CC BY
41
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА И КЛИНИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА
УДК 616.1:612.017.1
РАЗРАБОТКА СПОСОБА ОЦЕНКИ ИНТЕРФЕРОН-ГАММА-ПРОДУЦИРУЮЩИХ Т-ЛИМФОЦИТОВ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ЛИМФОЛЕЙКОЗЕ
Исаева Н.В., Зайцева Г.А., Зотина Е.Н.
ФГБУН «Кировский НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России», Киров, Россия (610027, г. Киров, ул. Красноармейская, 72), e-mail: [email protected]
DEVELOPMENT OF METHOD FOR EVALUATION INTERFERON-GAMMA-PRODUCING T-LYMPHOCYTES IN CHRONIC LYMPHOCYTIC LEUKEMIA
Isaeva N.V., Zaytseva G.A., Zotina E.N.
Kirov Scientific Research Institute of Hematology and Blood Transfusion of the Federal Medical and Biological Agency of Russia, Kirov, Russia (610027, Kirov, Krasnoarmeyskaya Street, 72), e-mail: [email protected]
Цель работы состояла в изучении возможности применения способа подсчета интерферон-у-продуцирующих Т-лимфоцитов при обследовании больных хроническим лимфолейкозом. Известно, что данный способ является многоэтапной лабораторной методикой, предполагающей ингибирование транспорта цитокинов, подготовку клеточной культуры, стимуляцию продукции цитокина за счет химических агентов (форбол-12-миристат-13-ацетата и кальциевой соли иономицина), пермеабилиза-цию клеток, их фиксацию, этапы иммунологического связывания с флуорохром-конъюгированными моноклональными антителами и оценку реакций методом лазерной проточной цитофлуориметрии. Возможность применения известного способа изучена у 40 больных хроническим лимфолейкозом. Было установлено негативное влияние химических агентов, активирующих синтез цитокинов, на экспрессию молекулы CD3 на мембране лимфоцитов и понижение точности определения изучаемого показателя. В результате экспериментов в известный способ была внесена модифицикация, сущность которой заключается в рекомендации обработки клеточной культуры анти-CD3 антителами уже на этапе ингибирования внутриклеточного транспорта. Указанный способ запатентован. На основании применения разработанного подхода было установлено, что при хроническом лимфолейкозе на этапе диагностики заболевания наблюдается повышение спонтанной продукции интерферона-гамма Т-лимфоцитами и понижение индекса стимуляции продукции. Показано, что среди больных хроническим лимфолейкозом присутствуют лица со сниженной или отсутствующей продукцией интерфе-рона-гамма Т-лимфоцитами.
Ключевые слова: клеточная культура, интерферон-гамма, Т-лимфоциты, хронический лимфолейкоз.
The aim of the research was to study the possibility of applying method of counting interferon-gamma-producing T-lymphocytes in the examination of patients with chronic lymphocytic leukemia. This method is known to be a multistep laboratory procedure, involving inhibition of cytokine secretion, preparation of cell culture, stimulation of cytokine production by chemical agents (phorbol-12-myristate-13-acetate and calcium salt of ionomycin), permeabilization and fixation of cells, immunological binding with fluorochrome-conjugated monoclonal antibodies and assessment of reactions by laser flow-cytometry. The possibility of application of the well-known method was studied in 40 patients with chronic lymphocytic leukemia. The negative impact of chemical agents activating cytokine synthesis on the expression of CD3 molecules on lymphocyte membrane and decreased accuracy of determination of the studied parameter were established. During the experiment the well-known method was modified. We recommend to use anti-CD3 antibodies at the stage of inhibition of intracellular transport. This method was patented. Application of the developed method showed that at the stage of diagnosis of chronic lymphocytic leukemia increased spontaneous production of interferon-gamma T-lymphocytes and decreased stimulation index of products were observed. Among the patients with chronic lymphocytic leukemia there were individuals with low or absence of production of interferon-/ T-lymphocytes.
Key words: cell culture, interferon-gamma, T-lymphocytes, chronic lymphocytic leukemia.
