CC BY
18УДК 602.68:57.083 575.153
Alexei A. Sazanov, Dmitry O. Vinokhodov, Badriddin Selami, Nathan Torres, Ekaterina E. Zueva, Nadezhda V. Tolstyh, Roman Yu. Seliverstov, Mikhail I. Zaraysky M.I.
LEVELS OF MICRORNA-21 FOR THE GLIOMAS DIAGNOSTICS
St Petersburg State Institute of Technology (Technical University), Moskovsky Pr., 26, St Petersburg, 190013, Russia Pavlov First St Petersburg State Medical University, st. Leo Tolstoy, 6/8, St. Petersburg, 197376, Russia Bechtereva Institute of Human Brain RAS, st. Akad. Pavlov, 9 197376, St. Petersburg, Russia e-mail:vinokhodov@list.ru
This investigation is devoted to the search for new biomarkers of malignant tumors of the brain. Levels of gene expression of microRNA-21 were profiled in blood plasma in patients with glioma at stage of progression and in healthy volunteers by real time polymerase chain reaction (RT-PCR). A statistically significant excess of the levels of expression of the gene under study in patients with glioma compared with healthy volunteers. On the basis of the data suggested the development of molecular diagnosics of glioma.
Keywords: molecular diagnostics, microRNA, miR-21 gene expression profiling, polymerase chain reaction in real time (RT-PCR), glioma
77.29 616-092.6 616-006.04
А.А. Сазанов1, Д.О. Виноходов2, Б. Селлами3, Н. Торрес4, Е.Е. Зуева5, Н.В. Толстых6, Р.Ю. Селиверстов7, М.И. Зарайский8
РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ОЦЕНКИ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА МИКРОРНК-21 В ДИАГНОСТИКЕ ГЛИОМ
Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет), Московский пр. 26, Санкт-Петербург, 190013, Россия
2Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова, Льва Толстого ул. 6/8, Санкт-Петербург, 197376, Россия 3Институт мозга человека РАН им. Н.П. Бехтеревой РАН, ул. Акад. Павлова, 9, Санкт-Петербург, 197376, Россия e-mail:vinokhodov@list.ru
Исследование посвящено поиску новых биомаркеров злокачественных новообразований головного мозга. Исследованы уровни экспрессии гена микроРНК-21 в плазме крови больных глиомой в стадии прогрессирования и практически здоровых волонтеров методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ). Выявлено статистически достоверное превышение уровней экспрессии исследуемого гена у пациентов с глиомой по сравнению со здоровыми волонтерами. На основе полученных данных предложено создание системы молекулярной диагностики глиомы.
Ключевые слова: молекулярная диагностика, микроР-НК, т^-21, профилирование экспрессии генов, полиме-разная цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ), глиома
Введение
МикроРНК — это некодирующие молекулы РНК длиной около 20 нуклеотидов, которые участвуют в процессе регуляции экспрессии генов на транскрипционном и посттрансляционном уровнях. В последние годы изучению этих молекул отводится особая роль, так как они являются потенциальным решением проблем диагностики, прогнозирования и лечения злокачественных новообразований [1].
Глиальные опухоли составляют большую часть первичных опухолей центральной нервной системы и включают целый спектр опухолей различных по уровню клеточной дифференциации и злокачественности [2]. Все
злокачественные глиальные опухоли характеризуются выраженной способностью к инвазии в тканях головного мозга, отсутствием четких границ распространения опухоли и способностью к продолженному росту после хирургического удаления [3].
