CC BY
2
ОРИГИНАЛЬРЫЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Разработка набора реагентов для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 методом обратной транскрипции полимеразной цепной реакции в реальном времени
Казанцев А.В.1, Алексеев Я.И.2, 3, Чухраля О.В.1, Варламов Д.А.2, Карулина Н.В.1, Сизикова Т.Е.1, Павельев Д.И.1, Петров А.А.1, Маношкин А.В.1, Кузубов А.В.2, Хмуренко С.Н.1, Лебедев В.Н.1, Кутаев Д.А.1, Мельников Д.Г.1, Борисевич С.В.1_
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской Федерации, 141306, г. Сергиев Посад, Российская Федерация
2 ООО «Научно-производственная фирма "Синтол"», 127550, г. Москва, Российская Федерация
3 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт аналитического приборостроения Российской академии наук, 198095, г. Санкт-Петербург, Российская Федерация
При отсутствии средств профилактики и лечения новых и вновь возникающих вирусных инфекций приоритетным направлением борьбы с распространением заболевания становится разработка средств раннего выявления и идентификации возбудителя.
Цель исследования - разработка и апробация набора реагентов для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 на основе обратной транскрипции полимеразной цепной реакции в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ).
Материал и методы. В работе использованы 2 штамма вируса SARS-CoV-2, 1 штамм вируса MERS-CoV, 4 штамма вируса гриппа А, по 1 штамму респираторно-синцитиального вируса, Haemophilus influenza type B, Human respirovirus 1, Rhinovirus и 3 штамма коронавирусов человека hCoV-229E, hCoV-OC43, hCoV-NL63, из которых выделяли препараты нуклеиновых кислот. Нуклеотидные последовательности кДНК геномной РНК вируса SARS-CoV-2 выравнивали с помощью программы Muscle (v.3.6). Выявление видоспе-цифичных отличий осуществляли просмотром выравненных нуклеотидных последовательностей. Компьютерный анализ хроматограмм после секвенирования осуществляли с помощью программы Sequencher (v.4.0.5) "Gene Codes", США. Анализ последовательностей проводили при помощи программы Genome Analysis Toolkit (v.3.6) Проведена статистическая обработка результатов, рассчитывали среднюю величину и стандартное отклонение.
Результаты. В качестве гена, на котором расположен участок гибридизации олигонуклеотидных прай-меров, выбран ген ORF-1ab. Олигонуклеотидные праймеры и зонд, используемые в ПЦР, имеют специфическую область гибридизации - позиции нуклеотидных остатков 5327-5518 в составе генома вируса SARS-CoV-2 в области указанного гена.
Заключение. Преимущества разработанного диагностического набора по сравнению с существующими в России и за рубежом аналогами заключаются в том, что чувствительность метода ОТ-ПЦР-РВ при использовании разработанного набора составляет 1x103 ГЭ/см3, и это позволяет минимизировать риск получения ложноотрицательных результатов при проведении исследования клинических проб от людей с подозрением на COVID-19.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Вклад авторов. Участие в сборе и обработке экспериментального материала - все авторы; разработка концепции проводимого исследования - Казанцев А.В., Борисевич С.В.; подготовка текста статьи и проведение статистической обработки полученных экспериментальных данных - Карулина Н.В.; редактирование текста статьи - Борисевич С.В.
Ключевые слова:
обратная транскрипция; полимеразная цепная реакция в реальном времени; набор реагентов; праймеры; зонд; чувствительность метода;
специфичность метода; воспроизводимость метода; коронавирусы; вирус SARS-CoV-2; COVID-19
Для цитирования: Казанцев А.В., Алексеев Я.И., Чухраля О.В., Варламов Д.А., Карулина Н.В., Сизикова Т.Е., Павельев Д.И., Петров А.А., Маношкин А.В., Кузубов А.В., Хмуренко С.Н., Лебедев В.Н., Кутаев Д.А., Мельников Д.Г., Борисевич С.В. Разработка набора реагентов для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 методом обратной транскрипции полимеразной цепной реакции в реальном времени // Инфекционные болезни: новости, мнения, обучение. 2023. Т. 12, № 4. С. 25-32. DOI: https://doi. org/10.33029/2305-3496-2023-12-4-25-32
Статья поступила в редакцию 25.04.2023. Принята в печать 09.10.2023.
Development of a reagent kit for the detection of SARS-CoV-2 virus RNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction
KazantsevA.V.1, Alekseev Ya.I.23, Chukhralya O.V.1, Varlamov D.A.2, Karulina N.V.1, Sizikova T.E.1, Paveliev D.I.1, Petrov A.A.1, Manoshkin A.V.1, Kuzubov A.V.2, Khmurenko S.N.1, Lebedev V.N.1, Kutaev D.A.1, Melnikov D.G.1, Borisevich S.V.1
1 48 Central Scientific Research Institute, Ministry of the Defense of the Russian Federation, 141306, Sergiev Posad, Russian Federation
2 LLC "Research and development company "Syntol", 127550, Moscow, Russian Federation
3 Institute for Analytical Instrumentation, Russian Academy of Sciences, 198095, St. Petersburg, Russian Federation
When Lack of therapeutics for special prophylactic and current of new and existing viral infection the means development for early reveal and identification of agent has the priority significance.