Введение
Патогенез хронического лимфолейкоза (ХЛЛ) сложен и окончательно не исследован [1, 6]. Больным ХЛЛ уже на донозологических этапах заболевания свойственны повышенная подверженность инфек-
ционно-воспалительным процессам, присоединение аутоиммунных осложнений и недостаточность противоопухолевого иммунитета [3].
Малоинформативным для оценки иммунного статуса этой категории онкогематологических больных является содержание иммуноглобулинов
(Ig) сыворотки крови в связи с известной способностью опухолевых лимфоцитов к продукции патологических Ig [4, 10]. В периферической крови больных наблюдается преобладание патологических В-лимфоцитов, не отличающихся от здоровой популяции лимфоцитов по морфологическим признакам. Абсолютное число Т-лимфоидных элементов или находится в пределах нормальных значений, или существенно повышено относительно принятых нормативов. Это объясняется влиянием некоторых цитокинов, вырабатываемых опухолевым клоном и запускающих пролиферацию Т-лимфоцитов и их подвидов [5, 7, 8, 11]. Таким образом, количественная оценка Т-лимфоцитов при ХЛЛ оказывается недостаточной или неадекватной.
Сообщается о признаках дизрегуляции Т-клеточного звена иммунитета, предполагается, что только расширенная характеристика иммунокомпе-тентных клеток позволяет своевременно выявлять иммунозависимые состояния при ХЛЛ [12, 15]. Учитывая сказанное, полезной может быть разработка тестов, отражающих функциональные способности Т-лимфоцитов у названной группы иммунокомпро-метированных лиц.
Т-лимфоциты имеют богатый рецепторный аппарат - около 100 маркеров, внесенных в современную номенклатуру. Высокоспецифическим «неперекрывающимся» маркером Т-лимфоцитов является маркер CD3, это делает его наиболее часто используемым при характеристике иммунного статуса человека. Все известные методы детекции Т-лимфоцитов требуют применения моноклональ-ных антител к Т-клеточным детерминантам [2]. Популяция Т-лимфоцитов периферической крови представляет собой многофункциональную группу, в которой часть клеток синтезирует интерферон-у. Определение способности Т-лимфоцитов к продукции этого цитокина может дать дополнительную информацию о состоянии Т-клеточного звена иммунитета, например, противовирусной и противоопухолевой защиты.
В исследованиях in vitro установлено, что количество Т-лимфоцитов, продуцирующих интерферон-у в неактивированных культурах мононуклеаров, оказывается крайне незначительным как у новорожденных, так и у взрослых. В то же время выявленная способность некоторых веществ активировать синтез цитокинов in vitro позволила проводить изучение стимулированной продукции цитокинов на уровне одной клетки. Форбол-12-миристат-13-ацетат (ФМА) является активатором протеинкиназы С, центральной молекулы многих сигнальных путей, приводящих к индукции синтеза цитокинов. Для работы протеин-киназы С требуется Ca2+, поэтому ФМА применяется в сочетании с ионофорами кальция. Иономицин кальция является таким ионофором - жирорастворимым веществом, способным транспортировать ионы через липидный бислой клеточной мембраны. Сочетание ФМА с иономицином кальция считается наиболее эффективным для активации синтеза разных видов цитокинов лейкоцитами человека [14]. Для определения внутриклеточных цитокинов подходит метод лазерной проточной цитометрии с использованием моноклональных антител, напрямую конъюгирован-ных с флуорохромами, при котором флуорохромы имеют существенные различия по длине волны испускаемого света.
Известно, что длительная инкубация с химическими веществами способна повредить мембраны лимфоцитов и влияет на их рецепторный аппарат. Вследствие этого исследователи зачастую предпочитают обходиться без детекции мембранных структур. В этом случае анализируется цитокин-секретирую-щая функция не в конкретной популяции лимфоцитов, а во всем лимфоцитарном полигоне. Применение данного подхода при изучении лимфоцитов больных ХЛЛ в большинстве случаев оказывается некорректным.
