CC BY
29ЕГЕПШАРНЫЙ
Врач
УДК 619:615.9+543.5/.6
РАЗРАБОТКА СПОСОБА ЭКСПРЕСС ПРОБОПОДГОТОВКИ ДЛЯ АНАЛИЗА ПИРЕТРОИДОВ И МИКОТОКСИНОВ В ЗЕРНЕ МЕТОДОМ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
'Г.Ш.Закирова - кандидат ветеринарных наук, вед. научный сотрудник;
1К.Х.Папуниди - доктор ветеринарных наук, профессор; зам. директора; 1А.Р.Валеев - кандидат биологических наук, научный сотрудник; 1Г.Р.Ямалова - соискатель, мл. научный сотрудник;
2Н.С.Гришин - доктор технических наук, профессор.
1ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», г.Казань (420075, г. Казань, Научныйгородок-2, тел.+7(843) 239-53-20; e-mail: vnivi@mail.ru).
2ФГБОУ ВПО «Казанский национальный исследовательский технологический университет», г.Казань (420029, Казань, ул. Карла Маркса, 68, каф. МАХП (e-mail: mahp_kstu@mail.ru).
Основной метод, использующийся для извлечения анализируемых соединений из пробы, является жидкост-но-экстракционный. Недостаток ручного способа - это время на подготовку пробы - часы при низкой воспроизводимости результатов до 40%. Основные требования, предъявляемые к конструкциям экстракторов: высокая производительность, достаточно полное извлечение целевого компонента при минимальной продолжительности процесса, минимальное соотношение количеств экстрагента и материала, простота конструкции, удобство обслуживания и надежность в работе, а также автоматизация их работ, которые минимизируют альтернативный поиск конструктивных решений по определению вида аппаратов для конкретного процесса экстракции. Для апробации новых приборов для экспресс анализа на микотоксины и пиретроиды необходимо каждый этап пробоподготовки (встряхивание, фильтрация, выпаривание) заменить на аппарат (экстрактор, центрифугу, концентратор). Поэтому целью исследования явилось изучение в сравнительном плане обычного (ручного) и автоматизированного способа пробоподготовки. Для этого были разработаны аппараты центробежного типа: центрифуга, экстрактор, кон-центратор-выпариватель. Эксперименты показали, что при использовании экстрактора, центрифуги и концентра-тора-выпаривателя при определении пиретроидов происходит: сокращение времени экстракции до 2 мин, тогда как при ручном (обычном) способе 60-64 мин, стабилизация параметром выхода экстракта, повышается процент выхода токсичного элемента, удобство работы. На пробоподготовку на микотоксины ручным (обычным) способом по времени заняло 5,8 ч, при автоматизированном- 3,2 ч, т.е. в два раза сократилось время. Таким образом, освоены и апробированы методики количественного определения Т-2 токсина и дельтаметрина в зерне обычным и автоматизированным способами. При использовании испытуемых аппаратов для пробоподготовки происходит сокращение трудозатрат и времени; точность воспроизведения результата; исключение рутинного ручного труда; повышение воспроизводимости пробоподготовки; стабилизация параметров; удобство работы; увеличение объема экстракта и процент выхода пиретроидов; упрощение стандартизации пробоподготовки.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: пиретроиды, дельтаметрин, микотоксины, Т-2 токсин, пробоподготовка, экс-прессность, центрифуга, экстрактор, концентратор.
Процессы жидкостной и твердофазной экстракции встречаются во многих типовых процессах пробоподготовки. Сочетание в единой технологической цепочке данных процессов обуславливает необходимость взаимосвязанного рассмотрения процессов экстракции и экстрагирования. Современное состояние экологической обстановки объектов окружающей среды предопределяет значительное увеличение производительности существующих систем контроля, которая может быть достигнута за счёт использования инструментальных методов, автоматизации подготовки проб и применение компьютеров для обработки результатов анализа проб.
Развитие и внедрение новых физико-химических и физических методов анализа резко повысили производительность, однако использование ручной пробоподготовки из-за недостаточной чувствитель-
ности приборов не позволяет достичь заданным прибором производительности анализов. Поэтому важнейшей задачей является совершенствование методик анализа, сокращение и упрощение подготовительных операций и создание механизированных (автоматизированных) устройств пробоподготовки.
