Разработка набора ДНК-маркеров, ассоциированных с устойчивостью к болезням листового аппарата сахарной свёклы Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

ТЕХНОЛОГИЯ ВЫСОКИХ УРОЖАЕВ

УДК 633.63:631.527.8:577.21 doi.org/10.24412/2413-5518-2024-5-30-36

ВМА

Разработка набора ДНК-маркеров, ассоциированных с устойчивостью к болезням

листового аппарата сахарной свеклы

S

С.В. МАЙСЕНЯ, зав. отделом селекции сахарной свёклы (e-mail: [email protected]) Республиканское дочернее унитарное предприятие «Опытная научная станция по сахарной свёкле» Л.В. МОЖАРОВСКАЯ, канд. биолог. наук, доцент, ст. научн. сотрудник (e-mail: [email protected]) Государственное научное учреждение «Институт леса НАН Беларуси»

Введение

Сахарная свёкла (Beta vulgaris L.) входит в разряд культур, обеспечивающих продовольственную безопасность страны. Повышение её продуктивности является важной задачей растениеводства, решение которой позволит снизить себестоимость продукции и повысить рентабельность свеклосахарного производства.

Основным фактором, снижающим урожайность культуры, являются болезни. Поражение листового аппарата сахарной свёклы в период вегетации такими возбудителями фитозаболеваний, как Cercospora beticola (болезнь — церкоспороз), Ramularia beticola (рамуляриоз), Neocamarosporium betae (syn. Phoma betae, Pleospora betae — фомоз), Erysiphe betae (мучнистая роса), Peronospora schachtii (пероноспороз), Uromyces betae (ржавчина), приводит к существенным нарушениям физиологических процессов, протекающих в растениях. Воздействие патогена снижает выход сахара (на 20—50 %), технологические показатели сырья, содержание доброкачественного сока и повышает количество токсичного для человека небелкового азота. У корнеплодов поражённых растений наблюдается ухудшение лёжкости, а при хранении — развитие комплексов возбудителей кагатной гнили.

В настоящее время перед селекционерами стоит важная задача — создание гетерозисных адаптивных гибридов сахарной свёклы, которые сочетают высокую продуктивность и устойчивость к заболеваниям, а также неблагоприятным природным факторам среды в разных эколого-географических зонах. В связи с этим в селекции определены основные направления отбора: устойчивость к болезням и вредителям, холодостойкость, скороспелость, цветушность, уровень продуктивности и качество продукции.

При проведении селекционных мероприятий, направленных на отбор устойчивых к болезням сортов сельскохозяйственных культур, существенное значение имеет оценка исходного материала и скрининг устойчивых форм. Для ускоренной оценки селекци-

онного материала на устойчивость особенно эффективным является создание инфекционного или провокационного фона с последующим определением степени поражаемости селекционного материала сахарной свёклы, что позволяет на ранних этапах селекции выбраковывать восприимчивые генотипы и целенаправленно вести отбор. Важная роль в решении данного вопроса отводится селекционно-генетическим и молекулярным методам [1—4].

Наиболее современными и перспективными инструментами изучения аспектов устойчивости к фи-топатогенам представляются методы, основанные на анализе молекул ДНК. Преимущества ДНК-маркеров перед остальными группами методов — это ранняя диагностика физиологических и патологических процессов, информативность, точность определения и быстрота выполнения анализов.

Одним из инновационных молекулярно-генетиче-ских подходов к изучению генов, детерминирующих устойчивость организмов, является транскриптом-ный анализ, при котором рассматриваются все транскрипты экспрессирующихся генов в совокупности в конкретный момент времени при заданных условиях, в том числе биотическом стрессе. Основное преимущество данного подхода — возможность проведения скрининга EST-маркеров, ассоциированных с проявлением устойчивости, а также их качественного и количественного анализа.

Значимым диагностическим инструментом при идентификации устойчивых сортов и линий сахарной свёклы выступает скрининг с использованием молекулярно-генетического анализа ДНК-маркеров, детерминирующих факторы резистентности по отношению к основным группам фитопатогенных микроорганизмов.

Цель исследований — провести молекулярно-гене-тический скрининг ДНК-локусов сахарной свёклы, ассоциированных с устойчивостью к болезням листового аппарата, и разработать на их основе набор ДНК-маркеров и праймеров для ПЦР-диагностики.

з" а

о Si

УГ ТО 3 а

I s

0

то т I >

то

то

о ^

>о и

з о

m а

30 САХАР № 5 • 2024

bmarussland.ru bma-worldwide. com

ВМА

СПОНСОР НАУЧНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ

Материалы и методы

Объектом исследований служили мужскостериль-ные формы, закрепители стерильности, многосе-мянные опылители, межвидовые гибриды, гибриды сахарной свёклы.