Необходимым этапом при выявлении внутриклеточных цитокинов является ингибирование выхода синтезированных цитокинов из клеток, при этом наибольшей эффективностью обладает брефелдин А (антибиотик, продуцируемый грибком ЕиретсШшт brefeldianum) [14]. По завершении стимуляции синтеза и ингибирования внутриклеточного транспорта выполняются собственно иммунологические реакции - связывание моноклональных антител с антигенами, экспрессированными на поверхности лимфоцитов и внутри клетки. При этом требуется фиксация и пермеабилизация лейкоцитов, в настоящее время в качестве наилучшего фиксирующего агента используется параформальдегид (0,5-2%), а в качестве пермеабилизующего - сапонин (0,05-0,1%) [9, 13]. Таким образом, способ идентификации интерферон-у-продуцирующих Т-лимфоцитов в крови является трудоемкой методикой, этапы которой описаны в разных инструктивных материалах.
Цель настоящего исследования состояла в разработке способа идентификации и подсчета интерферон-у-продуцирующих Т-лимфоцитов в периферической крови больных ХЛЛ.
Материал и методы
Определение иммунологических показателей проведено у 40 больных ХЛЛ в дебюте заболевания до начала лечения, наблюдавшихся в Кировском научно-исследовательском институте гематологии и переливания крови. В группу обследованных вошли 22 мужчины и 18 женщин. Возраст больных варьировал от 35 до 86 лет (медиана - 68 лет). Группу сравнения составили 39 человек без онкогематологических заболеваний, сопоставимые с группой больных по возрасту и полу.
Для воспроизведения общеизвестного способа использовали 5 образцов крови больных ХЛЛ и 5 - крови доноров. Образцы крови были взяты в гепаринизированные пробирки. Для определения интерферон-у-продуцирующих Т-лимфоцитов в стандартном спонтанном и стимулированном тестах готовили клеточные культуры двух видов. Подготовка клеточных культур включала в себя смешивание 1000 мкл крови с 1000 мкл среды RPMI 1640 и инкубирование с брефелдином А в течение 2 часов в среде С02. Для подготовки стимулированной клеточной культуры проводили инкубацию с ФМА (при конечной концентрации вещества - 100 нг/мкл) и иономицином кальция (при конечной концентрации вещества - 1 мкг/мкл) в течение 18 часов. При подготовке клеточной культуры для оценки спонтанного синтеза интерферона-у вместо ФМА и иономицина в клеточную культуру вносили аналогичные аликвоты разбавителей веществ-стимуляторов.
После окончания культивирования обе клеточные культуры дважды отмывали средой RPMI 1640,
Относительное содержание CD3+-лимфоцитов в крови доноров и больных ХЛЛ,
оцененное разными способами
Таблица 1
Результаты определения, %, Me (I кв.; III кв.)
Группы обследованных в цельной крови (контролируемый метод) в спонтанной клеточной культуре в стимулированной клеточной культуре
I II III
Доноры 72,9 (70,3; 76,6) 69,3 (65,8; 72,0) *р ,-„ = 0,14 25,6 (13,6; 39,3) **р IIH < 0,001 ***р II-III < 0,001
Больные ХЛЛ 10,2 (6,5; 16,4) 9,2 (5,5; 16,4) р ,-„ = 0,93 5,2 (3,8; 10,8) Р I-III < 0,05 р ii-III < 0,05
Примечание:
* р - - значение (р) при сравнении параметра в цельной крови и в спонтанной клеточной культуре; ** р ии - значение (р) при сравнении параметра в цельной крови и в стимулированной клеточной культуре; *** р - значение (р) при сравнении параметра в спонтанной и стимулированной клеточных культурах.
инкубировали с анти-CD3 моноклональными антителами, меченными флуоресцеинизотиоционатом (РГГС), в течение 20 минут в темноте и отмывали от несвязавшихся антител методом центрифугирования в течение 5 минут при 600 g забуференным фосфат-но-солевым раствором.
