CC BY
41
■ И I II II
■тп
Новости клеточных технологий
Разработка новых терапевтических подходов к селективной эрадикации опухолевых стволовых клеток глиобластом человека
Концепция опухолевых стволовых клеток (ОСК) подразуме вает существование среди общей массы новообразования небольшой популяции клеток, обладающих фундаментальны ми свойствами «стволовости» - самообновлением и продук цией клоногенных клеток предшественнников с ограниченным потенциалом к делению. ОСК, как правило, составляют не более 1% от общего количества злокачественных клеток и играют исключительную роль в формировании вторичных опухолей у восприимчивых мышей [1, 2]. Высказаны мно гочисленные предположения, что ОСК могут характеризо ваться малой чувствительностью к традиционным методам лечения, что и обуславливает возникновение рецидивов зло качественных новообразований [3, 4].
Глиобластома является одной из наиболее неблагопри ятных первичных опухолей головного мозга с медианой вы живаемости менее 12 месяцев в связи с высокой устойчи востью как к облучению, так и к другим видам терапии [5]. В недавних исследованиях в глиобластомах выявлены ОСК, которые характеризуются высокой степенью экспрессии маркера CD133 [6, 7]. В журналах Nature и Current Biology появился ряд публикаций, которые расширяют наше по нимание сути возможной резистентности глиобластом и открывают новые перспективы в лечении данного вида новообразований. Во всех работах изучались разные аспек ты биологии ОСК.
Исследовательская группа Bao S. et al. исследовала чув ствительность разных популяций клеток глиобластомы к те рапевтическим дозам гамма излучения. Было установлено, что in vitro и in vivo облучение приводит к увеличению CD133^ популяции в остаточной фракции клеток нейробластомы в сравнении с интактными опухолями. Облученные клетки со храняли способность к формированию вторичных новооб разований в иммунодефицитных мышах и, таким образом, терапевтические дозы гамма излучения не оказывают зна чительного влияния на ОСК. Авторы показали, что ОСК ус тойчивы к облучению за счет более эффективной репарации повреждений ДНК. В частности, протеинкиназы ATM, Chk1 и Chk2 фосфорилировались в 4 раза больше у CD 133^ попу ляции клеток. Интересно, что применение ингибитора киназ Chk1 и Chk2 (debromohymenialdisine) значительно снижало резистентность CD133^ субпопуляции клеток к облучению.
Факторы BMP (Bone Morphogenic Protein) играют зна чительную роль в нейрогенезе, и, в частности, индуцируют дифференцировку нейральных стволовых клеток в зрелые астроциты [9]. Piccirillo S. et al. предположили, что BMP мо гут оказывать сходные эффекты на ОСК нейробластомы. Авторы установили, что CD133^ и CD 133 клетки нейробла стомы экспрессируют функциональный рецептор к BMP, особенно ВМР4. Используя условия культуры, которые поддерживают рост недифференцированных клеток глиоб ластомы, было показано, что обработка BMP приводит к зна чительному снижению клеточной пролиферации и индуцирует дифференцировку в клетки, экспрессирующие глиальный мар кёр GFAP и имеющие сходство со зрелыми астроцитами. Трансплантация in vitro обработанных ВМР4 клеток глиобла стомы или CD133^ популяции, приводила к формированию значительно меньших по размеру опухолевых образований без каких либо признаков инвазии. Животные опытной
группы имели большую продолжительность жизни. Кроме того, трансплантация клеток, полученных из новообразова ний опытных мышей, не приводила к формированию вторич ных опухолей. Аналогичные результаты были получены при трансплантации клеток глиобластомы с одновременным введением полиакриловых бусин, насыщенных ВМР4. При морфологическом исследовании опухолей было выявлено преобладание сходных с астроцитами клеток.
Активация сигнального каскада HEDGEHOG GLI1 (НН GLI) (рис.) является необходимым условием для клеточного роста многих типов стволовых клеток (8). Clement V. et al. предположили, что модуляцией НН GLI можно оказать определенные эффекты на ОСК нейробластом. Культи вирование клеток глиобластомы или CD133^ популяции с циклопамином, специфическим ингибитором SMOH, при водило к значительному снижению уровня клеточной проли ферации и клоногенной способности, что соответствовало снижению экспрессии транскрипционных факторов GLI NANOG, SOX2 и 0СТ4. Аналогичные результаты наблюда лись при использовании интерферирующей РНК к транс крипционным факторам GLI. Наоборот, культивирование в присутствии SHH приводило к резкому возрастанию как пролиферативной активности, так и клоногенной способ ности исследуемых клеток. Внутривенное введение циклопа мина иммунодефицитным мышам, которым предварительно трансплантировали клетки глиомасфер, приводило к зна чительному уменьшению размеров опухоли и митотической активности опухолевых клеток. Локальная инъекция цикло памина в место трансплантации предотвращала развитие опухоли. Кроме того, в данном исследовании было показано, что культивирование клеток глиомасфер с темозоломидом (temozolomide), химиотерапевтическим средством выбора при лечении глиобластом, не оказывает существенного вли яния на клоногенную способность ОСК.
