CC BY
29
УДК 615.32.011.5:615.014.2:618.19-006.66-092.9 J.A.Borisova, Z.S. Shprakh, G.B.Smirnova, O.L.Orlova, A.P.Polozkova, N.A.Oborotova, HM.Treshalina 2. РАЗРАБОТКА ПЕРОРАЛЬНОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ ПОД КОНТРОЛЕМ ЭФФЕКТИВНОСТИ
Юлия Александровна Борисова, младший научный сотрудник, лаборатория комбинированной терапии опухолей НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБНУ "РОНЦ им. Н.Н. Блохина" Зоя Сергеевна Шпрах, к. фарм. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории готовых лекарственных форм НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБНУ "РОНЦ им. Н.Н. Блохина" Галина Борисовна Смирнова, к.б.н., старший научный сотрудник, лаборатория комбинированной терапии опухолей НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБНУ "РОНЦ им. Н.Н. Блохина" Ольга Львовна Орлова, к. фарм. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории разработки лекарственных форм НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБНУ "РОНЦ им. Н.Н. Блохина" Алевтина Павловна Полозкова, старший научный сотрудник лаборатории разработки лекарственных форм НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБНУ "РОНЦ им. Н.Н. Блохина" Наталия Александровна Оборотова, профессор, д.фарм. наук, заведующая лабораторией разработки лекарственных форм НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБНУ "РОНЦ им. Н.Н. Блохина" Елена Михайловна Трещалина, профессор, д.м.н., заведующий, лаборатория комбинированной терапии опухолей НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБНУ "РОНЦ им. Н.Н. Блохина"
Адрес для переписки: 115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24, НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБНУ "РОНЦ им. Н.Н. Блохина", лаборатория комбинированной терапии опухолей, Смирнова Галина Борисовна, e-mail: gsmir53@yandex.ru.
Реферат
На мышах с эстрогензависимой (РЭ+) аденокарциномой молочной железы Са755 РЭ+ в процессе разработки ЛФ СЕКО для приема внутрь изучены 2 модели различного состава в прямом сравнении с фармацевтической субстанцией. Показана равная эффективность субстанции сер. 24.10.11 и модели «Пропись №2» на уровне ТРО=80-75% в течение 12 дней после отмены лечения в оптимальной схеме. Эта модель, представляющая собой гранулят в капсулах, содержащий 100 мг субстанции и 5% крахмала в качестве вспомогательного вещества («СЕКО-капсулы 100 мг»), является оптимальной и рекомендована для продолжения доклинического изучения. Сделан вывод о том, что, несмотря на некоторые технологические особенности фармацевтической субстанции, добавление других вспомогательных веществ к субстанции СЕКО нецелесообразно, так как приводит к снижению эффективности.
Ключевые слова: секоизоларицирезинол, лекарственная форма, биоконтроль, мыши, эстрогензависимая аденокарцинома молочной железы.
J.A.Borisova, Z.S. Shprakh, G.B.Smirnova, O.L.Orlova, A.P.Polozkova, N.A.Oborotova, H.M.Treshalina. DEVELOPMENT OF SECOISOLARICIRESINOL PER ORAL DRUG FORM UNDER EFFICACY CONTROL.
N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center
Summary
During the development of SECO per oral drug form it was investigated two different preparation on the mice with murine estrogen positive mammary adenocarcinoma Ca755 (ER+) in direct comparison of pharmaceutical substance. It was shown the equal efficacy for substance number of 24.10.11 and preparation «Formulation №2» on the tumor growth inhibition level of TGI=80-75% at the period of 12 days after treatment with optimal schedule of therapy. This preparation was contained capsulated granulate with 100 mg substance and 5 % starch as excipient and was recommended for continuation the preclinical study as optimal drug form «SECO-capsules 100 mg». As the conclusion of this investigation was postulated that to add any additional excipients into SECO oral drug formulation does not reasonable despite the real features, because it leaded to decreasing of its efficacy.
Key words: secoisolariciresinol, dosage form, biocontrol, mice, estrogen-dependent mammary adenocarcinoma.
Введение
Ранее показано, что субстанция нового малорастворимого в воде фитоантиэстрогена СЕКО [1-4] в широком диапазоне доз при пероральном введении в 1 %-ном крахмальном клейстере мышам воспроизводимо и достоверно ингибирует рост эстрогензависи-мых перевиваемых опухолей на уровне тамоксифена. В оптимальной схеме введения СЕКО показал отсутствие риска стимуляции метастазирования и эффективность на запущенной карциноме [5-8]. Эти данные были основанием для начала доклинического изучения СЕКО в качестве функционального аналога тамокси-фена. В рамках исследования выполнена разработка капсулированной модели ЛФ для перорального применения, чему и посвящено настоящее сообщение.