Фиксацию клеток 0,5% раствором парафор-мальдегида проводили следующим образом: энергично встряхивали культуру на вортексе, инкубировали ее в темноте при комнатной температуре в течение 20 минут (в процессе инкубирования происходил частичный лизис эритроцитов), после чего культуру однократно отмывали методом центрифугирования. Пермеабилизация клеток включала пятиминутную обработку культуры раствором сопанина при деликатном покачивании пробирок.
Затем проводили 30-минутную обработку клеток антителами против интерферона-у человека, меченными фикоэритрином (РЕ), после чего выполняли отмывку от несвязавшихся антител забуферен-ным фосфатно-солевым раствором путем центрифугирования в течение 5 минут при 600 g. Готовые образцы (спонтанные и стимулированные клеточные культуры) анализировали на лазерном проточном цитофлуориметре. Для этого на основе определения параметров малоуглового и бокового светорассеяния на точечном графике выделяли полигон лимфоцитов, который оценивали на наличие двух флуоресцентных меток.
Проводили экспериментальные работы по модификации способа, методические особенности которых изложены в разделе «Результаты и их обсуждение»; число взятых для этого образцов крови больных ХЛЛ составило 35, а доноров - 34.
Параллельно с данной многоэтапной методи-
кой выполняли оценку числа Т-лимфоцитов в цельной периферической крови каждого из обследуемых. При этом использовали стандартный метод прямой иммунофлуоресценции - связывание с конъюгатами антител CD3 с FITC, CD19 с PE и CD45 с фикоэри-трин-цианином-5. Следует отметить, что данный метод был успешно проконтролирован в Федеральной системе внешней оценки качества лабораторных исследований.
Статистическую обработку полученных результатов выполняли с применением пакета программ STATISTICA 6.0. Оценка соответствия распределения количественных данных закону нормального распределения проведена с помощью критерия Ша-пиро-Уилка. Количественные признаки, имеющие нормальное распределение, представлены средней арифметической и ошибкой репрезентативности средней (М ± m); для оценки статистической значимости различия таких данных применяли тест Стьюдента. Количественные данные, имеющие распределение, отличное от нормального, представлены в виде медианы и межквартильного размаха - Ме (I кв.; III кв.), оценку статистической значимости различия таких данных производили с помощью теста Манна-Уитни. В качестве критического уровня статистической значимости (p) различия выборочных данных выбрано значение p < 0,05.
Результаты и их обсуждение
Группа больных хроническим лимфолейко-зом характеризовалась более выраженным варьированием по относительному содержанию в крови CD3+-лимфоцитов (2,5-43,0%) по сравнению с группой доноров (69,8-87,0%). Число CD3+-лимфоцитов, подсчитанное в клеточных культурах
Таблица 2
Относительное содержание CD3+-лимфоцитов в крови доноров и больных ХЛЛ,
оцененное разными способами
Результаты определения (%, M ± m)
Группы обследованных в цельной крови (контролируемый метод) в стимулированной культуре с модификацией способа р
Доноры 69,8 ± 4,55 66,2 ± 5,12 р = 0,35
Больные ХЛЛ 13,0 ± 4,60 12,0 ± 4,23 р = 0,68
Таблица 3
Показатели спонтанного и стимулированного синтеза интерферона-у CD3+-лимфоцитами
у доноров и больных ХЛЛ
Интерферон-у+ CD3+-лимфоциты Группы обследованных
доноры (М ± т) больные ХЛЛ (М ± т) р
В спонтанной клеточной культуре (%) 0,05 ± 0,03 0,2 ± 0,03 р < 0,05
В стимулированной клеточной культуре (%) 20,7 ± 4,43 21,4 ± 5,19 р = 0,89
Индекс стимуляции 1168,6 ± 323,3 214,0 ± 45,8 р < 0,001
без стимуляции, не отличалось от результата, полученного в контролируемом методе (табл. 1). Это свидетельствует о том, что на определение CD3+-лимфоцитов в культуре крови не влияет добавление брефелдина А и длительная (20 часов) инкубация в среде RPMI 1640.