Результаты описанных исследований значительно рас ширяют наши представления о биологии ОСК. Получены до казательства, что ОСК глиобластом обладают значительной резистентностью к стандартным методам лечения - облу чению и терапии темозоломидом. В работе Bao S. et al., было показано, что ингибитор протеинкиназ Chk1 и Chk2 может значительно повысить чувствительность ОСК глиобластом к облучению (см. рис.). Таким образом, фармакологическое подавление механизмов резистентности может являться новой стратегией ликвидации ОСК.
Выживание, рост и дифференцировка стволовых клеток нуждается в наличии специфического микроокружения, ко торое является источником необходимых сигнальных факторов и межклеточных взаимодействий. Ряд сигнальных каскадов, например, НН GLI, Wnt, TGFb, Notch, в настоящее время подвергаются всестороннему изучению. Очевидно, что функционирование этих сигнальных каскадов, по крайней мере, частично, необходимо для поддержания и выживания ОСК. Это предположение подтверждается описанными выше исследованиями Clement V. et al. и Piccirillo S., в которых была показана зависимость статуса ОСК глиобластомы от ВМР4 Smad и SHH GLI сигнальных каскадов. В недавно опублико ванных работах были получены сходные данные для ОСК рака молочной и рака поджелудочной желез [10, 11 ]. Таким
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 2, 2007
I I I I I
■ I I I
Новости клеточных технологий
образом, модуляция сигнальных каскадов, которые необхо димы для выживания и клеточного роста ОСК или которые оп ределяют необратимый переход ОСК в «нетуморогенный» статус, по видимому, будет являться одной из наиболее пер спективных стратегий борьбы с этой популяцией клеток.
Описанные исследования подтверждают гипотезу рези стентности опухолей через ОСК. Изучение биологии ОСК
необходимо для разработки новых лечебных подходов к эра дикации опухолей. Комбинация этих стратегий, возможно, приведет к новой эре в терапии онкологических заболева ний, прогресс в лечении которых в настоящее время оста ется незначительным. Безусловно, в ближайшее время стоит ожидать усиления интереса к данной проблеме со стороны биотехнологических и фармакологических компаний.
Эффекты различных воздействий на популяции опухолевых клеток нейробластомы [А] и механизмы их реализации (Б):
TMZ - темозоломид [temozolomide}; DBH - debromohymenialdisine; ВМР4 - bone morphogenetic protein 4; BMPR - bone morphogenetic protein receptor; HH - Hedgehog; Ptc-1 - Patched-1; SMOH - Smoothened; GLI - факторы транскрипции семейства GLI; Smad - факторы транскрипции семейства Smad;
GFAP - glial fibrillary acidic protein; ATM - протеинкиназа Ataxia-Telangiectasia Mutated;
Chk1 - протеинкиназа chekpointkinase 1; Cdc25, Cdc 2 - факторы, регулирующие клеточный цикл; i - инактивированная форма фактора [фермента}
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, hl< 2, 2007
■ И I II II
■тп
Новости клеточных технологий
Традиционные методы лечения нейробластомы, облу чение и терапия темозоломидом, элиминируют опухоле вые клетки предшественники, составляющие основную массу опухоли, и не оказывают значительного влияния на пул ОСК. В основе резистентности ОСК к ионизирующей радиации лежит более выраженная и продолжительная активация реакций репарации. Используя ингибитор ки наз Chk1 и Chk2 (DBH), которые препятствуют вхождению клетки в S фазу до окончания репарации, Bao S. et al. до бились значительного увеличения чувствительности ОСК к у облучению.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Monzania Е., Facchettia F., Galmozzia Е. et al. Melanoma contains CD133 and ABCG2 positive cells with enhanced tumourigenic potential. Eur. J. Cancer. 2007; 43(5): 935 46.
2. Al Hajj М., Wicha М., Benito Hernandez A. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 2003; 100: 3983 8.
3. Clarke М., Dick J., Dirks P. et al. Cancer Stem Cells Perspectives on Current Status and Future Directions: AACR Workshop on Cancer Stem Cells. Cancer Res. 2006; 66: 9339 44.
4. Huffa C., Matsuib W., B. Smith D., Jones R. Strategies to eliminate cancer stem cells: Clinical implications. European Journal of Cancer. 2006; 42: 1293 7.