Цель исследования: разработка капсулиро-ванной лекарственной формы секоизоларицирези-нола для приема внутрь.
Задачи исследования:
1. Разработка капсулированных моделей лекарственной формы СЕКО разного состава для приема внутрь.
2. Выбор оптимальной пероральной лекарственной формы СЕКО под контролем эффективности.
Материалы и методы
Субстанция СЕКО. Для приготовления моделей ЛФ в капсулах для приема внутрь использована фармацевтическая субстанция сер. 29.09.11 и
24.10.11 производства ЗАО "БиоХимМак" СТ, Москва. Технологические характеристики порошка субстанции СЕКО не позволяют проводить прямое наполнение капсул без увеличения фракции укрупненных и утяжеленных частиц.
Гранулирование с помощью вспомогательных веществ позволяет контролировать стабильность дозирования капсулированной фармацевтической субстанции. Для получения модели ЛФ капсулы заполняются готовым гранулятом, который используется после извлечения из капсулы для приготовления рабочей взвеси, предназначенной для введения животным.
Вспомогательные вещества: крахмал картофельный, лактоза, тальк, повидон, целлюлоза микрокристаллическая, магния стеарат, кальция стеарат и др., соответствующие требованиям Гос. Фармакопеи XI и XII изд., Европейской фармакопеи, отдельных фармакопейных статей, ГОСТов и ТУ.
Приборы и аппаратура. Капсулонаполняю-щая машинка МС-1,2 фирмы Pharma, Италия; приборы для определения технологических характеристик твердых лекарственных форм фирмы «Erweka», Германия.
Модели лекарственной формы СЕКО. В готовом виде модели ЛФ представляют собой капсули-рованный гранулят. Для исследований приготовлены 2 прописи ЛФ, содержащие гранулят разного состава. «Пропись №1» содержит вспомогательные вещества. «Пропись №2», содержащая в качестве вспомогательного вещества только крахмал, аналогична по составу рабочей взвеси субстанции в 1 %-ном крахмальном клейстере, показавшей эффективность ранее.
Животные. Использованы 120 иммуноком-петентных мышей-самок гибридов BDFi [C57Bl6JxDBA2], в т.ч. 20 особей линии C57Bl6j (доноры опухолевого материала) массой тела 20-21 г. Мышей получали из питомника «Столбовая» ГУ НЦ БМТ и содержали в отделе лабораторных животных НИИ ЭДиТО РОНЦ им. Н.Н. Блохина при обычном световом дне, на экструзированном корме и постоянном доступе к воде.
Опухолевые модели. Использован штамм мышиной перевиваемой аденокарциномы молочной железы Ca755 РЭ+ (3-4 пассажи) из Банка РОНЦ Трансплантацию опухоли выполняли мышам BDF1 в соответствии с рекомендованными методиками [9].
Проведение лечения. Для введения мышам гранулят СЕКО извлекали из капсул и добавляли 1 %-ный крахмальный клейстер для получения рабочей взвеси. Взвесь, полученную из обеих моделей ЛФ, в разовой дозе 250 мг/кг вводили мышам в желудок один раз в сутки ежедневно в течение 10 дней (суммарная доза 2,5 г/кг) с помощью металлического зонда. Субстанцию СЕКО разводили аналогично и вводили мышам в том же дозовом режиме. Сроки лечения составляли 3-12 сутки после трансплантации опухоли. Мыши контрольных групп получали 1% крахмальный клейстер в адекватном объеме и режиме.
Оценка эффективности. У всех мышей после окончания лечения трехкратно определяли размеры опухоли с помощью электронного измерителя и рассчитывали объем по формуле V=axbxc. После чего определяли Vq, в каждой группе и стандартный показатель эффективности торможение роста опухоли:
(V - V ) TPO,% =К 0 k х 100, где
(V)
V0 и VK величина V^ в опыте и в контроле.
В качестве критерия эффективности использовали проспективные данные об эффективности субстанции в каждом конкретном случае [9]. Оценка биологической активности каждой модели ЛФ проведена при параллельном сравнении с субстанцией, из которой она получена в течение 23 дней после перевивки.
Оценка переносимости воздействия. Учитывая отсутствие риска токсичности у СЕКО при пероральном введении в использованной дозировке и отсутствие каких-либо биологически активных компонентов в моделях ЛФ, переносимость лечения оценена только по состоянию и поведению мышей в процессе эксперимента.
Статистическая обработка результатов. Полученные данные обрабатывали статистически с использованием доверительных интервалов средних сравниваемых величин по стандартному методу Стьюдента в модификации Р.Б. Стрелкова. Достоверными считали различия при р<0,05.
Завершение экспериментов на мышах. После завершения наблюдения мышей умерщвляли передозировкой эфирного наркоза, а трупы кремировали в специализированном подразделении РОНЦ с учетом международных рекомендаций по проведению медико-биологических исследований с использованием животных [10; 11].