Процент CD3+-лимфоцитов, оцененный в стимулированных клеточных культурах, был значительно более низким по сравнению с таковым в клеточных культурах без стимуляции и в цельной крови при определении контролируемым методом. Выявленное различие может быть обусловлено влиянием ФМА и кальциевой соли иономицина на экспрессию CD3 на лимфоцитах. Вполне вероятно, что происходит интернирование или частичное расщепление молекулы CD3, что делает ее недоступной для дальнейшего связывания с моноклональными антителами. Таким образом, при оценке результатов в стимулированной культуре было зарегистрировано значимое недовыявление CD3+-лимфоцитов как у доноров, так и больных ХЛЛ, что является существенным недостатком общеизвестного способа. Этот недостаток отражается на точности подсчета CD3+-лимфоцитов, а следовательно, и интерферон-у-продуцирующих Т-лимфоцитов. Следовательно, общеизвестный способ требует модификации. Дальнейшая работа была направлена на разработку подхода, повышающего точность анализа.
Из венозной гепаринизированной крови больных ХЛЛ и доноров, взятой в стерильную пробирку, готовили клеточную культуру, для чего смешивали 1000 мкл крови с 1000 мкл среды RPMI 1640; к полученной смеси добавляли 1 мкл брефелдина А, проводили тщательное перемешивание культуры на лабораторном вортексе. Модификация общеизвестного способа заключалась в том, что после этого приготовленную клеточную культуру немедленно обрабатывали анти-CD3 антителами, тщательно перемешивали на лабораторном вортексе и инкубировали в С02-камере в течение 2 часов. Затем в клеточную культуру вносили активаторы синтеза цито-кинов (ФМА и кальциевую соль иономицина) при перемешивании на вортексе и проводили инкубацию в С02-камере в течение 18 часов. После этого повторяли все этапы, описанные в разделе «Материалы и методы исследования», кроме этапа связывания с анти-CD3 моноклональными антителами. Оценку результатов иммунологической реакции проводили при сохранении прежних настроек лазерного проточного цитофлуориметра.
Сравнили результаты подсчета числа CD3+-лимфоцитов в обеих группах, полученные в контролируемом методе и при оценке стимулированной
клеточной культуры. Как видно из таблицы 2, относительное содержание СD3+-лимфоцитов среди клеток лимфоцитарного полигона не различалось; это относилось и к группе больных, и к группе доноров. Таким образом, при применении описанного подхода нивелируется влияние активаторов синтеза цитоки-нов на понижение экспрессии CD3 на мембране и в целом повышается точность метода.
Повышение достоверности оценки рассматриваемого иммунологического показателя имеет практическую ценность, поскольку позволяет более точно выявлять среди больных ХЛЛ лиц с отсутствием или недостаточностью интерферон-у-продуцирующей способности Т-лимфоцитов. Кроме того, он может быть применен для определения активности синтеза других хемокинов иммунокомпетентными клетками при использовании в качестве стимуляторов ФМА и иономицина кальция.
На описанный способ получен патент на изобретение (№ 2526797, дата регистрации в Государственном реестре изобретений Российской Федерации - 02.07.14 г.).
При анализе спонтанной и стимулированной клеточных культур определяли процент интерферон-у-позитивных клеток среди CD3+-лимфоцитов. Провели расчеты, позволяющие использовать результаты лабораторного исследования стимулированной продукции интерферона-у Т-лимфоцитами в практике клинического иммунолога. Для каждой пары наблюдений подсчитывали индекс стимуляции: процентное содержание интерферон-у+ клеток среди CD3+-лимфоцитов в стимулированном тесте, деленное на процентное содержание интерферон-у+ клеток среди CD3+-лимфоцитов в спонтанном тесте.
На основании результатов, полученных в группе здоровых доноров, были определены значения нормы изучаемых показателей. В таблице 3 представлены их средние значения со средней репрезентативной ошибкой, что в дальнейшем может быть использовано для статистического анализа различных когорт больных. Кроме того, были установлены 95% доверительные интервалы для рассматриваемых показателей, что необходимо для изучения данных параметров на индивидуальном уровне; разброс значения спонтанного теста интерферон-у+ CD3+-лимфоцитов составил 0,01-0,04%, стимулированного теста - 12,0-29,4%, индекса стимуляции - с 625 до 1620.