В злокачественных глиомах выявлено несколько аномально экспрессирующихся микроРНК. В частности, для первичных глиобластом характерна гиперэкспрессия т^-221, в то время как уровень и^-128, и^-181а, и^-181Ь и т^-181с — микроРНК, активно экспрессирующихся в нормальных тканях мозга, — существенно снижен [4]. Уровень т^-124 и и^-137 снижен не только в первичных глиобластомах, но и в анапластических астроцитомах, что,
1 Сазанов Алексей Александрович, д-р биол. наук, профессор, каф. молекулярной биотехнологии СПбГТИ(ТУ), e-mail: sazanov.alexei@gmail.com Alexei A. Sazanov, Dr Sci.(Biol.), Professor, Department of Molecular Biotechnology, SPbSTI(TU)
2 Виноходов Дмитрий Олегович д-р биол. наук, доцент, зав. каф. молекулярной биотехнологии СПбГТИ(ТУ), e-mail:vinokhodov@list.ru Dmitry O. Vinohodov, Dr Sci.(Biol.), Associate Professor, Head of Department of Molecular Biotechnology SPbSTI(TU)
3 Селами Бадриддин, аспирант, каф. молекулярной биотехнологии СПбГТИ(ТУ), e-mail: badrisellami@yahoo.com Badriddin Selami, graduate student Department of Molecular Biotechnology, SPbSTI(TU)
4 Торрес Натан, студент, каф. молекулярной биотехнологии СПбГТИ(тУ), e-mail: sartemius@mail.ru Nathan Torres, Student, Department of Molecular Biotechnology, SPbSTI(Tu)
5 Зуева Екатерина Евгеньевна, д-р мед. наук, профессор, каф. клинической лабораторной диагностики ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова, e-mail: yekaterina.zueva@gmail.com
Ekaterina E. Zueva, Dr Sci.(Med.), Professor, Department of Clinical Laboratory Diagnostics, Pavlov First St Petersburg State Medical University
6 Толстых Надежда Викторовна, врач ИМЧ им. Н.П. Бехтеревой РАН, e-mail: zaratustra-e@ya.ru Nadezhda V.Tolstih, doctor, Bechtereva Institute of Human Brain RAS
7 Селиверстов Роман Юрьевич, канд. мед. наук, зав. отделением функциональной диагностики ИМЧ им. Н.П. Бехтеревой РАН, e-mail: ruseliv@mail. ru
Roman Yu. Seliverstov, PhD (Med.), Head of the department of functional diagnostics, Bechtereva Institute of Human Brain RAS
8 Зарайский Михаил Игоревич, д-р мед. наук, профессор, каф. клинической лабораторной диагностики ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова, e-mail: mzaraiski@yandex.ru
Mikhail I. Zaraisky, Dr Sci.(Med.), Professor, Department of Clinical Laboratory Diagnostics Pavlov First St Petersburg State Medical University Дата поступления - 3 декабря 2016 года
I. ХИМИЯ И ХИМИЧЕСКАЯ ТЕХНОЛОГИЯ • ОРГАНИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ И БИОТЕХНОЛОГИЯ
Известия СПбГТИ(ТУ) № 33 2016
по всей видимости, указывает на их онкосупрессорную роль в опухолях данного типа [4]. Считается, что функционально эти микроРНК ингибируют клеточную пролиферацию в глиобластомах. Экспрессия т^-124 снижена также в медуллобластомах, при этом искусственное увеличение количества этих микроРНК в клеточных линиях приводило к снижению экспрессии онкогена CDK6 и замедлению пролиферации [5].
М^-21 имеет антиапоптотическую и проинвазивную функции в биологии глиом. Данная микроРНК обладает мощным стимулирующим действием, способствуя росту и пролиферации опухолевых клеток глиом через ингибирование экспрессии опухолевого супрессора РТЕК что приводит к активации Ак>зависи-мых сигнальных путей, связанных с усиленным синтезом проонкогенных рецепторов EGFR, IGFR и VEGFR [6, 7].
Кроме того, возможно, т^-21 регулирует гены, вовлеченные в процессы миграции клеток. Уровень т^-21 существенно выше в глиобластомах и клеточных линиях глиобластом по сравнению с нормальными клетками мозга. В ряде работ показано, что ингибирование т^-21 в клеточных линиях глиобластом вызывает активацию каспаз и, как следствие, индукцию апоптоза [8, 9].
Таким образом, исследование профилей экспрессии гена микроРНК-21 в плазме крови больных глиомой может позволить найти биологические маркеры, связанные с индукцией или супрессией апоптоза опухолевых клеток, которые могут быть использованы в ранней диагностике глиом.
Материал и методы
В работе были использованы 17 образцов периферической крови, стабилизированной ЭДТА, полученных от пациентов с глиомами различной степени злокачественности в стадии прогрессии заболевания и 8 образцов, полученных от практически здоровых волонтеров. Все пациенты находились под наблюдением в институте мозга человека имени Н.П. Бехтеревой РАН.
Тотальную РНК выделяли из плазмы крови с использованием реагента Т^еадеП (MRC, США), согласно стандартной методике производителя. Осадок РНК растворяли в 12 мкл РНК-элюента (Интерлабсервис, Москва).
