CC BY
198
Таблица 4
Показатели продуктивности поросят на 40-е сутки
Показатель 1 группа 2 группа 3 группа
Масса гнезда, кг 77,90+3,41 85,53+4,51 96,33+3,86**
% от контроля 100 109,79 123,66
Живая масса поросенка в среднем на голову, кг 7,72+0,22 9,12+0,38* 10,26+0,39***
% от контроля 100 118,13 132,90
Среднесуточный прирост, г 143,37 175,68 191,84
% от контроля 100 122,54 133,81
Абсолютный прирост, г 155,65 188,68 213,58
% от контроля 100 121,22 137,22
Относительный прирост, % 135,14 141,16 142,64
% от контроля 100 104,45 105,55
р<0,001, **р<0,01, * Р<0,05
Сохранность поросят 40-суточного возраста
Таблица 5
Показатель 1 группа 2 группа 3 группа
Сохранность, % 93,85 98,80 97,83
% от контроля 100 105,27 104,24
Поросят всего, гол 8,13+1,19 10,00+0,80 11,50+0,80*
% от контроля 100 123,00 141,45
Поросят живых, гол 7,63+1,05 9,88+0,79 11,25+0,70*
% от контроля 100 129,49 147,44
* р<0,02
чем в контроле. Следовательно, введение препаратов бетацинола и бетавитона в качестве добавок в рационы молодняка свиней оказало ростстимулирующее действие, увеличивая их скорость роста.
На 40-е сутки эксперимента учет продуктивности подопытных животных показал (табл. 4), что динамика в группах с применением бета-каротиновых препаратов шла в сторону увеличения показателей продуктивности поросят. Масса гнезда во 2-й группе увеличилась на 9,79% (р>0,05) и достоверно на 23,66% (р<0,01) в 3-й группе. Живая масса поросенка в среднем на голову стала больше соответственно на 18,13% (р<0,05) и на 32,9% (р<0,001). Среднесуточный прирост, у 40-суточных просят опытных групп, вырос соответственно на 22,54% и 33,81% (табл.
4). Абсолютный прирост, характеризующий увеличение живой массы за 40 суток, у молодняка 2-й группы повысился на 21,22% и на 37,22% - в 3-й группе. Относительный прирост тоже увеличился соответственно на 4,45% и 5,55%.
Все показатели рассматривали в сравнении с данными их сверстников контрольной группы.
Сохранность поросят (табл. 5) за подсосный период до 40-суточного возраста, перед отъемом от маток, под влиянием бета-кароти-новых добавок возросла с 93,85% в контроле до 98,80% и 97,83% в опытных группах и была выше соответственно на 5,27 и 4,24%.
В том числе количество поросят в гнезде в группах с использованием добавок увеличилось во 2-й на 23,0% (р>0,05) и в 3-й группе - на 41,45% (р<0,02). Живых поросят было больше на 29,49% (р>0,05) во 2-й группе и на 47,44% (р<0,02) в 3-й, по сравнению с контролем.
Выводы
Таким образом, введение в рацион свиноматок и растущего молодняка свиней бета-каротиновых препаратов водно-дис-персной формы способствует увеличению их продуктивности, в том числе повышению приростов живой массы, высокой интенсивности и энергии роста, жизнеспособности и сохранности поросят раннего постэмбриогенеза. Наибольший продуктивный эффект получен при использовании препарата бета вито н.
Библиографический список
1. Проворов, A.C. Углеводный обмен у поросят при использовании новых препаратов бета-каротина /A.C. Проворов, C.B.
Дежаткина, H.A. Проворова //Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - 2011. - N° 206.-С. 179-185.
2. Kolb, Е. Die Bedeutung des Vitamins А fur das immunsystem /Е. Kolb //Ubersichtsef. Berl.Berl u munches tierartlWscr., Bd 108. H. 10. - 1995.-S. 385-390.
3. Paulo, M.G. An isocratic L С mebohod forthe simultaneous determination of vitamins А, С, E and beta-carotene /M.G. Paulo, Y.M. Margues, J.A. Morais, et al. - Pharm Biomed
Anal. - 1999. - 21. - №2. - P. 399-406.
4. Solomons, N.W. Plant sources of vitamin A and human nutriture: how much is still too little / N.W. Solomons. - Nutr Rev. - 1999. - № 11.-P. 350-353.
5. Мерзленко, P.A. Вододисперсный комплекс жирорастворимых витаминов в животноводстве / Р.А. Мерзленко, Л.В. Рез-ниченко, О.В. Мерзленко //Ветеринария сельскохозяйственных животных. - 2005. -№ 7.-С. 58-60.
6. Фаритов, Т.А. Корма и кормовые добавки /Т.А. Фаритов. - СПб.: Издательство «Лань».-2010.-304с.
