CC BY
32
УДК 543.9; 543.64
РАЗРАБОТКА ПЬЕЗОКВАРЦЕВЫХ ИММУНОСЕНСОРОВ ДЛЯ ПРОТОЧНО-ИНЖЕКЦИОННОГО АНАЛИЗА ВЫСОКО- И НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ СОЕДИНЕНИЙ
Е.Н. Калмыкова, Т.Н. Ермолаева, С. А. Еремин*
(Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет, кафедра химической энзимологии; e-mail: еremin@enz.chem.msu.ru)
Оценена возможность использования отечественных пьезокварцевых резонаторов с серебряными электродами для создания иммуносенсоров для проточно-инжекцион-ного определения высоко- и низкомолекулярных соединений. Показано, что высокомолекулярные соединения могут непосредственно детектироваться по приращению массы биослоя сенсора в результате образования иммунного комплекса. Так наблюдалась линейная зависимость изменения частоты пьезокристалла от концентрации антител к ДНК красной волчанки в диапазоне 0,1-25 мкг/мл. Низкомолекулярные гаптены, например котинин (метаболит никотина), могут быть определены разработанным иммуносенсором, но только конкурентным методом. Найдено, что концентрация котинина в моче активных курильщиков составляет 4-6 мг/л; а для некурящих людей - 0,5-0,7 мг/л.
Иммунохимические методы анализа обычно применяются в биохимических исследованиях, в медицине, ветеринарии и фармакологии. Они основаны на антиген-антительном взаимодействии определяемого соединения со специфическим биологическим реагентом - антителом. Уникальная способность антител к комплементарным взаимодействиям с антигенами в сложных по составу растворах (слюна, кровь, моча и другие биологические жидкости) обеспечивает высокую специфичность и чувствительность иммуноана-лизов, позволяя выявлять очень низкие концентрации бактериальных и опухолевых клеток, вирусов, гормонов, ферментов, различных метаболитов и лекарственных препаратов [1, 2]. Поэтому создание иммуносенсоров (аналитических устройств, использующих в качестве биочувствительного элемента антитела, антигены или белково-гаптеновые коньюга-ты) становится одним из перспективных направлений аналитического приборостроения. В зависимости от типа физического преобразователя (детектора) выделяют электрохимические, оптические, термические, пьезоэлектрические и другие иммуносенсоры, рекомендованные для решения целого ряда аналитических задач.
В последнее время активно исследуются пьезок-варцевые сенсоры, чувствительные к изменению массы и характеризующиеся рядом достоинств: экспресс-ностью, малой инерционностью, портативностью,
простотой конструкции и низкой стоимостью, а также возможностью осуществлять прямой контроль иммунных реакций без предварительного введения флуоресцентной или ферментной меток, позволяющих регистрировать аналитический сигнал [3-5]. Аналитическим сигналом пьезокварцевого иммуносенсора, служит изменение частоты колебаний пьезокварцевого резонатора (Д/) при увеличении или уменьшении массы биоре-цепторного покрытия за счет образования или разрушения на его поверхности иммунного комплекса.
Возможно два варианта использования пьезоквар-цевых сенсоров. В первом случае (статическом) концентрацию определяемого соединения устанавливают сопоставлением данных, полученных до и после выдерживания сенсора в анализируемом растворе. К недостаткам этого способа следует отнести длительность и трудоемкость анализа. Второй вариант - про-точно-инжекционный анализ (ПИА), позволяет значительно сократить время получения аналитического сигнала, делает возможным проведение серии измерений на одном сенсоре. Кроме того, относительное измерение аналитического сигнала в ПИА позволяет нивелировать вклад неспецифических взаимодействий матричных компонентов пробы с поверхностью сенсора, скорости потока, вязкости реакционной среды и т.п. [6, 7].
За рубежом применяют пьезокварцевые сенсоры с золотыми электродами. Высокая стоимость и отсут-
*кафедра аналитической химии Липецкого государственного технического университета; e-mail: eremin@enz.chem.msu.ru.
ствие серииного производства таких сенсоров сдерживают их широкое применение в отечественном анализе [8].
Цель проводимого исследования - оценка возможности использования отечественных пьезокварцевых резонаторов с серебряными электродами для проточ-но-инжекционного анализа высоко- и низкомолекуля-ных органических соединении.