Результаты
Получение гранулята СЕКО
Методика получения гранулята СЕКО была аналогичной для обеих прописей. Для стандартизации насыпной массы и предотвращения расслаивания смеси и вспомогательных веществ использовали влажную грануляцию 5 %-ным крахмальным клейстером в расчете на 100 капсул. Затем протирали через сито с диаметром пор 0,67 мм и сушили на воздухе 24 ч до полного высыхания и гранулирования. Высушенные гранулы просеивали через сито с 0 пор 1,0 мм для разделения слипшихся. Полученный гранулят опудривали смесью, приготовленной путем тщательного смешения талька, крахмала и стеарата кальция. Далее на сите с 0 пор 0,2 мм отсеивали остатки опудривающей смеси в виде мелкой пыли для обеспечения точности дозирования. Готовым гранулятом заполняли капсулы с помощью капсулонаполняющей машинки. Полученные модели ЛФ отвечали требованиям ГФ XI, предъявляемым к гранулам и капсулам [12-15].
Биологическая активность моделей ЛФ
(табл. 1, рис. 1-2).
«Пропись №1»
Сравнительное изучение показало, что модель ЛФ «Пропись №1» в оптимальной схеме применения ингибирует рост Са755 РЭ+ достоверно, но слабо и кратковременно, ТРО=60 % (р<0,05) только на 6-е сутки после окончания лечения. Субстанция сер. 29.09.11, из которой приготовлена «Пропись №1», вызывала существенно более длительный и выраженный эффект, ТРО=73-43% (р<0,05) в течение всего периода наблюдения.
«Пропись №2»
Сравнительное изучение показало, что модель ЛФ «Пропись №2» и субстанция сер. 24.10.11, из которой она приготовлена, в оптимальной схеме применения длительно и на достоверно высоком уровне ингибировали рост Са755 РЭ+, ТРО=80-75 % (р<0,05) в течение 12 дней после окончания лечения.
Таблица 1
Результаты биоконтроля 2 моделей лекарственной формы СЕКО в разовой дозе 250 мг/кг при 10-кратном перо-ральном введении _ мышам с Са755 РЭ+__
Группа Средний объем опухоли на сутки после трансплантации опухоли ТРО % на сутки после окончания лечения
12 17 23 1 6 12
Контроль роста опухоли 513 [322-738] 4141 [2902-5459] 8892 [6723-10907] - - -
Субстанция* 137 [2-272] 933 [593-1273] 4557 [2975-6139] 73** 77** 48**
Модель ЛФ «Пропись №1» 183 [22-344] 1591 [741-2441] 5679 [3531-7827] 64 60** 35
Контроль роста опухоли 1518 [988-2048] 4091 [3018-5164] 8196 [5934-10458] - - -
Субстанция* 311 [236-386] 1116 [509-1723] 1880 [652-3108] 80** 73** 77**
Модель ЛФ «Пропись №2» 308 [152-464] 729 [66-1392] 2042 [875-3208] 80** 82** 75**
*вводили в 1 %-ном растворе крахмального клейстера ежедневно перорально на 3-12 сутки после трансплантации опухоли; **различия с контролем достоверны (р<0,05).
Таблица 2
Основные показатели качества оптимальной модели лекарственной формы секоизоларицирезинола «Пропись №2»
Средняя масса (мг) и однородность по массе содержимого капсулы (%) разных серий Распадае-мость, мин Растворение, % Количественное определение, мг
0,131; ± 9,1% 19 77,6 102,5
0,107; ± 4,2% 19 97,4 98,6
Требования ГФ
0,115 - 0,140 (± 10%) <20 >75 % от заяв. к-ва действ. в-ва в теч. 2 ч и 100 об/мин. От 92,5 до 107,5
Сравнительная эффективность субстанции и моделей лекарственной формы СЕКО в разовой дозе 250 мг/кг при ежедневном пероральном введении в течение 10 дней на Са755 РЭ+.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Сутки после трансплантации опухоли
Рис. 1. Биоконтроль модели лекарственной формы СЕКО "Пропись №1".
1 - контроль роста опухоли,
2 - субстанция СЕКО,
3 - лекарственная форма СЕКО.
11000 10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0
4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Сутки после трансплантации опухоли
Рис. 2. Биоконтроль модели лекарственной формы СЕКО "Пропись №2".
1 - контроль роста опухоли,
2 - субстанция СЕКО,
3 - лекарственная форма СЕКО.
По внешнему виду ЛФ «Пропись №2» представляет собой твердые желатиновые капсулы в форме цилиндра с полусферическими концами № 3. Корпус белого, а крышечка - синего цвета. Капсулы содержат белого цвета с кремова-
тым оттенком гранулы размером от 0,3 мм до 1,5 мм. Другие показатели качества ЛФ, получившей рабочее название «СЕКО-капсулы 100 мг», представлены в табл. 2.