В имеющихся методиках анализа широко используются такие приборы, как газовый хроматограф, ГЖХ, фотоколориметры, спектрофотометры и др. инструментальные методы, которые требуют предварительной подготовки проб к анализу, т.е. операции размельчения, гомогенизации, экстракции, разделения и др. методов концентрирования микропримесей анализируемых веществ [1, 2]. Как правило, данные операции выполняются вручную и требуют значительно больше времени, чем для проведения самого анализа. Одной из основных и
самых трудоемких является операция разделения. В этом случае широко используются физические (фильтрование, декантация, отстаивание), химические (со осаждение, перевод в другое валентное состояние) и физико-химические методы разделения (хроматография, экстракция, электрофорез, диализ, изменение энергетического и агрегатного состояния пробы и др.).
Широко распространен экстракционный метод, который используется для концентрирования или выделения (разделения) микропримесей из жидких и твердых проб [3, 4].
Анализ наиболее широко используемых методов пробоподготовки с помощью автоматизированных устройств показал, что наиболее универсальным и доступным методом повышения эффективности процессов концентрирования, жидкостной и твердофазной экстракции, разделения (центрифугирования), сорбции, десорбции и центробежной хроматографии является использование аппаратов центробежного типа, позволяющих одновременно увеличить чувствительность наиболее доступных инструментальных методов анализа микропримесей вредных веществ на уровне ПДК (в пределах 2-3 порядков), обеспечить большую стабильность результатов анализа [5, 6, 7].
Материалы и методы. Научно-исследовательская работа проводилась в лаборатории тяжелых металлов и синтетических ядов, лаборатории микотоксинов и в лаборатории пестицидов ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ».
Для определения синтетических пиретроидов искусственно контаминировали 35 проб зерна (25г) стандартным раствором с содержанием 10, 20, 40 мкг дельтаметрина. Каждое звено исследования ручным (обычным) способом заменяли аппаратом: встряхивание, экстракция, концентрирование. Затем смешивали с гексаном и хроматографировали.
Для определения микотоксинов брали 20 проб зерна, по 25 г каждая, искусственно заражали Т-2 токсином (концентрация 100,0 мкг/см3), затем каждый элемент пробоподготовки для определения ми-котоксинов ручным способом заменяли аппаратом. Одновременно такие же исследования проводили по ГОСТу и МУ. Полученные экстракты хроматографировали с использованием ТСХ и подтверждением результатов ГЖХ. Также были проведены исследования с холостой пробой.
Приборы для пробоподготовки представлены ше-стимодульным экстрактором, центрифугой для отделения экстракта от твердой фазы пробы, концентра-том-выпаривателем с шестью модулями. Экстрактор позволяет одновременно производить обработку шести проб. Емкость тефлоновых стаканчиков позволяет размещать до 120 мл, аппарат удобен при обслужива-
нии. Центрифуга служит для отделения растворителя (экстракта) от пробы путем фильтрования. Время на экстракцию одной пробы составляет не более 30 сек и более полный отжим. Концентратор-выпариватель заменяет ротационный испаритель. Время выпаривания досуха трех проб - 50-60 минут.
Результаты исследований. Провели три серии опытов для экспресс пробоподготовки на содержание пиретроидов с использованием новых приборов: экстрактора, центрифуги и концентратора-выпаривателя.
Для первого опыта взяли 10 проб зерна, искусственно контаминировали децисом (1 мл стандарта на 25 г зерна, где содержание дельтаметрина 40 мкг), из них 5 проб - ручным (обычным) способом и 5 проб с помощью центрифуги, экстрактора, концентрато-ра-выпаривателя. При включении в этапы исследования центрифуги происходит значительное сокращение времени анализа на трехкратную экстракцию: при ручном способе - 63 мин, а при автоматизированном - 2 минуты. Общий объем экстракта при ручном способе составил 110 мл (среднее количество) и с концентрацией дельтаметрина в контаминированном зерне - 0,47 мг/кг, а при автоматизированном - 120 мл и 0,49 мг/кг, соответственно. При экстракции происходит стабильный выход экстракта, т.е. при первой экстракции - 28 мл, второй - 45 мл, третьей - 47 мл, соответственно.