Комплементарную ДНК (кДНК) получали на основе технологии <^ет^оор» с использованием набора для обратной транскрипции «ОТ-1» (Синтол, Москва). Реакцию проводили раздельно с праймерами для гена микроРНК-21 и референтного гена иб (малая ядерная РНК). Реакционная смесь содержала по 5 мкл реакционного буфера (2,5 X Реакционная смесь), 10 пМоль специфического праймера для обратной транскрипции (таблица 1), 0,5 мкл ингибитора РНКаз, 0,5 мкл фермента ММЦ«' (Синтол, Москва) и 5 мкл раствора РНК. Реакцию проводили в амплификаторе ДТ-Лайт (ДНК-Технологии, Москва) по следующей программе: 16 °С - 30 мин, 42 °С - 30 мин, 85 °С - 5 мин с последующим охлаждением смеси до 4 °С.
Таблица 1. Нуклеотидные последовательности праймеров (Xu et al., 2014).
Название праймера Нуклеотидная последовательность
Праймеры для обратной транскрипции
Hsa-miR-21-RT gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgactcaac
U6-RT gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacga-caaaaatatg '
Амплификационные праймеры
Hsa-miR-21-F gcccgctagcttatcagactgatg
U6-F gcgcgtcgtgaagcgttc
miR-Domm-R gtgcagggtccgaggt
Исследование экспрессии гена микроРНК-21 проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени с использованием набора «2,5х Реакционная смесь для проведения ПЦР-РВ в присутствии красителя EVA Green» (Синтол, Москва) в конечном объеме 25 мкл. Смесь для ПЦР содержала: 10 мкл 2,5х ПЦР буфера Б (с SynTaq ДНК-полимеразой), по 10 пМолей прямого и обратного праймеров (таблица 1) и 5 мкл соответствующего образца кДНК. Амплификация проводилась на приборе ДТ-Lite (ДНК-Технологии, Москва) с учетом уровня флюоресценции по каналу FAM (470/525 нм). Программа амплификации была следующая: 95 °С - 5 мин, затем 45 циклов (95 °С - 15 сек и 60 °С - 1 минута). Расчет относительного уровня экспрессии гена микроРНК-21 проводили по стандартной методике AAQ [10]. Достоверность различий средних значений уровней экспрессии в двух группах оценивали при помощи t-критерия Стьюдента. Все вычисления были выполнены с помощью программы Excel 2013 (Microsoft Corp., Сиэтл, США).
Результаты
Оценка уровня экспрессии микроРНК-21 полуколичественным методом основывалась на его сравнении с экспрессией гена малой ядерной РНК (мяРНК) U6, используемого в качестве контроля благодаря стабильности уровня его экспрессии. Интенсивность сигнала выражали в относительных единицах флуоресценции (ОЕФ). Для каждого образца были построены две кривые накопления флуоресцентного сигнала микроРНК-21 и мяРНК U6.
Результатом ПЦР-РВ является значение Ct (пороговый цикл) - число циклов, необходимых для пересечения флуоресцентным сигналом порога (фонового уровня). Уровень Ct обратно пропорционален количеству целевой нуклеиновой кислоты в образце (чем ниже уровень Ct, тем выше количество нуклеиновой кислоты-мишени в образце).
Результаты экспрессии гена микро РНК-21 в плазме крови больных глиомой и волонтеров представлены в таблицах 2 и 3 соответственно. Наблюдается статистически достоверное различие двух выборок (P < 0,05).
Таблица 2. Уровни экспрессии гена микроРНК-21 в плазме крови практически здоровых волонтеров.
Волонтер U6 Ct Mir21 Ct ACt AACt 2AACt
1 33,6 38 -4,4 0 1
2 34,8 41,7 -6,9 -2,5 0,18
3 35,3 41,4 -6,1 -1,7 0,31
4 34,9 40,5 -5,6 -1,2 0,44
5 34,4 40,1 -5,7 -1,3 0,41
6 28,7 29,6 -0,9 3,5 11,31
7 33,2 39,4 -6,2 -1,8 0,29
8 33,8 35 -1,2 3,2 9,19
Среднее значение 2,89
I. ХИМИЯ И ХИМИЧЕСКАЯ ТЕХНОЛОГИЯ • ОРГАНИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ И БИОТЕХНОЛОГИЯ
Известия СПбГТИ(ТУ) № 33 2016
Таблица 3. Уровни экспрессии гена микроРНК-21 в плазме крови пациентов с глиомами различной степени злокачественности в стадии прогрессии заболевания.