The aim of the work is to develop and test a set of reagents for detecting severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) ribonucleic acid (RNA) based on reverse transcription-polymerase chain reaction in real-time.
Material and methods. The study used 2 strains of SARS-CoV-2 virus, 1 strain of middle east respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV), 4 strains of influenza A virus, 1 strain of respiratory syncytial virus, Haemophilus influenza type B, Human respirovirus 1, Rhinovirus and 3 strains of human coronaviruses (HCoV-229E, HCoV-OC43, HCoV-NL63), from which isolated preparations of nucleic acids. The complementary deoxyribonucleic acid (cDNA) nucleotide sequences of the SARS-CoV-2 virus genomic RNA were aligned using the Muscle program (v.3.6). Identification of species-specific differences was carried out by viewing aligned nucleotide sequences. Computer analysis of chromatograms after sequencing was carried out using the Sequencher program (v.4.0.5) "Gene Codes", USA. Sequence analysis was performed using the Genome Analysis Toolkit (v.3.6) Statistical processing of the results was carried out, the average value and standard deviation were calculated.
Results. When designing a set of reagents, most important element is selecting specific components, to which for the real-time RT-PCR the oligonucleotids primers and probes. As the gene, where the hybridization site is located, the open reading frames lab (OFR lab) gene is selected. Oligonucleotids primers and probe, used in PCR have the specific hybridization area - positions of nucleotides residues 5327-5518 in the genome of SARS-CoV-2 virus in the region of the specified gene.
Conclusion. Advantages of the tactical and technical characteristics of the developed set compared to analogues in Russia and abroad consist of the sensitivity of real time RT-PCR method by using of developed kit is 1x103 genome-equivalents per 1 sm3, that permits minimizes the risks of false negative results in the study of clinical samples from individuals with suspected COVID-19.
Funding. The study had no sponsor support.
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Contribution. All authors took placed in collection and analyze of experimental data; elaborate the conception of conducted research - Kazantsev A.V., Borisevich S.V.; writing of text of article and carring out of statistical calculation of experimental data -Karulina N.V.; editing of text of article - Borisevich S.V.
For citation: Kazantsev A.V., Alekseev Ya.I., Chukhralya O.V., Varlamov D.A., Karulina N.V., Sizikova T.E., Paveliev D.I., Petrov A.A., Manoshkin A.V., Kuzubov A.V., Khmurenko S.N., Lebedev V.N., Kutaev D.A., Melnikov D.G., Borisevich S.V. Development of a reagent kit for the detection of SARS-CoV-2 virus RNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction. Infektsionnye bolezni: novosti, mneniya, obuchenie [Infectious Diseases: News, Opinions, Training]. 2023; 12 (4): 25-32. DOI: https://doi. org/10.33029/2305-3496-2023-12-4-25-32 (in Russian) Received 25.04.2023. Accepted 09.10.2023.
Keywords:
reverse
transcription;
real-time
polymerase
chain reaction;
set of reagents;
primers;
and probes;
sensitivity
of method; specify
of method;
reproduction
of method;
coronaviruses;
SARS-CoV-2 virus;
COVID-19
В 2019 г. в Китайской Народной Республике (КНР) выявлено новое коронавирусное заболевание, вызываемое вирусом SARS-CоV-2, которое впоследствии получило название COVID-19. 31 декабря 2019 г. власти КНР передали информацию о вспышке во Всемирную организацию здравоохранения (ВОЗ), а 11 марта 2020 г. ВОЗ объявила пандемию
COVID-19, которая затронула более 200 стран. На протяжении нескольких лет COVID-19 представляет глобальную угрозу не только для здравоохранения, но и для экономических отношений, политической и культурной жизни человечества [1-4].
На первом этапе пандемии COVID-19 приоритетным направлением была разработка средств выявления и иден-
тификации возбудителя. Ведущее значение при создании диагностических тест-систем занимают методы молекулярной биологии и молекулярной генетики.
Цель исследования - разработка и апробация набора реагентов для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 на основе обратной транскрипции полимеразной цепной реакции в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ).