Во второй серии опытов взяли 10 проб зерна и искусственно контаминировали дельтаметрином (0,5 мл стандарта на 25 г зерна, где его содержание 20 мкг), из них 5 проб - ручным (обычным) способом и 5 проб с помощью вышеуказанных приборов. При включении экстрактора и центрифуги в процесс пробоподготовки происходит более качественная экстракция от твердой фазы пробы по объему и проценту выхода токсичного элемента и значительное сокращение времени анализа на трехкратную экстракцию: при ручном способе - 61 мин, а при автоматизированном - 2,1 мин. Так, при ручном способе общий объем экстракта составляет 111 мл (среднее количество) и с концентрацией дельтаметри-на в контаминированном зерне - 0,36 мг/кг, а при автоматизированном - 120 мл и 0,51 мг/кг, соответственно.
В третьей серии опытов взяли 10 проб зерна и искусственно контаминировали дельтаметрином из расчета 0,25 мл стандарта на 25 г зерна содержание 10 мкг, из них 5 проб - ручным (обычным) способом и 5 проб с помощью центрифуги, экстрактора, концентратора-выпа-ривателя. При ручном способе пробоподготовки общий объем экстракта составляет 111 мл и с концентрацией дельтаметрина в контаминированном зерне - 0,100 мг/ кг, а при автоматизированном - 117 мл и 0,129 мг/кг, соответственно. При включении в этапы исследования приборов происходило значительное сокращение времени анализа на трехкратную экстракцию: при ручном способе 64 мин, а при автоматизированном - 2,1 мин.
ЕГЕПШАРНЫЙ
Врач
Кроме этого провели исследования с холостой пробой для определения чувствительности анализа при хроматографии. Для чего взяли 0,5 мл стандарта, где содержание дельтаметрина 20 мкг или 0,8 мг/ кг. Для пробоподготовки использовали экстрактор, центрифугу, концентратор-выпариватель и обычным способом. После хроматографии содержание дельтаметрина составило 0,56 мг/кг (70%), при ручном (обычном) способе - 0,38 мг/кг (45%).
Для проведения апробации аппаратовдля экспресс анализа на микотоксины необходимо каждый этап ручной (обычной) пробоподготовки заменить на аппарат, т.е. встряхивание, экстракция, концентрирование.
Схема апробации пробоподготовки на микотоксины (Т-2 токсин):
1. Встряхивание, фильтрация, экстракция с гекса-ном, экстракция с хлороформом, выпаривание досуха под вытяжкой обычным способом, и среднее содержание микотоксина составило 56,3 мкг/кг (56,3%);
2. Встряхивание на экстракторе, а затем продолжение пробоподготовки обычным способом -48,6 мкг/кг (48,6%);
3. Встряхивание на экстракторе, затем центрифугирование и продолжение исследования обычным способом - 53 мкг/кг (53%);
4. Холостые пробы без зерна, но с микотоксином -92,3 мкг/кг (92,3%).
На пробоподготовку на микотоксины ручным (обычным) способом по времени заняло: 1 этап - на встряхивание 90 мин, 2 - фильтрация 40 мин, 3 - экстракция с гексаном 30 мин, 4 - экстракция с хлороформом 10 мин, 5 - выпаривание под вытяжкой - 180 мин. Всего 5,8 ч. При включении первого звена ни-
чего не изменилось (по методике 90 мин), т.е. также 5,8 часов. При включении второго звена пробопод-готовки (центрифуги) по времени заняло 2 мин, т.е. 90+2+30+10+180=5,2 ч. При включении первого, второго и третьего звена (концентратор-выпариватель) на пробоподготовку - 90+2+30+10+60=3,2 ч, т.е. в два раза сократилось время.