У больных ХЛЛ зарегистрированы существенно более высокие значения содержания интерферон-у+ Т-лимфоцитов в спонтанной культуре, что, вероятно, связано с присутствием в группе больных лиц с напряжением противовирусного и противоопухолевого иммунитета.
В группе больных наблюдалось возрастание относительного числа интерферон-у-позитивных Т-лимфоцитов в стимулированной клеточной культуре по сравнению с нестимулированной. Среднестатистическое значение индекса стимуляции у больных существенно отличалось от нормы в сторону понижения, что обусловлено более высокими значениями показателя в спонтанном тесте и присутствием в этой группе лиц, характеризующихся полным отсутствием эффекта стимуляции синтеза интерферона-у. В группе больных в 20% случаев наблюдалось понижение относительного количества интерферон-у+ CD3+-лимфоцитов в стимулированной клеточной культуре по сравнению с референтными значениями. У 11,4% больных отмечалось совпадение результатов спонтанного и стимулированного тестов, то есть была полная неотвечаемость Т-лимфоцитов на стимуляторы.
Выводы
1. При воспроизведении известного способа определения стимулированной продукции интерферона-у Т-лимфоцитами больных ХЛЛ выявлен существенный недостаток, отражающийся на точности.
2. Разработанный подход позволяет повысить точность оценки функциональных свойств иммуно-компетентных клеток.
3. При хроническом лимфолейкозе на этапе диагностики заболевания наблюдается повышение спонтанной продукции интерферона-у Т-лимфоцитами и понижение индекса стимуляции продукции; среди больных встречаются лица с неотвечаемостью Т-лимфоцитов на стимуляторы продукции интерферона- у.
Заключение
Результаты разработок имеют несомненную практическую ценность. Модификацию общеизвестного способа определения интерферон-у-продуцирующих Т-лимфоцитов при ХЛЛ рекомендуется использовать в комплексной оценке состояния иммунной системы в этой группе онкогематологи-ческих больных. Предлагаемый метод исследования является технически доступным для иммунологических лабораторий в учреждениях, оказывающих специализированную, в том числе высокотехнологичную медицинскую помощь больным с патологией системы крови.
Список литературы
1. Абраменко И.В., Крячок И.Я. Взаимодействие лейкемических клеток с микроокружением при хроническом лимфолейкозе: новые аспекты патогенеза и таргетной терапии // Клиническая онкология. 2012. № 5 (1). С. 99-102.
2. Бурместер Г.Р., Пецутто А. Наглядная иммунология. М.: Изд-во «БИНОМ», 2007. 320 с.
3. Волкова М.А. Клиническая онкогематология. М.: Изд-во «Медицина», 2001, с. 576.
4. Воробьев А.И. Руководство по гематологии: в 3 томах. Т. 2. М.: Изд-во «Ньюдиамед», 2003. С. 280.
5. Жевак Т.Н., Чеснокова Н.П., Шелехова Т.В. Закономерности изменений цитокинового статуса при хроническом лимфолейкозе и их роль в патогенезе прогрессирующих форм заболевания // Сара-
товский научно-медицинский журнал. 2012. № 8 (2). С. 203-209.
6. Жевак Т.Н., Чеснокова Н.П., Шелехова Т.В. Хронический лимфолейкоз: современные концепции этиологии, патогенеза и особенностей клинического течения (обзор) // Саратовский научно-медицинский журнал. 2011. № 7 (2). С. 377-385.
7. Исаева Н.В., Зайцева Г.А., Докшина И.А. Характеристики иммунокомпетентных клеток у больных хроническим лимфолейкозом на этапе диагностики. // Медицинская иммунология. 2015. № 17 (5). С. 573-578.
8. Караулов А.В. Клиническая иммунология и аллергология. М.: Изд-во «Медицинское информационное агентство», 2002. С. 651.