УДК: 619:618
РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИОФИЛИЗИРОВАННОГО БИОПРЕПАРАТА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Хлынов Дмитрий Николаевич, научный сотрудник научно-образовательного центра УГСХА*
Богданов Ильгизар Исмаилович, кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ВСЭ»*
Богданова Марина Анатольевна, кандидат биологических наук, доцент кафедры «Морфология, физиология и патология животных» *
Фомин Александр Николаевич, кандидат технических наук, доцент** *ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина» 432017, г.Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1; тел. 8(8422) 55-95-83, e-mail: [email protected]
**000 «Научно-Технический Центр «ПромТехЭнерго»
432071, Ульяновская область, Ульяновск, ул. Федерации, 50; тел./факс:8 (8422) 44-35-11, e-mail: [email protected]
Ключевые слова: крупный рогатый скот, стельность, диагностика, лиофилизация. В статье представлены результаты научно-исследовательской работы по разработке технологии получения и лабораторного тестирования лиофилизированного экс-пресс-теста для определения беременности крупного рогатого скота.
Введение
Успешное осуществление мероприятий по борьбе с бесплодием коров на каждой животноводческой ферме немыслимо без строгого ветеринарно-зоотехническо-го контроля, позволяющего планировать на протяжении календарного года запуск, роды, осеменение животных и текущую внутрифермную работу; своевременно пополнять стадо молодняком, квалифициро-
ванно проводить выбраковку животных, непригодных к воспроизводству и т.д. Достижение этих целей возможно только на основе регулярных диагностических исследований на беременность и бесплодие, а также ежедневного учета в маточном стаде основных групп животных: беременных, в послеродовом периоде и осемененных [1,2].
Коллективом авторов (Богданов И.И., Богданова М.А., Багманов М.А., Хлынов Д.Н.,
Фомин А.Н.) разработан биопрепарат -экспресс-тест для диагностики беременности и бесплодия коров. Экспресс-тест основан на иммунологической реакции идентификации хорионического гонадотропина в моче коров [3,4,5].
Данный препарат показал себя как высокоэффективное диагностическое средство, позволяющее устанавливать беременность в достаточно ранние сроки. Следует отметить, что география потребителей препарата достаточно широка и включает регионы России и зарубежные страны с различными климатическими условиями, неблагоприятно отражающимися на качестве биопрепарата при его пересылке и транспортировке. Жидкие препараты требуют определенного режима хранения и транспортирования - от +2 до + 4°С, нарушение которого как в сторону повышения, так и в сторону понижения температуры могут приводить к полной потере активности. В связи с этим возникает необходимость усовершенствования формы выпуска экспресс-теста, позволяющей исключить вышеуказанные отрицательные воздействия. В данном аспекте одним из решений проблемы является разработка лиофили-зированной формы диагностикума.
Отсутствие унифицированной технологии лиофильного высушивания биологических объектов обусловливает необходимость проведения исследований по стабилизации каждого конкретного препарата.
Цель работы: Разработать технологию получения экспресс-теста для диагностики беременности и бесплодия домашнего скота в лиофилизированной форме.
В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:
1. Разработать технологию и лабораторный регламент получения экспресс-те-ста в лиофилизированной форме для диагностики беременности домашнего скота;
2. Получить опытную партию диагностического препарата и провести его лабораторное испытание;
3. Разработать требования к качеству
разрабатываемых тест-полосок с учетом интересов потребителей, требований к продукции для жизни, здоровья людей и животных, окружающей среды.
Объекты и методы исследований
Объектом исследования являлась технология получения экспресс-теста для диагностики беременности и бесплодия домашнего скота в лиофилизированной форме.
Были использованы следующие реактивы и лабораторная посуда: препарат «Гонадотропин хорионический для инъекций», вазелиновое масло, ланолин, ализарин, дистиллированная вода, борная кислота (порошок), физиологический раствор 0,9%, глицин, маннитол, шприц инъекционный одноразовый с иглой, 2,5 см3, шприц инъекционный одноразовый с иглой, 5 см3, спирт, 96°, вата хирургическая нестерильная, пробирки, колбы мерные, пипетки пастеровские, пипетки мерные на 1,0; 2,0; 5,0; 10 см3, флаконы емкостью 50, 100 см3
Использованное оборудование:холодильники бытовые, термостаты ТС-80М-2, автоклав ВК-75, аквадистиллятор, сушильный шкаф, сублимационный камерный аппарат марки 1_аЬсопсо, низкотемпературный холодильник (- 500С).
В качестве лабораторных животных были использованы кролики массой 1,5 - 2 кг.
