Научная статья на тему 'Разработка оптимальных методов регенерации полужидкой питательной среды'

Разработка оптимальных методов регенерации полужидкой питательной среды Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

CC BY
744
40
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
РЕГЕНЕРАЦИЯ / REGENERATION / ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА / NUTRIENT MEDIUM / БИФИДУМБАКТЕРИИ / МЕТАБОЛИЗМ / METABOLISM / КУЛЬТИВИРОВАНИЕ / CULTIVATION / BIFIDUMBACTERIA

Аннотация научной статьи по промышленным биотехнологиям, автор научной работы — Андрусенко Светлана Федоровна, Бегдай Инна Владимировна

Было изучено изменение компонентного состава и физико-химических параметров питательной среды до и после культивирования бифидумбактерии. Разработаны методы очистки отработанных питательных сред от продуктов метаболизма и апробированы различные способы восстановления питательных сред на процессы регенерации. Полученные данные свидетельствует о возможности восстановления первоначальных свойств питательной сред за счет восстановления ее нейтральной реакции. Наиболее эффективными являются физико-химические методы регенерации с использованием полупроницаемых мембран. Регенерированные питательные среды могут быть использованы на микробиологических и биохимических производствах. Данные исследования позволяют сделать процесс использования питательных сред экономически выгодным, так как позволят значительно снизить затраты на приготовление питательной среды и ее утилизацию за счет возможности увеличения кратности использования питательных сред.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по промышленным биотехнологиям , автор научной работы — Андрусенко Светлана Федоровна, Бегдай Инна Владимировна

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

DEVELOPMENT OF OPTIMUM METHODS OF REGENERATION OF THE SEMI-FLUID NUTRIENT MEDIUM

We studied the changes of the component composition and physic-chemical parameters of the nutrient medium before and after cultivation of bifidobacteria. Developed methods for purification of spent growth media from products of metabolism and tested different methods to restore nutrient media for regeneration. The data obtained indicate the possibility of restoring the original properties of nutrient mediums by restoring its neutral reaction. The most effective are physical and chemical methods of regeneration using semi-permeable membranes. Regenerated nutrient medium can be used for microbiological and biochemical industries. These studies allow us to make the process of using mediums cost effective because it will significantly reduce the cost of preparation of the nutrient medium and its disposal by the possibility of increasing the usage frequency of nutrient medium.

Текст научной работы на тему «Разработка оптимальных методов регенерации полужидкой питательной среды»

БИОЛОГИЧЕСКИЕ

НАУКИ

«НАУКА. ИННОВАЦИИ. ТЕХНОЛОГИИ», №1, 2016

удк 579.6 Андрусенко С.Ф. [Andrusenko S.F.],

Бегдай И.В. [Bagday I.V.]

РАЗРАБОТКА ОПТИМАЛЬНЫХ МЕТОДОВ РЕГЕНЕРАЦИИ ПОЛУЖИДКОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ

Development of optimum methods of regeneration

of the semi-fluid nutrient medium

Было изучено изменение компонентного состава и физико-химических параметров питательной среды до и после культивирования бифидумбактерии. Разработаны методы очистки отработанных питательных сред от продуктов метаболизма и апробированы различные способы восстановления питательных сред на процессы регенерации. Полученные данные свидетельствует о возможности восстановления первоначальных свойств питательной сред за счет восстановления ее нейтральной реакции. Наиболее эффективными являются физико-химические методы регенерации с использованием полупроницаемых мембран. Регенерированные питательные среды могут быть использованы на микробиологических и биохимических производствах. Данные исследования позволяют сделать процесс использования питательных сред экономически выгодным, так как позволят значительно снизить затраты на приготовление питательной среды и ее утилизацию за счет возможности увеличения кратности использования питательных сред.

Ключевые слова: регенерация, питательная среда, бифидумбактерии, метаболизм, культивирование.