9. Комогорова Е.Э., Костенко Е.В., Стаханов
B.А., Наумова А.Н., Мишин В.Ю., Пинегин Б.В. Уровень CD3+-лимфоцитов, содержащих интерферон-у, у больных туберкулезом легких и его изменение после включения в комплексную терапию полиоксидония // Иммунология. 2004. № 25 (4). С. 210-213.
10. Максимов О.Д. Клиническое значение HLA-фенотипа и иммунных нарушений у больных хроническим лимфолейкозом: автореф. дисс. ... канд. мед. наук. Санкт-Петербург, 2004, 23 с.
11. Сисла Б. Руководство по лабораторной гематологии. М.: Изд-во «Практическая медицина», 2011.
C. 352.
12. Christopoulos P., Pfeifer D., Bartholome K., Follo M., Timmer J., Fisch P., Veelken Н. Definition and characterization of the systemic T-cell dysregulation in untreated indolent B-cell lymphoma and very early CLL // Blood. 2011. № 117. P. 3836-3846.
13. Jung T., Schauer U., Heusser C., Neumann C., Rieger C. Detection of intrercellular cytokines by flow cytometry // Journal of Immunological Methods. 1993. № 159. P. 197-207.
14. Nui T.K., Pfeifer A.C., Lippincott-Schwartz J., Jackson C.L. Dynamics of GBF1, a Brefeldin A -Sensitive Arf1 Exchange factor at the Golgi // Molecular Biology of the Cell. 2005. № 16. С. 1213-1222.
15. Tinhofe I., Marschitz In., Kos M., Henn T., Egle A.A., Andreas Villunger A., Greil R. Differential Sensitivity of CD4+ and CD8+T Lymphocytes to the Killing Efficacy of Fas (Apo-1/CD95) Ligan. Tumor Cells in B Chronic Lymphocytic Leukemia // Blood. 1998. № 91. Р. 4273-4281.
References
1. Abramenko I.V., Kryachok 1^а. Clinical oncology, 2012. vol. 5, № 1, pp. 99-102.
2. Burmester G.R., Pezzutto A. Naglyadnaya immunologiya [Visual immunology]. Moscow, BlNOM, 2007. 320 p.
3. Volkova M.A. Klinicheskaya onkogematologiya [Clinical Oncohematology]. Moscow. Medicine, 2001. 576 p.
4. Vorob'ev A.I. Rukovodstvo po gematologii: v 3 tomakh. [Manual of Hematology]. Moscow. N'yudiamed, 2003, 280 p.
5. Zhevak T.N., Chesnokova N.P., Shelekhova T.V. Saratov Journal of Medical Scientific Research, 2012, vol. 8, № 2, pp. 203-209.
6. Zhevak T.N., Chesnokova N.P., Shelekhova T.V. Saratov Journal of Medical Scientific Research, 2011, vol. 7, № 2, pp. 377-385.
7. Isaeva N.V, Zaitseva G.A., Dokshina I.A. Features of immunocompetent cells in the patients with
chronic lymphocytic leukemia at primary diagnosis. Medical immunology, 2015, vol. 17, № 5, pp. 573-578.
8. Karaulov A.V. Klinicheskaya immunologiya i allergologiya [Clinical immunology and Allergology]. Moscow, Medical information Agency, 2002. 651 p.
9. Komogorova E.E., Kostenko E.V, Stakhanov V.A., Naumova A.N., Mishln V.Yu., Pinegin B.V. The level of CD3+-lymphocytes containing interferon-y in patients with pulmonary tuberculosis and its changes after addition of polyoxydonium to the complex therapy. Immunologiya, 2004, vol. 25, № 4, pp. 210-213. (http:// elibrary.ru/item.asp?id=17205394).
10. Maksimov O.D. The clinical significance of HLA phenotype and immune disorders on patients with chronic lymphocytic leukemia [dissertation]. Saint Petersburg, 2004, 23 p.
11. Sisla B. Rukovodstvo po laboratornoj gematologii [A guide to laboratory Hematology]. Moscow, Practical medicine, 2011. 352 p.