Результаты исследований
Лиофилизация — способ мягкой сушки веществ, при котором высушиваемый препарат замораживается, а потом помещается в вакуумную камеру, где и происходит возгонка растворителя. Сухие препараты, полученные лиофилизацией, не претерпевают химических изменений и не теряют присущих им свойств при длительном хранении даже при положительных значениях температуры, вследствие чего упрощаются условия транспортировки и хранения, увеличивается срок годности. При лиофилизации большинство белков не подвергается денатурации и может длительно сохраняться при умеренном охлаждении (около 0 °С). Лиофилизированные ткани и препараты при увлажнении восста-
навливают свои первоначальные свойства.
Лиофилизации, как правило, подвергаются микроорганизмы и бактериофаги. Она широко применяется для получения способной к долговременному хранению плазмы крови (сухая плазма) и ее отдельных фракций, иммунных сывороток, иммуноглобулинов, вакцин, антибиотиков, гормонов, трансплантатов тканей, поэтому для них отработаны разнообразные режимы замораживания и высушивания [6,7].
Отсутствие унифицированной технологии лиофильного высушивания биологических объектов обусловливает необходимость проведения исследований по стабилизации каждого конкретного препарата.
В качестве стабилизаторов при лиофилизации биопрепаратов используют:
• 0,5% сыворотки крови лошади или
КРС
• 20,0%-ый раствор желатина
• 20,0%-ый раствор лактозы
• 40,0%-ый раствор пептона,
• 60,0%-ый раствор сахарозы
• 80,0%-ый раствор сорбита
Рекомендуются следующие прописи
стабилизаторов:
1 серия - лактоза (4,0%), пептон (20,0%);
2 серия - ГЛА (2,5%), сахароза (5,0%), глутамат Ыа (1,0%);
3 серия - сахароза (50,0%), пептон (10,0%);
4 серия - пептон (20,0%), лактоза (4,0%);
5 серия - ГЛА (5,0%), сахароза (10,0%), желатин (1,0%)
В технической жидкости серии 1,2,3 соотношение стабилизатора и вирусного сырья 1:1. Техническая жидкость в сериях 4 и 5 содержала 40% стабилизатора и 60% вирусного сырья.
Известен способ лиофилизации биопрепарата, включающий этапы его замораживания и вакуумного обезвоживания. Однако процесс лиофилизации по данной технологии зачастую ведет к значительной (иногда полной) потере специфической активности препарата, а лиофилизированный
материал часто «размазан» по дну флакона вследствие малого содержания суммарного сухого остатка.
Предлагаемый метод лиофилизации, рекомендованный Henderson L.O. [8] и выбранный нами, включает добавление в раствор биопрепарата перед лиофили-зацией стабилизаторов - смеси глицина и маннитола. Это позволит уменьшить падение биологической активности на этапе лиофилизации.
Разработанный нами метод изготовления лиофилизированного биопрепарата [9,10] в соответствии с подготовленным лабораторным регламентом включал следующие операции (этапы):
1. Изготовление жидкой формы биопрепарата.
2. Лиофилизация
Лиофилизация проводилась в сублимационных камерных аппаратах марки Labconco. Продолжительность режима лиофилизации - (25±1) часов. Начальные параметры температуры конденсатора сублимационной установки составляли -(60±2)°С, температура греющих полок - -(42±2)°С, температура материала -(50±1)°С, глубина вакуума - 5,3-5,9 Па.
Герметизацию ампул после лиофилизации осуществляли в атмосфере осушенного очищенного воздуха при нормальном атмосферном давлении.
3. Контроль качества лиофилизированного биопрепарата.
3.1. Определение внешнего вида и цвета.
3.2. Определение запаха препарата.
3.3. Определение стерильности
3.4. Определение диагностической точности
Диагностическую точность препарата определяли в лабораторных условиях. В качестве индикатора использован раствор препарата «Хорионический гонадотропин для инъекций» с удельной активностью 1000 МЕ/л.
Была получена партия экспериментального образца лиофилизированного биопрепарата в количестве 50 диагности-
Таблица 1
Органолептические, физико-химические и биологические свойства лиофилизированного биопрепарата для определения беременности и бесплодия коров
Показатель Характеристика и норма
Внешний вид Ампулы (пробирки) с сухим осадком (таблеткой) на дне
Цвет Оранжевый
Запах Без ярко выраженного запаха
Стерильность Рост на питательных средах отсутствует
Диагностическая точность 100% при наличии гормона
100% при его отсутствии в пробе
ческих проб.