Методы исследования
В работе использовали следующие реагенты: коти-нин, транс-4'-карбоксикотинин, бычий сывороточный альбумин (BSA), тартразин ("Sigma", США), глутаро-вый альдегид ("Renal", Венгрия), мочевину, креати-нин, хлорид натрия, азид натрия, гидроксид натрия, муравьиную и соляную кислоты, роданид калия, тет-раэтоксисилан и у- аминопропилтриэтоксисилан ("х.ч.") отечественного производства. Для анализов применяли бидистиллированную воду.
В качестве антител к ДНК применяли сыворотку крови больного с симптомами системной красной волчанки (активность 320 м.е.). Антитела к котинину получены иммунизацией овец иммуногеном на основе транс-4'-карбоксикотинина по ранее описанной схеме [9]. В работе использовали 0,1% растворы лиофилизо-
Рис. 1. Схема установки для проточно-инжекционного анализа: 1 -проточная ячейка с пьезокварцевым биосенсором; 2 - перистальтический насос; 3 - частотомер; а - фосфатный буфер; б - анализируемая проба; в - регенерирующий раствор
ванных антител в фосфатном буферном растворе (рН 7,2). Котинин-белковые конъюгаты синтезированы по методу [10].
Синтетическая урина была приготовлена в соответствии с методикой [11] и содержала в 1 л воды следующие компоненты (г): мочевину (22,0); креати-нин (1,50); ШС1 (5,20); ШН2Р04 2Н20 (1,4); Ш2НР04Н20 (1,10); NN3 (1,00); тартразина (0,010). Раствор хранили при 4°.
Определение котинина в моче осуществляли по предварительно построенному калибровочному графику. Стандартные растворы котинина (0,5; 1; 2; 4 и 8 мкг/мл) готовили растворением препарата в синтетической урине. При построении калибровочного
III стадия
Рис. 2. Схема формирования биослоя на поверхности серебряного электрода пьезокварцевого биосенсора
графика и подготовке образцов мочи к анализу к 10 мкл стандартного раствора с различным содержанием котинина или анализируемой пробы добавляли 850 мкл фосфатного буферного раствора (рН 7,2) и 5 мкл раствора антител. Смесь инкубировали в течение 15 мин при 20°.
Установка для ПИА (рис. 1) состояла из перистальтического насоса "011ъоп", дозатора, проточной ячейки детектирования объемом 15-20 мкл, включающей серийно выпускаемые отечественные пьезокварцевые сенсоры АТ-среза с серебряными электродами диаметром 8 мм и собственной частотой колебаний 810 МГц, на поверхности которых были иммобилизованы иммунореагенты (ДНК или котинин-белко-вые коньюгаты). Сенсоры контактировали одной стороной с анализируемой жидкой фазой. Силиконовые трубки диаметром 0,16 мм соединяли микроячейку с перистальтическим насосом и дозатором. Скорость потока жидкости составляла 30 мкл/мин. В качестве раствора-носителя использовали 5-50 мМ фосфатный буфер (рН 6,8; 7,0; 7,2). Изменение частоты колебаний сенсора с интервалом в 1 мин регистрировали частотомером Ч3-54.
Результаты и обсуждение
Стабильная работа иммуносенсоров зависит от прочности иммобилизации биорецепторов на поверхности электродов. Наиболее распространенным приемом является предварительное формирование золь-гель методом кремнеорганического слоя, к которому затем ковалентно пришивают антитела или антигены [12, 13]. Несмотря на то, что известные способы обеспечивают достаточно прочную иммобилизацию биополимеров, процесс получения рецепторного слоя является длительным и трудоемким. В проточно-ин-жекционном анализе важно сохранение постоянной массы чувствительного слоя в течение одного измерения (3 мин), поскольку аналитический сигнал (А/) рассчитывается как разность частот колебаний сенсо-
Рис. 3. Изменение отклика сенсора в ходе одного цикла измерения
Рис. 4. Кинетические кривые связывания различных концентраций антител к ДНК (1 - 1,0 нг/мл; 2 - 10 нг/мл; 3 - 100 нг/мл) и BSA (4) с рецепторным покрытием биосенсора
ра в начале измерения и в момент установления равновесия. Поэтому процесс формирования биорецеп-торного покрытия сенсора был значительно упрощен и сокращен (рис. 2). Кремнеорганический слой получается путем нанесения фиксированного объема неразбавленного тетраэтоксисилана на тщательно обезжиренный ацетоном электрод. Исключение стадии обработки у-аминопропилтриэтоксисиланом сокращало продолжительность формирования покрытия без снижения его качества. Биомолекулы пришивали к подложке глутаровым альдегидом, нанося последовательно на поверхность электродов соответствующие растворы в виде капель. Предлагаемая схема иммобилизации обеспечивает многократное использование пьезокварцевого сенсора в проточно-инжекци-онном анализе.