Заключение. Эксперименты показали, что при использовании экстрактора, центрифуги и концен-тратора-выпаривателя при определении пиретро-идов происходит сокращение времени экстракции до 2 мин, тогда как при ручном (обычном) способе - 60-64 мин, стабилизация параметров выхода экстракта, повышается процент выхода токсичного элемента, удобство работы. В первой серии опытов (при контаминации 40 мкг на 25 г зерна или 1,6 мг/кг) содержание дельтаметрина составило при включении центрифуги, экстрактора и кон-центратора-выпаривателя - 0,49 мг/кг (30%), при ручном - 0,47 мг/кг (29%). Во второй серии опытов (20 мкг на 25 г зерна или 0,8 мг/кг) содержание де-циса при автоматизированном способе - 0,51 мг/ кг (63%), при обычном способе - 0,36 мг/кг (45%). В третьей серии опытов (10 мкг на 25г зерна или 0,4 мг/кг) содержание дельтаметрина при автоматизированном способе - 0,129 мг/кг (32%), при обычном способе - 0,100 мг/кг (25%).
При замене ручного способа пробоподготовки на автоматизированный при определении микоток-синов в зерне происходит сокращение трудозатрат, времени (обычным способом - 5,8 ч., автоматизированный - 3,2 ч.), а процент выхода микотоксинов примерно одинаковый.
Литература
1. Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде: справочник: в 2-х Т. Т.1 / сост. М.Я.Клисенко [и др.]. - М.: Колос, 1992. - 28 с.
2. Жуленко, В.Н. Ветеринарная токсикология / В.Н.Жуленко, М.И.Рабинович, Г.А.Таланов. - М.: КолосС, 2002. - 384 с.
3. Экстракция в поле переменных сил. Гидродинамика, массопередача, аппараты: в 2-х кн. Кн. 1 / Н.С.Гришин [и др.]. - Казань: КНИТУ, 2011. - 364 с.
4. Гайнанова, А.А. Аппаратурное оформление подготовки проб к анализу микропримесей / А.А.Гайнанова, А.Н.Горшунова, Н.С.Гришин // Вестник Казанского технологического университета. - 2013. - Т. 16, № 19. - С. 262-265.
5. Салин, А.А. Использование массообменной аппаратуры для автоматической пробоподготовки / А.А.Салин, А.Н.Горшунова, Н.С.Гришин // Вестник Казанского технологического университета. - 2015. - Т. 18, № 4. - С. 144-147.
6. Гришин, Н.С. Использование механизированных устройств при концентрировании органических соединений / Н.С.Гришин // Концентрирование следов органических соединений: сб. науч. тр. АН СССР. - М.: Наука, 1990. - 280 с.
7. Белоглазов, И.И. Твердофазные экстракторы / И.И.Белоглазов. - Ленинград: Химия, 1985. - 240 с.
METHOD FOR SAMPLE PREPARATION FOR ANALYSIS OF EXPRESS PYRETHROIDS AND MYCOTOXINS IN GRAIN BY THE METHOD OF GASLIQUID CHROMATOGRAPHY
1Zakirova G.Sh. - Candidate of Veterinary Sciences; 1Papunidi K.Ch. - Doctor of Veterinary Medicine, professor;1 Valeev A.R. - Candidate of Biological Sciences; Jamalova G.R. - postgraduate;
2Grishin N.S. - Doctor Engineering Sciences, professor.
1Federal Center of Toxicological, Radiation and Biological Safety, Kazan, (e-mail:vnivi@mail.ru).
2Kazan National Research Technological University (e-mail: mahp_kstu@mail.ru).
The primary method used to extract samples of compounds being analyzed is liquid-extraction method. Flaw-sample preparation-watches at a low reproducibility to 40%. The basic requirements for constructions extractors: high performance full enough, extracting the target component when the minimum duration of the process, the minimum ratio of quantities of solvent and material, simplicity of design, maintainability and reliability, as well as reasonable automation of their works, which minimize alternative search of constructive decisions on the definition of the types of vehicles for a specific process of extraction. For the approbations of new devices for rapid analysis for mycotoxins and pyrethroids must each phase sample preparation (shaking, filtering, evaporation) replace on device (Extractor, centrifuge, hub). Devices have been developed for this purpose centrifugal type: centrifuge Extractor, hub-superheated steam sterilizer. Experiments have shown that when using the extractor, centrifuges and hub-vyparivatelja in determining the pyrethroids occurs: reduction of the time of extraction to 2 min, whereas in manual mode (ordinary) 60-64 mines, stabilizing output parameter extract increases the percentage of release of toxic element, usability. On sample preparation for mycotoxins manual (common) way to time it took 5.8 h., when automated-3.2 h, i.e. twice the time. Was developed and tested method for quantitative determination of t-2 toxin and del'tametrina in the grain of conventional and automated ways. When using test subjects for sample preparation occurs: a reduction in labor costs and time; Fidelity result; exception routine manual work; improvement of reproducibility of sample preparation; stabilization of parameters; usability; an increase in the volume of extract and percent release of pyrethroids; simplify the standardization sample.