Материал и методы
В работе использованы следующие штаммы: вирус SARS-CoV-2 (изолят В и hCov-19/Russia/Gam-0micron/2021); вирус SARS-CoV (штамм СоД); вирус MERS-CoV (штамм VVI); вирус гриппа А (H1N1) - штамм А/Киров/Россия/2011; вирус гриппа А (H2N2) - штамм К-46; вирус гриппа А (H3N2) -штамм A/Hong Kong/4801/14; вирус гриппа А (H5N1) -штамм Курган; респираторно-синцитиальный вирус (штамм Long); Haemophilus influenza type B (штамм АТСС 49247); Human respirovirus 1 (штамм С-39); Rhinovirus (штамм Рино/13/Ленинград/79), а также коронавирусы hCoV-229E, hCoV-0C43, hCoV-NL63.
Препараты нуклеиновых кислот вируса SARS-CoV-2 и других микроорганизмов выделяли из культур музейных штаммов, полученных из коллекции микроорганизмов I-II групп патогенности ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России (Сергиев Посад, Россия).
Исследования с H. influenza type B (штамм АТСС 49247), Human respirovirus1 (штамм С-39) и Rhinovirus (штамм Рино/13/Ленинград/79) проведены на лабораторной базе ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России.
Культуру E. coli, штамм JM-109, культивировали на среде LB, pH 7,5, содержащей бактопептон, бактодрожжевой экстракт, хлорид натрия, с добавлением 25 мг/мл ампициллина, при температуре от 37 до 37,5 °С.
Постоянные культуры клеток Vero B, Vero E6, Vero C1008 и GMK-AH-1D получали из отдела клеточных культур и гибри-домных технологий ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России.
В исследованиях использовали плазмиду pGMT (Promega, США). Проводили прямое клонирование ПЦР-продукта, при этом получили рекомбинантную плазмиду. Клонированные участки изучали путем секвенирования по Сенгеру. Синтетическую РНК с гомологичной последовательностью геному вируса SARS-CoV-2 получали с помощью данной плазмиды и Т7 РНК-полимеразы (Fermentas, Литва). Маркерным признаком исходного вектора является устойчивость к ампициллину. По данным рестриктного анализа подтверждено наличие сайтов, узнаваемых рестриктазами ApaI, AatII, SphI, BstZI (2 сайта рестрикции), NcoI, SacII, SpeI, NotI, BszI, PstI, SalI, NdeI, SacI, BstXI, NsiI. Размер векторной части составляет 3000 п.о.
Структурные элементы векторной части: промотор фага Т7, orifl, сайт полиаделирования вируса SV40, промотор SV40, кодирующая область pD-галактозидазы, позволяющая проводить «цветной» скрининг клонов, множественный сайт клонирования.
Синтетические одноцепочечные ДНК-матрицы были синтезированы твердофазным химическим синтезом. В дальнейшем, используя данные матрицы и Т7 РНК-полимеразу
(Fermentas, Литва), получали гомологичную синтетическую РНК. Исходные препараты синтетической РНК делили на аликвоты и хранили при температуре не выше -70 °С, а рабочие разведения - от -20 до -18 °С.
Высокоочищенные препараты плазмидных ДНК получали с использованием модифицированной специалистами ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России методики, разработанной в лаборатории Cold Spring Harbor [5].
Вируссодержащие материалы подготавливали в условиях второй санитарной зоны. Для анализа использовали пробы в жидком виде. Пробы с органной структурой предварительно гомогенизировали, готовили суспензии на растворе Хенкса с 2% содержанием фетальной телячьей сыворотки, с добавлением антибиотиков.
Экстракцию нуклеиновых кислот осуществляли с помощью набора реагентов «М-Сорб-ООМ» («Синтол», Россия), согласно протоколу, входящему в инструкцию к данному набору. После окончания экстракции пробирки с элюатом, содержащим нуклеиновые кислоты (НК), обрабатывали перекисью водорода и передавали через шлюз в первую санитарную зону. Полученные препараты РНК хранили при температуре не выше -70 °С, рабочие аликвоты хранили при температуре от -20 до -18 °С.
Нуклеотидные последовательности кДНК геномной РНК вируса SARS-CoV-2 выравнивали с помощью программы Muscle (v.3.6) [6]. Видоспецифичные отличия выявляли просмотром выравненных нуклеотидных последовательностей.
Компьютерный анализ хроматограмм после секвенирования осуществляли с помощью программы Sequencher (v.4.0.5) Gene Codes, США [7].
Анализировали последовательности при помощи программы Genome Analysis Toolkit (v.3.6) [8], выравнивание последовательностей - при помощи программы Ugene (v.1.24.1) [9]. Статистическую обработку результатов исследований проводили в соответствии с учебными пособиями [10, 11]. Рассчитывали среднюю величину и стандартное отклонение.