12. Christopoulos P., Pfeifer D., Bartholome K., Follo M., Timmer J., Fisch P., Veelken H. Definition and characterization of the systemic T-cell dysregulation in untreated indolent B-cell lymphoma and very early CLL. Blood, 2011, № 117, pp. 3836-3846.
13. Jung T., Schauer U., Heusser C., Neumann C., Rieger C. Detection of intrercellular cytokines by flow cytometry. Journal of Immunological Methods, 1993, № 159, pp. 197-207.
14. Nui T.K., Pfeifer A.C., Lippincott-Schwartz J., Jackson C.L. Dynamics of GBF1, a Brefeldin A -Sensitive Arf1 Exchange factor at the Golgi. Molecular Biology of the Cell, 2005, № 16, pp. 1213-1222.
15. Tinhofe I., Marschitz In., Kos M., Henn T., Egle A.A., Andreas Villunger A., Greil R. Differential Sensitivity of CD4+ and CD8+T Lymphocytes to the Killing Efficacy of Fas (Apo-1/CD95) Ligan. Tumor Cells in B Chronic Lymphocytic Leukemia. Blood, 1998, № 91, pp. 4273-4281.
УДК 612.111.3: 547.562.33: 615.9
ОТДАЛЕННЫЕ ПОСЛЕДСТВИЯ ЭРИТРОПОЭЗА В ЭРИТРОБЛАСТИЧЕСКИХ ОСТРОВКАХ КОСТНОГО МОЗГА КРЫС ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ ПОЛИХЛОРИРОВАННЫХ БИФЕНИЛОВ В ДОЗЕ 1/20 ld50.
Каюмова А.Ф., 1Габдулхакова И.Р., 2Богданова А.В., 1Зиякаева К.Р.
'ФГБОУ ВО Башкирский государственный медицинский университет Минздрава России, Уфа, Россия (450000, г. Уфа, ул. Пушкина, 97), e-mail: [email protected]
2Министерство здравоохранения Республики Башкортостан (450002, г. Уфа, ул. Тукаева, 23), e-mail: norfiz@ yandex.ru
THE DELAYED CONSEQUENCES OF ERYTHROPOIESIS IN ERYTHROBLASTIC ISLANDS IN RATS' BONE MARROW AFTER EXPOSURE TO POLYCHLORINATED BIPHENYLS WITH A DOSE OF 1/20 LD50.
Kayumova A.F., Gabdulhakova I.R., 2Bogdanova A.V., 1Ziyakaeva K.R.
'Bashkir State Medical University, Ministry of Health of Russia, Ufa, Russia (450000, Ufa, Pushkin Street, 97), e-mail: [email protected]
^Ministry Health of the Republic of Bashkortostan (450002, Ufa, Tukaeva Street, 23), e-mail: [email protected]
Статья посвящена изучению состояния эритропоэза в токсигенном периоде после подострого воздействия полихлорированных бифенилов в дозе 1/20 LD50 с подсчетом абсолютного количества, распределения по классам зрелости и оценкой темпа развития эритробластических островков костного мозга бедренных костей крыс. Прослеживаемая неравномерная регенерация эритроцитов в эритробластиче-ских островках, даже после прекращения введения полихлорированных бифенилов, отражает глубокий повреждающий эффект интоксиканта на процессы эритропоэза, сохраняя дизэритропоэз и в отдаленные сроки после прекращения поступления интоксиканта в организм.
Ключевые слова: полихлорированные бифенилы, костный мозг крыс, эритробластические островки, эритро-поэз.
The article is devoted to studying the state of erythropoiesis in toxigenic period after subacute exposure to polychlorinated biphenyls with a dose of 1/20 LD50 accompanied by counting the absolute number, maturity class distribution and development rate estimation of bone marrow erythroblastic islands in rats'femurs. The discovered irregular regeneration of red blood cells in the erythroblastic islands, even after cessation of exposure to polychlorinated biphenyls, reflects a profound damaging intoxicant effect on erythropoiesis with diserythropoiesis remaining and within delayed periods after cessation of the body's exposure to the intoxicant.
Key words: polychlorinated biphenyls, rat bone marrow, erythroblastic islands, erythropoiesis.