Перед началом измерений через систему пропускали буферный раствор до стабилизации базисной линии (30 мин). Измерительный цикл включал следующие этапы (рис. 3): 1 - пропускание через ячейку фосфатного буфера (1 мл) для стабилизации сигнала биосенсора; 2 - введение в поток анализируемой пробы (0,2 мл); 3 - пропускание буферного раствора (0,2 мл) для удаления избыточных, не связавшихся в иммунный комплекс молекул аналита; 4 - ввод регенерирующего раствора (0,01 мл) для диссоциации иммунного комплекса, образованного на поверхности электродов сенсора и восстановление частоты сенсора практически до исходных значений. Введение в поток анализируемой пробы, содержащей определяемое соединение, вызывает резкое снижение частоты колебаний сенсора вследствие иммунного взаимодействия с рецепторным биослоем на поверхности иммуносенсо-ра. Разность частоты колебаний пьезокварцевого резонатора (А/) между стадиями 1 и 3 (рис. 3) регистри-
f, m
8923410
8923370
8923330
8923290
\ ï\
8923250
ж.
\ \
""Ж
Л%1 к ji3
""¿"а-5* и 2
vV-^
V
Г
_|_I_I_I_L.
о
¡9 12 15 Время, мин
Af, Гц 120
Рис. 5. Формирование аналитического отклика биосенсора в зависимости от содержания (нг): 1 - 0; 2 - 0,1; 3 1,0; 4 - 10,0 котинина в ячейке (а) и градуировочный график для определения котинина в моче (б)
ровали в качестве аналитического сигнала. Для регенерации сенсора применяли 3 М КСКБ.
Определение высокомолекулярных соединений обычно осуществляеют прямым измерением увеличения массы биорецепторного слоя сенсора в результате образования аффинного комплекса на его поверхности. В качестве примера рассмотрено определение антител к ДНК.
Известно, что так называемые аутоиммунные заболевания человека и животных характеризуются неадекватной реакцией организма на его собственные клеточные компоненты, например ДНК. Накопление антител к ДНК в крови является одним из клинических показателей аутоиммунных заболеваний, например системной красной волчанки [14]. Нами в качестве антител к ДНК использована сыворотка крови больного с симптомами системной красной волчанки. Аналитический отклик иммуносенсора зависит от концентрации и рН буферного раствора, скорости потока жидкости, температуры опыта. Выбор диапазона рН обусловлен значениями, близкими для биологических жидкостей человека (6,8-7,2). Изменение рН в указанном интервале и температуры в диапазоне 1826° незначительно влияет на аналитический отклик. Снижение концентрации буферного раствора (до 5 мМ) и скорости потока (до 30 мл/мин) приводит к увеличению аналитического сигнала сенсора.
В интервале концентраций 0,1-25 мкл/мл отмечена линейная зависимость Д/ сенсора от концентрации антител к ДНК (рис. 4). Определение антител к ДНК может осуществляться в присутствии сопутствующих веществ белковой природы. Например, молекулы BSA не связываются с рецепторным покрытием сенсора и не вызывают изменения частоты колебаний при прохождении раствора BSA через ячейку детектирования.
Иммуносенсор может быть использован многократно после его регенерации веществами, способными разрушать иммунный комплекс на поверхности рецеп-торного слоя (8 М раствор мочевины, 0,1 М NaOH, 0,1 М HCOOH или 3 М KCNSJ. При применении в качестве регенерирующего раствора KCNS сохраняется целостность кремнеорганической подложки при достаточно быстром разрушении иммунного комплекса. Чувствительность сенсора сохранялась практически постоянной в течение 10-15 измерений. Остальные реагенты вызывали наряду с регенерацией частичную деструкцию биослоя, на что указывало увеличение на 40-60 Гц величины /о после каждого цикла измерений.