Результаты и обсуждение
Использование полимеразной цепной реакции для выявления возбудителя COVID-19
ПЦР - универсальный, чувствительный и быстрый метод выявления возбудителя любого инфекционного заболевания. Первым необходимым шагом при конструировании набора реагентов для обнаружения геномной РНК возбудителя с помощью ПЦР является выбор конкретной модификации метода. Среди многочисленных вариантов методов, основанных на амплификации геномной РНК, в последнее время приоритетное место занимает ОТ-ПЦР-РВ. Данный метод включает одновременно детекцию и количественное определение (измерение непосредственно количества копий либо измерение копий относительно внесенной ДНК или дополнительных калибровочных генов) специфической последовательности ДНК в образце. Его принципиальными особенностями являются мониторинг и количественный анализ накопления продуктов ПЦР, автоматическая реги-
Таблица 1. Олигонуклеотидные праймеры и зонд, используемые в наборе реагентов для выявления РНК вируса SARS-CoV-2
I Компонент I Первичная структура (5'- 3') 1
Прямой праймер SARS-CoV-2 _up TTGAAGTTTMTCCACCTGCT
Обратный праймер SARS- CoV-2 _low |j ACCGTTCAAGACTCTTTTGC
Меченный флюоресцентным красителем олигонуклеотидный зонд (R6G>CTTATTACAGAGCMGGGCTGGTGMG-(BHQ2)
страция и интерпретация полученных результатов, что определяет его востребованность при проведении диагностических исследований.
При конструировании набора реагентов важнейшим элементом является выбор специфических компонентов, к которым для метода ПЦР-РВ относятся олигонуклеотидные праймеры и зонды, а также положительный контрольный образец.
При подборе олигонуклеотидных праймеров необходимо определение участка их гибридизации на комплементарной ДНК (кДНК) геномной РНК.
Геном вируса SARS-CoV-2 представлен одноцепочечной «плюс» РНК, кодирующей 10 открытых рамок считывания (ORF). Размер генома составляет 29 903 нуклеотидных остатков (н.о). Структура генома сходна с таковой для других коронавирусов: 5'-нетранслируемый регион (№ позиций генома 1-265), гены репликазного комплекса (открытые рамки считывания ORF-1ab, № позиций генома 266-21555), ген S (21563-25384), ген ORF-3A (25393-26220), ген Е (26245-26472), ген М (26523-27191), ген ORF-6 (2720227387), ген ORF-7 (27394-27759), ген ORF-8 (27894-28259), ген N (28274-29533), ген ORF-IO (29556-29674), 3'-нетранс-лируемый регион (29675-29903) [12].
Обоснование структуры специфических компонентов набора реагентов для выявления РНК вируса SARS-CoV-2
В соответствии с данными предыдущих разработок при создании наборов реагентов для выявления РНК родственных с SARS-CoV-2 вирусов SARS-CoV и MERS-CoV в качестве гена, на котором расположен участок гибридизации олигонуклеотидных праймеров, выбран ген ORF-1ab. Олигонуклеотидные праймеры и олигонуклеотидный зонд, используемые в ПЦР, имеют специфическую область гибридизации -позиции нуклеотидных остатков (н.о.) 5327-5518 в составе генома вируса SARS-CoV-2 в области указанного гена.
При выборе структуры олигонуклеотидных праймеров придерживались общепринятых критериев (размер прай-мера должен быть 16-25 нуклеотидов, содержание С+G 45-55%, последние несколько нуклеотидов 3'-конца прай-мера должны содержать СG-нуклеотидные остатки, праймеры не должны быть само- и взаимокомплементарны, отсутствие комплементарности между 3'-концами прямого и обратного праймеров, область отжига праймеров должна находиться вне зон мутаций, делеций или инсерций в пределах видовой либо иной, взятой в качестве критерия при выборе праймеров специфичности). Структура олигонуклеотидных праймеров и зонда, используемых в наборе реагентов для выявления РНК вируса SARS-CoV-2, представлена в табл. 1.
Выравнивание представленных олигонуклеотидных последовательностей на соответствующие последователь-
ности других известных коронавирусов, в том числе SARS-^ и МЕRS-CoV, показало очень малую вероятность гибридизации и в соответствии с этим невозможность амплификации гетерологичных коронавирусов (табл. 2).
Представленные в табл. 2 данные свидетельствуют о том, что в связи со значительным количеством нуклеотидных замен амплификация гетерологичных коронавирусов с помощью разработанных праймеров и зонда невозможна.
Следовательно, использование при постановке ОТ-ПЦР-РВ разработанных олигонуклеотидных праймеров и зонда позволяет минимизировать риски получения ложнопо-ложительных результатов при проведении диагностики ШШ-19.
Олигонуклеотидные праймеры и зонд были синтезированы путем твердофазного химического синтеза с последующей очисткой методами электрофореза в поли-акриламидном геле и высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Оценка чувствительности и специфичности обратной транскрипции полимеразной цепной реакции в реальном времени при использовании разработанного набора реагентов
Важной характеристикой диагностической тест-системы является показатель чувствительности. Поскольку у ряда инфицированных (особенно вирусом SARS-CoV-2, относящимся к менее вирулентной линии S) заболевание протекает без выраженных симптомов, но при этом осуществляется трансмиссия возбудителя, повышение чувствительности используемого метода приводит к снижению вероятности получения ложноотрицательных результатов [13].