We studied the changes of the component composition and physic-chemical parameters of the nutrient medium before and after cultivation of bifidobacteria. Developed methods for purification of spent growth media from products of metabolism and tested different methods to restore nutrient media for regeneration. The data obtained indicate the possibility of restoring the original properties of nutrient mediums by restoring its neutral reaction. The most effective are physical and chemical methods of regeneration using semi-permeable membranes. Regenerated nutrient medium can be used for microbiological and biochemical industries. These studies allow us to make the process of using mediums cost effective because it will significantly reduce the cost of preparation of the nutrient medium and its disposal by the possibility of increasing the usage frequency of nutrient medium.

Keywords: regeneration, nutrient medium, bifidumbacteria, metabolism, cultivation.

В настоящее время вопрос получения культур различных микроорганизмов является весьма важным для многих отраслей народного хозяйств. Одним из основных условий получения высокого результата является правильно подобранная питательная среда для культивирования микроорганизмов [3, 8].

В питательные среды для культивирования микроорганизмов входят дорогостоящие ингредиенты животного и растительного происхождения. Литературные источники свидетельствуют о том, что к моменту достижения стационарной фазы в питательной среде, независимо от ее первоначального состава, остаются неиспользованными 80-85% ростовых и энергетических веществ и соединений [4]. Тем не менее, питательные среды зачастую используют однократно, а используемая в качестве субстрата питательная среда после отделения клеток или продуктов микробного синтеза утилизируются в виде фугата или фильтрата [5, 7].

При этом требуется провести стерилизацию с целью инактивации остаточной микрофлоры. Вполне естественно, что этот процесс сопровождается затратами тепловой энергии, ручного труда и так далее [8].

Более экономное расходование питательной среды возможно при использовании непрерывного культивирования, так называемого хемоста-та, при котором в основной питательной среде добавляется свежий бульон или различные гидролизаты и т.п., что позволяет частично восстановить ростовые свойства [2].

При культивировании микроорганизмов, помимо истощения питательной среды, важную роль играют продукты метаболизма, которые могут оказывать токсическое действие. Регенерация питательной среды предполагает подавление ингибирующих факторов роста микроорганизмов с целью ее неоднократного применения [6].

Возможность повторного использования отработанной питательной среды является весьма актуальной проблемой биотехнологии микробного синтеза, так как позволяет значительно снизить себестоимость продукции [1].

В связи с этим целью нашей работы была оптимизация методов регенерации отработанных питательных сред.

Предметом исследования являются, с одной стороны, подбор питательных сред, которые в дальнейшем необходимо регенерировать, а с другой - подбор методик и оптимизация очистки питательных сред, а также апробация полученных результатов.

Теоретическая и практическая значимость работы заключается:

— в обобщении практики исследования методов регенерации питательных сред, направленной на совершенствование научных рекомендаций, составляющих основу всеобъемлющего изучения данной темы;

— в выработке на основе полученного положительного практического опыта, предложений по совершенствованию и внедрению в практическую деятельность рекомендаций по подбору оптимальных методов регенерации отработанных питательных сред для последующего культивирования микроорганизмов.

Проводилось изучение изменения компонентного состава питательной среды КД-Блаурока в процессе культивирования бифидо-бактерий.

Бифидумбактерии культивировали при 37 °С в пробирках объемом 50 см3 (пробирки заливали на 1/3 объема), в течение 48 ч. Посевная доза составляла 1 % от объема питательной среды. После культивирования биомассу отделяли от полужидкой питательной среды на центрифуге при 10000 об/мин в течение 30 минут. Затем стерилизовали при 110 °С 1,5 атм. 30 минут.

Химический анализ питательной среды КД-Блаурока проводился до культивирования и после него в 5 повторностях. Анализ экспериментальных данных свидетельствует о снижении содержания питательных веществ в среде. В большей степени это касается источников азота: аминного азота снизилось на 13,69%, альбумина на 16,05%, общего азота на 1,04%. В результате проведенного химического анализа основных показателей качества среды КД- Блаурока (количество лактозы, глюкозы, альбумина, аминного и общего азота, цистина) до культивирования би-фидумбактерий и после него свидетельствует о весьма незначительном снижении их процентного содержания (рис. 1)

% 16,05

1369

1 6 ^тш I 1 3.78

1,04

лактоза глюкооза амин. общий альбимин цистин азот азот

Компоненты ПС

Рис. 1. Процентное снижение содержания компонентов питатель-

ной среды КД-Блаурока после культивирования В. ЫИс!ит.