Для разработки иммуносенсора на низкомолекулярное соединение в качестве гаптена исследовали коти-нин - основной метаболит никотина (маркер курильщиков), используемый при проведении массовых
клинических исследований. В настоящее время коти-нин определяют методами жидкостной хроматографии [15], а также различными высокочувствительными иммунохимическими методами (радиоиммуноанализ [11], ELISA [16], поляризационный флуоресцентный иммуноанализ [17] и др.), но все иммунохимические методы требуют введения специальной метки.
Прямое определение низкомолекулярных антигенов (гаптенов) в проточно-инжекционном режиме с помощью пьезокварцевых биосенсоров затруднено, вследствие очень низкого приращения массы чувствительного слоя при протекании иммунохимичес-кой реакции [2, 18]. Для проведения анализа по конкурентной схеме [18] биорецепторный слой формировали на основе конъюгата гаптена с белком. Анализируемые пробы содержали различное количество котинина и одинаковое для всех образцов фик-
сированное количество антител к нему. На стадии детектирования котинин, содержащийся в анализируемой пробе и иммобилизованный на поверхности сенсора, конкурировали за взаимодействие с фиксированным количеством антител. Аналитический отклик иммуносенсора обратно пропорционален содержанию гаптена в растворе (рис. 5, а).
Иммуносенсор апробирован для определения коти-нина в моче людей. Для построения градуировочного графика (рис. 5, б) использовали синтетическую мочу с различной концентрацией котинина. Ранее установлено, что содержание котинина в свежей моче некурящих людей не превышает 0,5 мг/л, для активных курильщиков этот показатель составляет 1,0 мг/л и выше [17]. В исследованных нами образцах мочи концентрация котинина составляла 4-6 мг/л у курящих, 0,5-0,7 мг/л у некурящих.
Работа была выполнена при поддержке гранта ИНТАС 00-00870 "Простые методы определения потенциальных ксенобиотиков в воде и пищевых продуктах". Авторы выражают благодарность проф. Казанского государственного университета В. Г. Винтеру за любезно предоставленые образцы ДНК.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Minunni M., Mancini M., Guilbault G., Hock B. // Anal. Lett. 1995.
28. Р. 749.
2. Медянцева Э.П., Халдеева Е.В., Будников К.Г. // ЖАХ. 2001. 56.
№ 10. С. 1015.
3. Tang A.X.J., Pravda M., Guilbault G.G., Piletsky S., Turner A.P.F.
// Anal. Chim. Acta. 2002. 471. P. 33.
4. Wong Y.Y., Ng S.P., NgM.H., Si S.H., Yao S.Z., Fung Y.S. // Biosen.
Bioelectron. 2002. 17. P. 676.
5. Halamek J., HepelM., Skladal P. // Biosen. Bioelectron. 2001. 16.
P. 253.
6. Thompson V., Kipling A.L., Duncan-Hewitt W.C. et al. // Analyst.
1991. 116. P. 881.
7. Liu Y.-C, Wang C.-M., Hsiung K.-P. // Anal. Biochem. 2001. 299.
P. 130.
8. Huang M., Shen D, Chow L.-M, Yang M. // Analyst. 2002. 127.
P. 940.
9. Al-Hakiem M.H.H., White G. W., Smith D.S., Landon J. // Ther. Drug
Monit. 1981. 3. P. 159.
10. Degraw J.I., Cory M., Skinner A. et al. // J. Med. Chem. 1968. 11. P. 225.
11. Hansel M.C., Rowell F.J., Landon J., Sidki A.M. // Ann. Clin. Biochem. 1986. 23. P. 596.
12. Фадеев А.Ю., Ельцов А.А., Алешин Ю.К., Малышенко С.И. и др. // Ж. физ. химии. 1994. 68. № 11. С. 2071.
13. Babacan S., Pivarnik P., Letcher S., Rand A.G. // Biosen. Bioelectron. 2000. 15. P. 615.
14. Tan E.M. // Adv. Immunol. 1982. 33. P. 167.
15. Baranowski J., Pochopien G., Baranowska I. // J. Chromatgr. B 1998. 707. P. 317.
16. Galanti L.M., Dell'Omo J., Vanbeckbergen D., Dubois P., Mas-son P.L., Cambiaso C.L. // Clin. Chem. Lab. Med. 1999. 37. P. 729.
17. Eremin S.A., Coxon R.E., Colbert D.L., Landon J., Smith D. S. // Analyst. 1992. 117. P. 697.
18. Horacek J., Skladal P. // Anal. Chim. Acta. 1997. 347. P. 43.
Поступила в редакцию 25.10.02