В силу одной из особенностей COVID-19 [относительно низкая концентрация возбудителя в исследуемых клинических пробах, в ротоглоточных смывах - примерно 1х105 геномных эквивалентов (ГЭ)/мл] при сравнительной оценке различных амплификационных наборов реагентов показатель чувствительности метода при использовании конкретного набора реагентов имеет определяющее значение.
Чувствительность, специфичность, воспроизводимость метода ОТ-ПЦР-РВ при использовании разработанных специфических компонентов набора реагентов определяли с помощью культуры вируса SARS-CoV-2 из государственной коллекции вирусов ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России.
Определение аналитической чувствительности биологическим (вирусологическим) методом проводили следующим образом. Путем разведений (выполненных двукратным шагом) культуры вируса готовили пробы, содержащие различные количества ГЭ. Полученные препараты подвергали анализу с помощью ОТ-ПЦР-РВ при использовании разработанных олигонуклеотидных праймеров и зонда.
Таблица 2. Результаты теоретической оценки специфичности разработанных праймеров и флюоресцентного зонда для SARS-CoV-2 в отношении гетерологичных коронавирусов
Количество нуклеотидных замен
при гибридизации олигонуклеотида на геном
Вирус гетерологичного коронавируса Заключение
SARS-CoV- SARS-CoV- SARS-CoV-
2c_up 2c low 2c R6G
SARS-CoV 11 10 12 Амплификация невозможна
MERS-CoV 10 11 14 Амплификация невозможна
Bovine coronavirus Mebus 10 10 15 Амплификация невозможна
Equine coronavirus NC99 10 11 15 Амплификация невозможна
Human coronavirus OC43 9 9 13 Амплификация невозможна
Human coronavirus NL63 11 10 14 Амплификация невозможна
Human coronavirus 229Е 11 11 12 Амплификация невозможна
Hedgehog coronavirus 8 9 10 Амплификация невозможна
Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus 10 11 15 Амплификация невозможна
Human coronavirus HKU1 10 10 13 Амплификация невозможна
Murine hepatitis virus 10 11 14 Амплификация невозможна
Rat coronavirus 10 12 15 Амплификация невозможна
Pipistrellus bat coronavirus HKU5 7 11 11 Амплификация невозможна
Rousettus bat coronavirus HKU9 10 11 14 Амплификация невозможна
Tylonycteris bat coronavirus HKU4 7 9 10 Амплификация невозможна
SARS-related bat coronavirus HKU3 11 10 13 Амплификация невозможна
Результаты анализа, представленные в табл. 3, свидетельствуют о том, что при использовании разработанных олиго-нуклеотидных праймеров и зонда ОТ-ПЦР-РВ позволяет специфично выявлять РНК вируса БАКБ-Сс^-2 в препаратах с концентрацией не менее 1,0х103 ГЭ/см3. Суммарное количество положительных определений для концентрации 1,0х103 ГЭ/см3 составляет 20 из 20, что соответствует воспроизводимости не менее 95% [10]. Следовательно, аналитическая чувствительность метода ОТ-ПЦР-РВ при использовании разработанного набора реагентов составляет 1,0х103 ГЭ/см3 с воспроизводимостью не менее 95%.
Установлено сохранение высокой чувствительности метода при использовании разработанного набора реагентов при анализе различных вариантов вируса SARS-CoV-2, в том числе варианта дельта (В.1.Б.17).
Для экспериментального исследования аналитической специфичности набора реагентов использовали препараты НК, полученные из вирусов, представляющих различные таксономические группы - возбудители острых респираторных заболеваний: коронавирусы SARS-CoV, MERS-1п^-0С43, hCoV-229Е, вирусы гриппа А (антигенные подтипы Н1И1, Н2№, Н5М1). Критерием специфичности служило наличие флюоресцентного сигнала по каналу R6G при анализе препаратов РНК вируса SARS-CoV-2 и отсутствие сигнала по данному каналу при анализе гетерологичных РНК и ДНК. Анализ проводили в трех повторностях с использованием критерия «единственного различия» - аналит обна-ружен/аналит не обнаружен.
Критерий, согласно которому набор реагентов считали выдержавшим испытания на аналитическую специфичность: истинно положительный результат в отношении РНК вируса SARS-CoV-2 при истинно отрицательном результате в отношении всех остальных аналитов.
Данные экспериментального исследования, представленные в табл. 4, свидетельствуют о том, что испытываемый набор реагентов обладает специфичностью в отношении вируса SARS-CoV-2. Штаммы гетерологичных микроорганизмов, в том числе возбудителей опасных коронавирусных инфекций SARS и MERS, не выявляются.