Пациент U6 Ct Mir21 Ct ACt AACt 2AACt
1 33,3 33,6 -0,3 4,1 17,15
2 38 38,5 -0,5 3,9 14,93
3 34,2 37 -2,8 1,6 3,03
4 31,6 36,7 -5,1 -0,7 0,62
5 33,1 38,7 -5,6 -1,2 0,44
6 33,6 37,1 -3,5 0,9 1,87
7 34,4 40,8 -6,4 -2 0,25
8 34,8 37,1 -2,3 2,1 4,29
9 32,9 35,2 -2,3 2,1 4,29
10 37,3 39,7 -2,4 2 4
11 35,6 37,6 -2 2,4 5,28
12 36,6 35,8 0,8 5,2 36,76
13 37,1 36,2 0,9 5,3 39,4
14 36,5 40,2 -3,7 0,7 1,62
15 38,8 39 -0,2 4,2 18,38
16 34,3 36,5 -2,2 2,2 4,59
17 32,1 33,6 -1,5 2,9 7,46
Среднее значение 9,67
Обсуждение
Известно, что избыточная экспрессия гена, ответственного за синтез и^-21, едва ли не самый частый признак в процессе развития глиобластом [8].
Результаты данного исследования
свидетельствуют о более чем двукратном повышении уровней экспрессии этой микро-РНК у больных с прогрессирующей стадией глиомы по сравнению со здоровыми волонтерами (таблицы 2 и 3). При этом отмечается значительная индивидуальная изменчивость этого признака, что, на наш взгляд, накладывает ограничения на применение биомаркера в клинической диагностике. Для создания полноценной системы диагностики будет необходимо существенно увеличить размер выборок, ранжировать пациентов и волонтеров по возрасту и полу, а также оценить влияние стадии заболевания на уровень экспрессии и^-21. Также предстоит валидировать полученную систему в ходе проспективных исследований.
Таким образом, предложенная система диагностики глиомы на основе профилирования экспрессии микроРНК-21 может иметь перспективы для использования в скрининговых исследованиях с целью выявления глиом на ранних стадиях.
Литература
1. Ambros V. The functions of animal microRNAs // Nature. 2004. V. 431. P. 350-355.
2. Мацко Д.Е., Коршунов А.Г. Атлас опухолей центральной нервной системы. СПб.: РНХИ им. проф. А.Л. Поленова, 1998. 197 с.
3. Коновалов А.Н., Потапов А.А., Лошаков В.А. [и др.] Стандарты, рекомендации и опции в лечении глиальных опухолей головного мозга у взрослых // Вопросы нейрохирургии им. Н. Н. Бурденко. 2006. Т. 2. С. 3-11.
4. Karsy M., Arslan E., Moy F. Current Progress on Understanding MicroRNAs in Glioblastoma Multiforme // Genes Cancer. 2012. V. 3. P. 3-15.
5. Slaby O., Lakomy R., Fadrus P., Hrstka R., Kren L., Lzicarova E., Smrcka M., Svoboda M., Dolezalova H., Novakova J., Valik D., Vyzula R., Michalek J. MicroR-NA-181 family predicts response to concomitant chemora-diotherapy with temozolomide in glioblastoma patients // Neoplasma. 2010. V. 57. P. 264-269.
6. Xu L.F., Wu Z.P., Chen Y., Zhu Q.S., Hamidi S., Navab R. MicroRNA-21 (miR-21) regulates cellular proliferation, invasion, migration, and apoptosis by targeting PTEN, RECK and Bcl-2 in lung squamous carcinoma, Ge-jiu City, China // PLoS One. 2014. V. 9. P. e103698.
7. Chan J.A., Krichevsky A.M., Kosik K.S. MicroR-NA-21 is an antiapoptotic factor in human glioblastoma cells // Cancer Researches. 2005. V. 65. P. 6029-6033.
7. Zhou X., Ren Y., Moore L., Mei M., You Y., Xu P., Wang B., Wang G., Jia Z., Pu P., Zhang W., Kang C. Downregulation of miR-21 inhibits EGFR pathway and suppresses the growth of human glioblastoma cells independent of PTEN status // Laboratory Investegations. 2010. V. 90. P. 144-155.
9. Corsten M.F., Miranda R., Kasmieh R., Krichevsky A.M., Weissleder R., Shah K. MicroRNA-21 knockdown disrupts glioma growth in vivo and displays synergistic cytotoxicity with neural precursor cell delivered S-TRAIL in human gliomas // Cancer Research. 2007. V. 67. P. 8994-9000.
10. Livak, K. J., and T. D. Schmittgen. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2AACt method // Methods. 2001. V. 25. P. 402-408.