В процессе культивирования бифидумбактерий в питательной среде накапливаются молочная и уксусная кислоты, которые являются не специфическими ингибиторами роста этого микроорганизма. Проводился контроль накопления молочной и уксусной кислот. Установлено, что в процессе жизнедеятельности Bifidobacterium накапливается больше молочной кислоты (65 %), чем уксусной (35 %). Эти продукты метаболизма являются не специфическими ингибиторами. Образование этих кислот приводит к значительному изменению рН. В свя-

16

14 --—

12 -------

10 СЧ1 л:

8 о. со —гН2

6 О _

4 ш со X со ' рН

2 А— л

0 о о ОВП

4 4 8 12 24 36 48

Время культивирования, ч

Рис. 2. Динамика изменения физико-химических параметров пи-

тательной среды КД-Блаурока.

зи с чем, изучалось изменение концентрации ионов водорода и ОВП при культивировании бифидумбактерий в течение 48 ч с интервалом в 4 ч (в течение 12 ч культивирования) и 12 ч (после 12 ч культивирования).

Учитывая то обстоятельство, что изменение рН коррелирует с изменением ОВП, мы отследили динамику этих процессов. Результаты исследований показали, что рН среды понижался от 7,2-7,4 до 4,0-3,5, ОВП от 2,2 до 0,5 тВ. БП и гН, - физико-химические характеристики, показывающие зависимость рН от ОВП.

На рисунке 2 показана графическая зависимость рН, ОВП и гН2 от времени.

Среда

> г

Культивирование V = 250 см3, 37 °С, 48 г, рН 7,2

1 1

Стерилизация 110°С 1,5 атм. 30 минут

> 1

Центрифугирование 30 минут, 10000 об/мин

» 1

Отработанная ПС рН 7,2

> 1 г

Химические способы

№ОН 20%

(7,5 мл)

Физико-химические способы

1\1Н4ОН 5% (15,6 мл)

Реген. ПС рН 7,3 2 х 10э мл. кп./мл

Электроактивация 30 мин ~ 220 В

Реген. ПС рН 7,45 5 х 108 мл. кл./мл

Электродиализ 40 мин ~ 220 В

Реген. ПС

РН 7,2 3 х 109 мл. кл./мл

ионныи

обмен

(1:1)

Реген. ПС рН 7,4 1 х 1010 мл. кл./мл

Реген. ПС рН 7,2 8х 108 мл. кл./м

Рис. 3.

Блок-схема регенерации питательной среды КД-Блаурока.

По полученным данным установлено, что к моменту достижения стационарной фазы в питательной среде независимо от ее первоначального состава остается неиспользованными 85-90% ростовых и энергетических веществ и соединений. Таким образом, питательную среду целесообразно использовать повторно, предварительно регенерировав ее. Для регенерации питательной среды необходимо учесть, что в процессе жизнедеятельности бифидобактерий накапливается уксусная и молочная кислоты, в результате чего происходит понижение значения рН среды от 7,4-7,2 до 4-3,5 Оптимальное значение рН питательной среды для выращивания бифи-думбактерий 7,2-7,4, а для регенерации среды необходимо повысить рН до оптимального.

Для коррекции концентрации ионов Н+ в отработанной питательной среде нами предложено использовать ряд химических и физико-химических методов. Нами был апробирован ряд методов регенерации питательной среды: химических (нейтрализация 5%-ным раствором ТЧН4ОН и 20%-ным раствором ЫаОН) и физико-химических (электроактивация, электродиализ, ионный обмен).

Общая схема проведения эксперимента по регенерации питательной среды представлена на рис. 3.

Для контроля проводили сравнение накопления биомассы до культивирования, после него и регенерированной средах. Одновременно контролировали изменение рН и ОВП.