В ходе проведения исследований показана возможность использования специфичных компонентов набора реагентов в лиофильно-высушенном состоянии, что делает необязательным соблюдение «холодовой цепи» при транспортировке набора реагентов.
Исследования образцов клинического материала при использовании разработанного набора реагентов
Поскольку ПЦР-анализ клинического образца включает 3 основных этапа: пробоподготовку, амплификацию
Таблица 3. Результаты исследования аналитической чувствительности метода обратной транскрипции полимераз-ной цепной реакции в реальном времени при использовании разработанного набора реагентов
Расчетная Количество положительных определений,
концентрация, полученных при анализе препарата
ГЭ/см3 SARS-CoV-2, п=20 (Ж±а)
1,6х104 20 (100-5)
8,0х103 20 (100-5)
4,0х103 20 (100-5)
2,0х103 20 (100-5)
1,0х103 20 (100-5)
5,0х102 16 (80±8)
2,5х102 12 (60±11)
1,25х102 0 (0+5)
Примечание. Значение X±a определяли по В.С. Генес [10]; расшифровка аббревиатур дана в тексте.
Таблица 4. Результаты исследования аналитической специфичности метода обратной транскрипции полимеразной цепной реакции в реальном времени при использовании разработанного набора реагентов
Возбудитель
Расчетная концентрация, ГЭ/мл1 Результат ОТ-ПЦР-РВ
SARS-CoV-2
1,0х103
Положительный
MERS-CoV
1,0х106
Отрицательный
SARS-CoV
То же
То же
Гриппа А (H1N1)
Гриппа А (H2N2)
Гриппа А (H3N2)
Гриппа А (H5N1)
Респираторно-синцитиальный вирус
Сезонные коронавирусы человека hCoV-229E, hCoV-OC43, hCoV-NL63
Haemophilus influenzae type B
Human respirovirus 1
Rhinovirus
Здесь и в табл. 5: расшифровка аббревиатур дана в тексте.
и регистрацию результатов, разработанный набор реагентов содержит все компоненты (специфические и неспецифические), необходимые для обеспечения перечисленных выше этапов исследования.
Результаты исследования образцов клинического материала, не контаминированных и контаминированных вирусом SARS-CoV-2, при использовании ОТ-ПЦР-РВ с разработанным набором реагентов представлены в табл. 5.
Таблица 5. Данные тестирования методом обратной транскрипции полимеразной цепной реакции в реальном времени образцов клинического материала, не контаминированных и контаминированных вирусом SARS-CoV-2
Тип образцов Всего исследовано образцов Результаты исследования набора реагентов для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 методом ОТ-ПЦР-РВ
положительных отрицательных
Пробы, контаминированные вирусом SARS-CoV-2
Мазки из носа, носоглотки и ротоглотки 20 20 0
Бронхоальвеолярный лаваж/промывные воды бронхов 20 20 0
Аспираты эндотрахеальные и назофарингеальные 20 20 0
Мокрота 20 20 0
Аутопсийный материал 20 20 0
Цельная кровь 20 20 0
Сыворотка крови 20 20 0
Моча 20 20 0
Пробы, не контаминированные вирусом SARS-CoV-2
Мазки из носа, носоглотки и ротоглотки пациентов с иной этиологией заболевания (грипп А и В, парагрипп, аденовирусная и коронавирусная инфекция человека, вызванная ИСоу NL63, ИСоу ОС43, ИСоу 229Е, ИСоу НКи1) 12 0 12
Мазки из носа, носоглотки и ротоглотки пациентов с иной этиологией заболевания (грипп А и В, парагрипп, аденовирусная и коронавирусная инфекция человека, вызванная ИСоу NL63, ИСоу ОС43, ИСоу 229Е, ИСоу НКи1) 12 0 12
Бронхоальвеолярный лаваж/промывные воды бронхов пациентов с иной этиологией заболевания (грипп, метапневмовирусная инфекция) 12 0 12
Аспираты эндотрахеальные и назофарингеальные пациентов с иной этиологией заболевания (грипп, пневмококковая, гемофильная инфекция, легионеллез) 12 0 12
Мокрота пациентов с иной этиологией заболевания (грипп, пневмококковая инфекция, гемофильная инфекция) 12 0 12
Аутопсийный материал пациентов с иной этиологией заболевания (грипп) 12 0 12
Цельная кровь больных с аденовирусной и риновирусной инфекцией 12 0 12
Сыворотка крови больных гриппом В, метавирусной и аденовирусной инфекцией 12 0 12
Моча пациентов с острой респираторно- синцитиальной, метапневмовирус-ной инфекцией и гриппом А (Н^1) 16 0 16
Заключение
В результате проведенных исследований разработан и апробирован набор реагентов для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 методом ОТ-ПЦР-РВ. Преимущество характеристик разработанного набора по сравнению с существующими в России и за рубежом аналогами состоит в том, что чувствительность метода ОТ-ПЦР-РВ при использовании разработанного набора составляет 1х103 ГЭ/см3, что позволяет миними-
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
зировать риск получения ложноотрицательных результатов при проведении исследования клинических проб от людей с подозрением на C0VID-19. Получено регистрационное удостоверение № РЗН 2020/9969 от 03.04.2020 на медицинское изделие «Набор реагентов для выявления РНК вируса SARS-CoV-2, возбудителя нового коронавирусного заболевания C0VID-19, методом ОТ-ПЦР-РВ». Новизна достигнутых результатов подтверждена патентом РФ на изобретение [13].