В результаты лабораторного испытания получены следующие показатели, характеризующие препарат (таб. 1)
Были также разработаны следующие требования к качеству разрабатываемого диагностического препарата с учетом интересов заказчиков (потребителей), требований к продукции для жизни, здоровья людей и животных, окружающей среды:
1) Требование к возможности использования экспресс-теста в условиях животноводческих ферм и частных подворий без использования специализированного оборудования
Экспресс-тест используется в условиях животноводческих ферм и частных подворий без использования специализированного оборудования;
2) Требование к безопасности процедуры диагностики стельности и бесплодия коров и исключению вероятности заражения ветеринарных специалистов и животных заболеваниями инфекционного происхождения
Процедура диагностики стельности и бесплодия коров должна быть безопасной и исключать, при соблюдении правил асептики и антисептики, вероятность заражения ветеринарных специалистов, других лиц, выполняющих диагностические манипуляции, и животных заболеваниями инфекционного происхождения;
3) Максимальное количество доз препарата, необходимых для разовой диагностики
Не более 1;
4) Минимальное значение срока стельности, при котором можно диагностировать стельность и бесплодие
Не менее 15 дней после осеменения.
5) Точность выполняемых диагностических мероприятий
Степень соответствия при постановке диагноза на наличие или отсутствие беременности у животных (диагностическая эффективность) должна составлять не менее 98%
6) Требование к удобству и простоте использования.
Для тестирования необходима пробирка и резиновая перчатка. Процедура постановки диагноза может быть выполнена как ветеринарными специалистами, так и вспомогательным персоналом или владельцем животного в частном подворье. Читка реакции визуально четкая, позволяющая правильно оценить результаты постановки тест-пробы.
7) Требование к длительности процедуры диагностики.
Не более 15 минут для диагностических манипуляций, не более 1 часа для оценки результатов тестирования (читки);
8) Требование к продукции по воздействию на окружающую среду
Компоненты экспресс-теста являются нетоксичными, их утилизация не требует специальных мер предосторожности. Утилизация препарата должна осуществляться в соответствии с ГОСТ 12.1.007-76.
9) Требование к сроку хранения препарата
Не менее 3-х лет
10) Требование к стоимости препарата
Не более 100 руб. за 1 одну диагностическую пробу.
Тестирование функциональных характеристик и потребительских свойств экспериментального образца препарата будет осуществляться в рамках производственных опытов.
Выводы
В соответствии с поставленной целью была разработана технология получения экспресс-теста в лиофилизированной форме для диагностики беременности домашнего скота. Результаты испытания полученной опытной партии препарата подтверждают возможность использования диагностического средства. Разработаны, для дальнейшего тестирования, требования к функциональным характеристикам и потребительским свойствам препарата.
Библиографический список
1. Гордон, А. Контроль воспроизводства сельскохозяйственных животных / А. Гордон. - М.: Агропромиздат, 1988. - 415 с.
2. Бурдов, Г.Н. Ранняя диагностика стельности методом ИФА / Г.Н. Бурдов, Е.И. Марасинская, С.А. Селезнев, Е.А. Загрегина // Ветеринарный врач. - 2001. -№3. - С. 30-31.
3. Богданов, И.И. Хорионический го-надотропин как индикатор беременности коров / И.И.Богданов, М.А.Богданова, А.Н. Фомин // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. -2011. - N93. - С.68-73.
4. Богданов, И.И. Иммунологический экспресс-тест на беременность и бесплодие коров/ И.И. Богданов, М.А.Богданова, А.Н.Фомин // Вестник ветеринарии. - 2011. -Том 59. №4.-С. 11-12.
5. Богданов, И.И. Перспективы применения экспресс-метода диагностики беременности и бесплодия коров / И.И. Богданов, М.А. Богданова, А.Н. Фомин, Д.Н. Хлынов // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. -2012. - №1. - С.74-78.
6. Loi, P. Towards storage of cells and gametes in dry form. / P.Loi, D.luso, M.Czernik, F.Zacchini, , G. Ptak, // Trends in biotechnology, 31(12), 688-695. doi: 10.1016/j. tibtech. 2013.09.004
7. Dong, A. Infrared spectroscopic studies of lyophilization-and temperature-induced protein aggregation / A. Dong, S. J.Prestrelski, S.D. Allison // Journal of Pharmaceutical Sciences. - 1995. - T. 84. - №. 4. - C. 415-424.
8. Henderson, L.O. Preparation of lyophillzed human serumbased reference materials withgraded levels of apolipoproteins A-l and В/ L.O.Henderson, J.S.Hazlehurst, L.Taylor, W.H. Hannon// Clin.Biochem. - 1988. -v.21. - p.219-223.
9. Хлынов, Д.Н. Разработка тест-полосок для экспресс-диагностики беременности и бесплодия коров / Д.Н. Хлынов, И.И. Богданов, М.А. Богданова // Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения: Материалы V Международной на-учно-практической конференции. - 2012. -Том 1. - С.168-172
10. Хлынов, Д.Н. Подбор метода ли-офильной сушки биопрепарата для диагностики беременности и бесплодия домашнего скота/ Д.Н.Хлынов, И.И.Богданов, М.А.Богданова // Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения: Материалы V Международной научно-практиче-ской конференции. - 2013. Том 2. - С. 200-202.