В результате эксперимента установлено, что накопление клеток в первичной среде составило 3 109 мл.кл./мл, после выращивания на использованной среде оно уменьшилось до 3 106 мл.кл./мл. В результате всех

Табл. 1. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ ПО РЕГЕНЕРАЦИИ

ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ

Питательная среда Реакция среды, рН овп гН2 БП

к 5 X 5 =Г к X га ах Е г 1

Ш М а. О. г

а. с; га Сй 1л и

ш 5 I->5 1Л с; ^ V- о §

Л 1 X Ф Ц О Ф 15 О сз 1— о и о ш ■5

ч с с 3-

До культиви- 7,60 - 4,0 2,21 14,88 817,79 + 3x109

рования

(первичная)

После 4,25 _ 3,5 2,14 8,48 817,86 + 3x106

культивирования

(вторичная)

Регенерированная 4,25 7,4 4,25 2,11 14,97 817,89 + 2x109

(1\1Н40Н) 5%-м

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

раствором

Регенерированная 4,25 7,3 4,2 2,10 14,67 817,9 + 5x108

(№0Н) 20%-м

раствором

Регенериро- 4,25 7,2 4,5 2,18 14,46 817,82 + 2x109

ванная

электроактивацией

Регенериро- 4,25 7,4 4,0 2,17 14,87 817,83 + 1x109

ванная

электродиализом

Регенериро- 4,25 7,2 3,7 2,09 14,47 817,91 + 8x108

ванная

ионным

обменом

видов регенерации наблюдалось значительное увеличение выхода биомассы. Так, при подщелачивании среды 5%-ным раствором 1ЧН4ОН его значение достигло - 2108 мл.кл./мл, 20%-ным ЫаОН - 5 108 мл. кл./мл.

Применение физико-химических методов дало более эффективные результаты. После регенерации питательной среды ионным обменом отмечался рост микробов в количестве 8 108 мл. кл./мл, электродиализа 1 • 109 мл. кл./мл, электроактивации 2-109 мл. кл./мл.

Таким образом, экспериментальные данные подтвердили возможность восстановления ростовых свойств среды КД-Блаурока для культивирования бифидумбактерий. При этом наиболее эффективными являются физико-химические методы с использованием полупроницаемых мембран.

Применение предложенных технологий позволит значительно снизить затраты на приготовление питательной среды, ее утилизацию и является весьма перспективным при промышленном производстве бифидум-бактериина.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Андрусенко С.Ф. Разработка оптимальных методов регенерации отработанных питательных сред для последующего культивирования микроорганизмов // Биоразнообразие, биоресурсы, биотехнологии и здоровье населения Северо-Кавказского региона: материалы lll-й ежегодной научно-практической конференции «Университетская наука - региону». - Ставрополь: Изд-во СКФУ, 2015.-340 с.

2. Аризнов C.B., Глозупов A.B., Капульцвич Ю.Г. Особенности роста этанолусваивающих дрожжей в батарее из двух ферментов // Биотехнология. - № 3. - 1999. - С. 22-25.

3. Бачурина Т.П., Коженков А.И., Хандак RH. Электродиализная обработка творожной сыворотки // Пищевая и биологическая ценность продуктов детского и лечебного питания: сборник научных трудов ВНИМИ. - М.: Агропромиздат, 1985. - С. 65-67.

4. Бегдай И.В., Перцева М.Ю., Дацева Т.А. Биотехнология восстановления первоначальных свойств питательных сред после культивирования микроорганизмов // URL: http://mol-biol.ru/ articles/bitehnologiya-vosstanovleniya-pervonachalnyh-svoystv-pitatelnyh-sred-posle-kultivirovaniya

5. Болога М.К., Котелев В.В., Литинский ГА. и др. Электробиологическая переработка молочной сыворотки. // Экспресс - молочная промышленность. - М.: Arpo НИИТЭИММП. - 1987. -№7. - С. 15-16.

6. Егоров Н.С., Апескин A.B., Самуйлов В.Д. Биотехнология: проблемы и перспективы - М., 1987. - С. 31-36.

7. Сахарова З.В., Работнова И.Л. Микробиология, 1977, Т. 46. -С. 15-21.

8. Тутов И.К., Ситьков В.И. Основы биотехнологии ветеринарных препаратов: учебное пособие для студентов высших учебных заведений по специальности 310800 Ветеринария. - Ставрополь, 1997.-253 с.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.