Казанцев Алексей Васильевич (Alexey V. Kazantsev) - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России, Сергиев Посад, Российская Федерация E-mail: 48cnii@mil.ru https://orcid.org/0000-0003-3072-9110
Алексеев Яков Игоревич (Yakov I. Alekseev) - кандидат биологических наук, научный директор ООО «Научно-производственная фирма "Синтол"», Москва; ведущий научный сотрудник ИАП РАН, Санкт-Петербург, Российская Федерация E-mail: jalex@syntol.ru https://orcid.org/0000-0002-1696-7684
Чухраля Олег Васильевич (Oleg V. Chuhralya) - заместитель начальника отдела ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России, Сергиев Посад, Российская Федерация E-mail: 48cnii@mil.ru https://orcid.org/0000-0002-2603-0860
Варламов Дмитрий Александрович (Dmitry A. Varlamov) - ведущий научный сотрудник ООО «Научно-производственная
фирма "Синтол"», Москва, Российская Федерация
https://orcid.org/0000-0001-7004-98lX
Карулина Наталья Васильевна (Natalya V. Karulina) - кандидат биологических наук, научный сотрудник ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России, Сергиев Посад, Российская Федерация E-mail: 48cnii@mil.ru https://orcid.org/0000-0001-7781-5249
Сизикова Татьяна Евгеньевна (Tatyana E. Sizikova) - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России, Сергиев Посад, Российская Федерация E-mail: 48cnii@mil.ru https://orcid.org/0000-0002-1817-0126
Павельев Дмитрий Игоревич (Dmitry I. Paveliev) - заместитель начальника отдела ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России, Сергиев Посад, Российская Федерация E-mail: 48cnii@mil.ru https://orcid.org/0000-0003-3204-1897
Петров Александр Анатольевич (Alexander A. Petrov) - доктор медицинских наук, начальник отдела ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России, Сергиев Посад, Российская Федерация E-mail: 48cnii@mil.ru https://orcid.org/0000-0002-9714-2085
Маношкин Александр Владимирович (Alexander V. Manoshkin) - кандидат биологических наук, начальник отдела ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России, Сергиев Посад, Российская Федерация E-mail: 48cnii@mil.ru https://orcid.org/0000-0002-6766-1917
Кузубов Алексей Владимирович (Aleksey V. Kuzubov) - генеральный директор ООО «Научно-производственная фирма "Синтол"», Москва, Российская Федерация
Хмуренко Степан Никитович (Stepan N. Khmurenko) - младший научный сотрудник ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России, Сергиев Посад, Российская Федерация E-mail: 48cnii@mil.ru https://orcid.org/0000-0002-2606-5705
Лебедев Виталий Николаевич (Vitaliy N. Lebedev) - доктор биологических наук, профессор, ведущий научный сотрудник ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России, Сергиев Посад, Российская Федерация E-mail: 48cnii@mil.ru https://orcid.org/0000-0002-6552-4599
Кутаев Дмитрий Анатольевич (Dmitry A. Kutaev) - кандидат биологических наук, заместитель начальника ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России по научно-исследовательской работе, Сергиев Посад, Российская Федерация E-mail: 48cnii@mil.ru
Мельников Денис Геннадьевич (Denis G. Melnikov) - кандидат биологических наук, начальник отдела ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России, Сергиев Посад, Российская Федерация E-mail: 48cnii@mil.ru
Борисевич Сергей Владимирович (Sergey V. Borisevich)* - академик РАН, доктор биологических наук, профессор, начальник ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России, Сергиев Посад, Российская Федерация E-mail: 48cnii@mil.ru https://orcid.org/0000-0002-6742-3919
ЛИТЕРАТУРА
1. Li Q., Guan X., Wu P., Wang X., Zhou L. et al Early transmission dynamics in Wuhan, China, of novel coronavirus-infected pneumonia // N. Engl. J. Med. 2020. Vol. 382, N 13. P. 1199-1207. DOI: https://doi.org/10.1056/NEJMoa2001316 PMID 31995857.