KEYWORDS: pyrethroids, deltamethrin, mycotoxins, t-2 toxin, sample preparation, rapidity, centrifuge extractor, hub.
References
1. Metody opredeleniya mikrokolichestv pesticidov v produktah pitaniya, kormah i vneshnej srede: spravochnik: v 2-h T. T.1 / cost. M.YA.Klisenko [i dr.]. - M.: Kolos, 1992.
Klisenko, A.A. Methods for determination of microquantity of pesticides in foods, animal feed and external Wednesday: a handbook. -T. 1/compl. M. A. A. Klisenko, K.F. Novikova and others. M.: Kolos, 1992. - P. 296-307.
2. ZHulenko, V.N. Veterinarnaya toksikologiya / V.N.ZHulenko, M.I.Rabinovich, G.A.Talanov. - M.: KolosS, 2002. ZHulenko, V.N. Veterinarnaya toksikologiya / V.N.ZHulenko, M.I.Rabinovich, G.A.Talanov. - M.: KolosS, 2002.
Zhulenko, V.N. Veterinary Toxicology / V.N. Zhulenko, M.I. Rabinovich, G.A. Talanov // M.: ColosS, 2002. - 384 p.
3. EHkstrakciya v pole peremennyh sil. Gidrodinamika, massoperedacha, apparaty: v 2-h kn. Kn. 1 / N.S.Grishin [i dr.]. - Kazan': KNITU, 2011.
Grishin, N.S. Variable field extraction forces. Hydrodynamics, massoperedacha, devices: 2 kn. Kn. 1. / N.S. Grishin [etc.] //M-in the image. And science of Russia, Kazan. nat. issled. Tech. UN-t. Kazan: KNITU, 2011. - 364 p.
4. Gajnanova, A.A. Apparaturnoe oformlenie podgotovki prob k analizu mikroprimesej / A.A.Gajnanova, A.N.Gorshunova, N.S.Grishin // Vestnik Kazanskogo tekhnologicheskogo universiteta. - 2013. - T. 16, № 19.
Gajnanova, A.A. Apparatus design for the preparation of samples for analysis of trace/ A.A. Gajnanova, A.N. Gorshunova, N.S. Grishin // Herald of the Kazan University. -2013. -Vol. 16. No. 19. - P. 262-265.
5. Salin, A.A. Ispol'zovanie massoobmennoj apparatury dlya avtomaticheskoj probopodgotovki / A.A.Salin, A.N.Gorshunova, N.S.Grishin // Vestnik Kazanskogo tekhnologicheskogo universiteta. - 2015.
Salin, A.A. The use of massoobmennoj devices for automatic sample preparation/ A.A. Salin, A.N. Gorshunova, N.S. Grishin // Herald of the Kazan University - 2015. -Vol. 18. - № 4. - P. 144-147.
6. Grishin, N.S. Ispol'zovanie mekhanizirovannyh ustrojstv pri koncentrirovanii organicheskih soedinenij / N.S.Grishin // Koncentrirovanie sledov organicheskih soedinenij: sb. nauch. tr. AN SSSR. - M.: Nauka, 1990.
Grishin, N.S. Using mechanized devices during accumulation of organic compounds / N.S. Grishin. Researcher works of the ACADEMY of SCIENCES of the USSR "Concentration of trace organic compounds. -M.: Science, 1990. - 280 p.
7. Beloglazov, I.I. Tverdofaznye ehkstraktory / I.I.Beloglazov. - Leningrad: Himiya, 1985
Beloglazov, I. I. Solid-phase extractors / Beloglazov I. I. // Chemistry. - Leningrad, 1985. - 240 p.