Заключение
Проведенные исследования показали, что биологические эффекты на опухолевой модели, полученные в прямом сравнении для субстанции и ЛФ СЕКО без вспомогательных веществ, эквивалентны. Оптимальная лекарственная форма СЕКО
для приема внутрь «СЕКО-капсулы 100 мг» представляет собой капсулированный гранулят, 5 содержащий 100 мг субстанции и 5 %-ного крахмала в качестве вспомогательного вещества. Добавление вспомогательных веществ к субстанции СЕКО нецелесообразно, так как приводит к снижению эффективности.
Литература
1. Способ выделения секоизоларицирезинола и дигидрокверцетина из древесины // Нифантьев Н.Э., Яшунский Д.В., Меньшов В.М., Цветков Ю.Е., Цветков Д.Е. - Патент на изобретение РФ. - 2009. -№ 2359666.
2. Knots in trees - A new rich source of lignans / Holmbom B., Eckerman C., Eklund P., Hemming J., Nisula L., Reunanen M., Sjoholm R., Sundberg A., Sundberg K., Willfor S // Phytochemistry Reviews. - 2003. - N 2. - P. 331-340.
3. Studies on the Metabolism of the Plant Lignans Secoisolariciresinol and Matairesinol / Niemeyer H.B., Honig D. M., Kulling S. E., Metzler M // J. Agric. Food Chem. - 2003. - N 51. - P. 6317-6325
4. Enterolactone Inhibits the Growth of 7,12-Dimethylbenz(a) anthracene-induced Mammary Carcinomas in the Rat / Saarinen N.M., Huovinen R., Warri A., Makela S. I., Valentin-Blasini L., Sjoholm R., Ammala J., Lehtila R., Eckerman C., Collan Y. U., Santti R. S. // Molec. Cancer Therap. - 2002. - N 1. - P. 869-876
5. Седакова Л. А., Смирнова Г. Б., Борисова Ю. А., Трещалина Е. М. Результаты скрининга нового фи-тоантиэстрогена секоизоларицирезинола на гормонозависимой опухолевой модели in vivo // Тез. докл. Белорусско-Российской науч.-практ. конференции, Минск - 2013. - С. 73.
6. Седакова Л.А., Смирнова Г.Б., Борисова Ю.А., Трещалина Е.М. Сравнительная эффективность секоизоларицирезинола и тамоксифена в т.ч. в комбинации с аримидексом. // РБЖ - 2013. - №23. - стр.73.
7. Действие нового антиэстрогенного препарата секоизоларицирезинола на рост запущенной эстроген-зависимой опухоли и метастазирование меланомы B16/F10 // Седакова Л. А., Борисова Ю.А., Смирнова Г.Б., Трещалина Е.М. // РБЖ - 2013. - №23. - стр.73.
8. Preclinical results of the new phyto-antiestrogen sekoisolaryciresinol treatment of estrogen- dependent murine tumor // Borisova Yu., Smirnova G., Sedakova L., Treshalina H., Shprakh Z., Nifantiev N.// 25th Int. Congress on Anti-Cancer Treatment. -2014. - Paris. Frence. - P. IC/AB1235.
9. Методические рекомендации по доклиническому изучению противоопухолевой активности лекарственных средств / Трещалина Е. М., Жукова О. С., Герасимова Г. К., Андронова Н. В., Гарин А. М. // Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств // Под ред. А. Н. Миронова - М. Гриф и К, - 2012. - ч. 1, - гл. 39. - C. 642-657.
10. Европейская конвенция по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей, ЕЭС, Страсбург, 1985 г. // Ланималогия. - 1993. - №1. - с.29.
11. Дидактические и этические аспекты проведения исследований на биомоделях и на лабораторных животных // Большаков О.П., Незнанов Н.Г., Бабаханян // Р.В.Ж. Качественная клиническая практика. -2002 - №1.
12. Studies on tabletting properties of lactose part 3. The consolidation behaviour of sieve fractions of crystalline a-lactose monohydrate. /A.H. de Boer, H.Vromans, C.F.Lerk, G.K.Bolhuis, K.D. Kussendrager, H.Bosch// Pharm. Weekbl. Sci. - 1986. - Ed. 8. - P.145-150.
13. Co-processed Excipients:IPEC Guidelines, www.usp.org.
14. Коллидон. Поливинилпирролидон для фармацевтической промышленности. /Бюлер Ф. М.// Ludwigshafen : BASF - 2001. - C.20-40.
15. Государственная Фармакопея СССР, XI издание, выпуск 2.// Медицина. - 1987. - С.139, 143 - 145, 158 - 159.
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ЛФ - лекарственная форма