2. Hu D.S., Azhar E.I., Madani T.A. et al. The continuing C0VID-2019 epidemic threat of novel coronaviruses in global health. The latest 2019 novel coronavirus outbreak in Wuhan China // Int. J. Infect. Dis. 2020. Vol. 91. P. 264-266.
3. Riou J., Althaus C.L. Pattern of early human-to-human transmission of Wuhan 2019 novel coronavirus (2019-nCoV), December 2019 to January 2020 // Eurosurveillance. 2020. Vol. 25, N 4. DOI: https://doi.org/10.2807/1560-7917. ES.2020.25.4.2000058
4. Wu J.T., Leung K., Bushman M., Kishore N. et al. Estimating clinical severity of COVID-19 from the transmission dynamics in Wuhan, China // Nat. Med. 2020. Vol. 26, N 4. P. 506-510. DOI: https://doi.org/10.1038/s41591-020-0822-7
5. Molecular Cloning (A Laboratory Manual) / eds J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
6. Edgar R.C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput // Nucleic Acids Res. 2004. Vol. 32. P. 1792-1797.
7. Tamura K., Dudley J., Nei M., Kumar S. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0 // Mol. Biol. Evol. 2007. Vol. 24. P. 1596-1599.
8. McKenna A., Hanna M., Banks E. et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data // Genome Res. 2010. Vol. 20. P. 1297-1303.
9. Okonechnikov K., Golosova O., Fursov M. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit // Bioinformatics. 2012. Vol. 28. P. 1166-1167.
10. Генес В.С. Некоторые простые методы кибернетической обработки данных диагностических и физиологических исследований. Москва, 1967. 208 с.
11. Лакин Г.Ф. Биометрия. Москва : Высшая школа, 1990. 332 с.
12. Wu F., Zhao S., Yu B. Wuhan seafood market pneumonia virus isolate Wuhan-Hu-1, complete genome: GenBank MN908947.3. Bethesda, MD, 2020. 12 January.
13. Патент РФ № 2732608 с приоритетом от 09.04.2020 г. «Набор реагентов для выявления РНК вируса SARS-CoV-2, возбудителя нового коронавирусного заболевания COVID-19, методом обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции в реальном времени». Авторы Алексеев Я.И., Борисевич С.В., Варламов Д.А., Казанцев А.В., Карулина Н.В., Кириллов И.А. и др.
REFERENCES
1. Li Q., Guan X., Wu P., Wang X., Zhou L., et al Early transmission dynamics in Wuhan, China, of novel coronavirus-infected pneumonia. N Engl J Med. 2020; 382 (13): 1199-207. DOI: https://doi.org/10.1056/NEJMoa2001316 PMID 31995857.
2. Hu D.S., Azhar E.I., Madani T.A., et al. The continuing COVID-2019 epidemic threat of novel coronaviruses in global health. The latest 2019 novel coronavirus outbreak in Wuhan China. Int J Infect Dis. 2020; 91: 264-6.
3. Riou J., Althaus C.L. Pattern of early human-to-human transmission of Wuhan 2019 novel coronavirus (2019-nCoV), December 2019 to January 2020. Eurosurveillance. 2020; 25 (4). DOI: https://doi.org/10.2807/1560-7917. ES.2020.25.4.2000058
4. Wu J.T., Leung K., Bushman M., Kishore N., et al. Estimating clinical severity of COVID-19 from the transmission dynamics in Wuhan, China. Nat Med. 2020; 26 (4): 506-10. DOI: https://doi.org/10.1038/s41591-020-0822-7
5. Molecular Cloning (A Laboratory Manual). In: J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis (eds). Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
6. Edgar R.C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 2004; 32: 1792-7.
7. Tamura K., Dudley J., Nei M., Kumar S. MEG A4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Mol Biol Evol. 2007; 24: 1596-9.
8. McKenna A., Hanna M., Banks E., et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res. 2010; 20: 1297-303.
9. Okonechnikov K., Golosova O., Fursov M. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit. Bioinformatics. 2012; 28: 1166-7.
10. Genes V.S. Some simple methods of cybernetic data processing of diagnostic and physiological studies. Moscow, 1967: 208 p. (in Russian)
11. Lakin G.F. Biometrics. Moscow: Visshaya Shkola, 1990: 332 p. (in Russian)
12. Wu F., Zhao S., Yu B. Wuhan seafood market pneumonia virus isolate Wuhan-Hu-1, complete genome: GenBank MN908947.3. Bethesda, MD, 2020. 12 January.
13. RF Patent No. 2732608 with priority from 09.04.2020 r. «Reagent set for detecting RNA of sars-cov-2 virus, causative agent of new coronavirus disease C0VID-2019, by reverse transcription-polymerase chain reaction in real time». Authors Alekseev Ya.I., Borisevich S.V., Varlamov D.A., Kazantsev A.V., Karulina N.V., Kirillov I.A., et al. (in Russian)
* Автор для корреспонденции.