5. Legler, J., Gloeckler Ries L., Smith M. et al. Brain and other central nervous system cancers: recent trends in incidence and mortality. J. Natl. Cancer Inst. 1999; 91: 1382 90.
Поддержание процессов самообновления и продукции клоногенных опухолевых клеток предшественников нужда ется во внешних факторах, регулирующих эти процессы. Мо дулируя подобные сигналы можно добиться определенных эффектов на популяцию ОСК. Используя ВМР4, индуктор дифференцировки нейральных стволовых клеток в астрогли альном направлении, или циклопамин, ингибитор сигнального каскада PtSHH, являющегося одним из ключевых звеньев контроля самообновления нейральных стволовых клеток, Piccirillo S. et al. и Clemen V. et al. добились значительного сни жения численности популяции ОСК в эксперименте.
6. Singh, S. К. Flawkins С., Clarke I. et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumours. Cancer Res. 2003; 63: 5821 8.
7. Singh S., Hawkins C., Clarke I. et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 2004; 432: 396 401.
8. Palma V., Lim D., Dahmane N. et al. Sonic hedgehog controls stem cell behavior in the postnatal and adult brain. Development. 2005; 132: 335 44.
9. Panchision, D., McKay, R. The control of neural stem cells by morphogenic signals. Curr. Opin. Genet. Dev. 2002; 12:478 87.
10. Feldmann G., Dhara S., Fendrich V. et al. Blockade of Hedgehog Signaling Inhibits Pancreatic Cancer Invasion and Metastases: A New Paradigm for Combination Therapy in Solid Cancers. Cancer Res. 2007; 67: 2187 96.
11. Woodward W., Chen М., Behbod F. et al. WNT/ {beta} catenin mediates radiation resistance of mouse mammary progenitor cells. PNAS. 2007; 104(2): 618 23.
Подготовил B.C. Сергеев
По материалам: 1, Piccirillo S. G, M„ Reynolds B. A„ Zanetti N. et al. Bone morphogenetic proteins inhibit the tumorigenic potential of human brain tumour-initiating cells. Nature, 2006; 444: 761 -5;2. Bao S., Wu Q„ McLendon R.E. et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature, 2006; 444: 756-60; 3. Clement V„ Sanchez P., De Tribolet N„ Radovanovic I. and Altaba A.R. HEDGEH0G-GLI1 Signaling Regulates Human Glioma
Growth, Cancer Stem Cell Self-Renewal, and Tumorigenicity. Current Biology, 2007; 17: 165-72,
Сравнение онкогенетического потенциала культивированных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга мыши и человека при их системном введении
Мультипотентные мезенхимальные стромальные клет ки (ММСК) костного мозга считаются одними из самых пер спективных кандидатов на использование в клинических целях. Однако все чаще стали появляться сообщения о том, что изменения, происходящие с ММСК во время длительно го культивирования, обеспечивающего их экспансию, могут приводить к спонтанной опухолевой трансформации. Такие эксперименты были проведены с ММСК, выделенными из ко стного мозга и жировой ткани мыши и человека [1 3].
В недавней работе, опубликованной в онлайн версии журнала Stem Cells, английские исследователи впервые сравнивают онкогенетический потенциал мышиных и чело веческих ММСК in vivo. В эксперименте проводилось выде ление ММСК из костного мозга мышей 2 х разных линий с последующей сингенной трансплантацией. Образцы чело веческого костного мозга были получены от Stem Cell Technologies (Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada), кро ме того, ММСК человека также были выделены из образцов фетальной крови человека 10 й недели гестации. Все полу ченные культуры были трансформированы лентивирусным
вектором, несущим маркёр (ОРР). Для определения хромо сомных аномалий кариотипировали культуры, достигшие 80% конфлюентности.
При исследовании кариотипа мышиных клеток на 4 и 5 пассажах (на момент трансплантации) были обнаружены множественные хромосомные аберрации, изменения их ко личества. Интересно, что у человеческих ММСК подобных изменений обнаружено не было. На первые сутки после ал логенной пересадки ММСК мыши, на срезах лёгких было обнаруживали 0,45% и 3,2% светящихся (ОРР+) клеток, от общего количества клеток на срезе. Практически все обна руженные клетки находились в просветах легочных капилля ров. Обнаруженные клетки не экспрессировали маркеров легочного эпителия ГЛТ 1 или АЕ1/АЕЗ) и не дифферен цировались под воздействием микроокружения.
На седьмой день после пересадки на срезах легкого уже обнаруживали крупные очаги пролиферации донорских клеток. При этом архитектоника легочного эпителия и нор мальная организация ткани были значительно нарушены пересаженными клетками. На 14 день новообразования
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 2, 2007
