оптимальной для достижения высокой сорбционной емкости.
Таким образом, были получены образцы, которые хорошо впитываю и удерживают влагу, а также не проявляют цитотоксичность. Найдена зависимость между молекулярной массой
используемого хитозана и сорбционной емкостью получаемого на его основе материала. Определена оптимальная концентрация вводимой в образцы соды на стадии их приготовления (0,5%). Полученные материалы могут найти свое применение в таких областях как: биотехнология, тканевая инженерия, трансплантология и регенеративная медицина в качестве гемосорбентов или микроносителей для 3Б культивирования клеток.
Список литературы
1. Патент РФ № 2008108187/15, 04.03.2008. Сорбент для удаления антител из цельной крови и способ его получения // Патент России № 2360707. 10.07.2009 Бюл. № 19. / Бовин Н.В., Селина. О.Е., Марквичева Е.А.
2. Юсова А.А. Свойства гидрогелей на основе смесей альгината натрия с другими полисахаридами природного происхождения / Юсова А.А., Гусев И.В., Липатова И.М. // Химия растительного сырья. - 2014. - № 4. - С. 59-66.
3. Шиповская А.Б. Биологическая активность олигомеров хитозана / Шиповская А.Б. [и др.] // Известия Саратовского университета. Сер. Химия. Биология. Экология. - 2008. - Т. 8. -Вып. 2. - С. 46-49.