Для выполнения анализа в полевых условиях создавали искусственный инфекционный фон. Заражение растений проводили в фазу начала смыкания рядков (в середине лета) при температуре окружающей среды выше 15 °С и оптимальной влажности выше 90—95 %. В целях искусственного заражения образцов в рядках разбрасывали собранные с полей прошлогодние высушенные и измельчённые листья сахарной свёклы, имеющие симптомы инфицирования. Визуальный учёт развития и распространения болезней листового аппарата сахарной свёклы проводили через 6 недель после заражения.

Для молекулярно-генетической диагностики основных возбудителей болезней листового аппарата отбирали образцы листовых пластин с различным уровнем поражения в общем количестве 500 штук. Выделение суммарной ДНК из образцов растений проводили CTAB-методом [5]. Чтобы определить количество ДНК исследуемых образцов, измеряли поглощение растворов в областях с длинами волн 230, 260, 280 и 320 нм с использованием спектрофотометра NanoPhotometer P330 (Implen, Германия). Соотношение экстинкций 260 нм / 280 нм позволяло судить о степени депроитенизации препарата нуклеиновой кислоты. Чистые препараты ДНК имели соотношение 260 нм / 280 нм не менее 1,8, а 260 нм / 230 нм — 2,1. На основании сравнительного анализа диагностических локусов для фитопатогенных грибов были выбраны ДНК-маркеры, позволяющие выявлять инфекцию в растительных образцах. В качестве такого маркера был использован участок опе-рона рибосомальной ДНК, включающий в себя фрагмент гена 18S рРНК, внутренний транскрибируемый спейсер (ITS) 1, ген 5,8S рРНК, ITS 2 и фрагмент гена 28S рРНК. Основными критериями выбора маркеров являлись: мультикопийность (обеспечивает высокую диагностическую способность ПЦР-анализа, т. е. вероятность выявления патогена при его низкой концентрации в образце), консервативность внутри вида, широкая изученность этих локусов и представленная информация об их нуклеотидной структуре в генетических базах данных и литературе. Для ПЦР-амплификации вышеуказанных локусов использовались следующие праймеры: F (ITS1F) — 5'- CTTGGT-CATTTAGAGGAAGTAA -3', R (ITS4) - 5'- TCCTC-CGCTTATTGATATGC - 3' [6, 7]. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с применением реагентов ArtMix Форез ДНК-полимераза («АртБио-Тех», Беларусь).

Алгоритм программы ПЦР-амплификации был следующим: 1-й этап (1 цикл) — денатурация 3 мин. при T = 95 °С; 2-й этап (35 циклов) — денатурация 20 сек. при 95 °С, отжиг 20 сек. при T = 55 °С, элонгация 45 сек. при T = 72 °С. Электрофоретическое фракционирование продуктов амплификации проводили в 1,5%-ном агарозном геле в горизонтальной камере SE-2 (Helicon, РФ) согласно инструкции компании-изготовителя. Электрофоретические фракции ДНК выявляли после окрашивания гелевых блоков в растворе флуоресцентного красителя бромистого этидия. Фракции ДНК в агарозном геле различали в системе гель-документирования GelDoc Go (Bio-Rad Laboratories, США). При выполнении секвенирую-щей реакции в качестве реакционной смеси использовался набор реагентов Brilliant Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Nimagen, Нидерланды) c последующим анализом продуктов на автоматическом анализаторе 3500 Applied Biosystems (Thermo Fisher Scientific, США). Анализ полученных данных (расшифровку нуклеотидной структуры) генетического анализатора осуществляли на основе программного пакета Sequencing Analysis Software 5.1.1. (Thermo Fisher Scientific, США). В целях установления или подтверждения видовой принадлежности образцов нуклеотидная структура секвенированных амплико-нов была проанализирована с помощью программы BLAST в международной базе данных NCBI.

Для проведения анализа транскриптов генов селекционных образцов сахарной свёклы с различной степенью устойчивости к основным типам болезней листового аппарата в лабораторных условиях проводился посев и проращивание растений рулонным методом. После прорастания на 10-е сутки селекционные образцы переносили в почву, где выращивали в течение 8 недель при температуре воздуха 22 °С и фотопериоде 10 час. При создании инфекционного фона в качестве инокулята использовали порошок сухих листьев растений сахарной свёклы, инфицированных Cercospora beticola, который вносили в почву на 4-й неделе проращивания. Выделение суммарной РНК проводили из листовых пластин растений с различной степенью поражения набором Gene JET Plant RNA Purification Mini Kit (Thermo Fisher Scientific, США) по методике фирмы-производителя. Очищение РНК от примесей геномной ДНК выполняли с помощью набора DNase I (Thermo Fisher Scientific, США); реакцию обратной транскрипции с синтезом кДНК — с применением ArtMMLV ревертазы и прай-мерами Олиго (дТ)12-25 («АртБиоТех», Беларусь). Полученные препараты кДНК очищали от сторонних примесей с использованием магнитных частиц Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, США) согласно протоколу фирмы-производителя.

№ 5 . 2024 САХАР 31

СПОНСОР НАУЧНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ

BMA

В целях ПЦР-амплификации диагностических локусов транскриптов генов, ассоциированных с устойчивостью к болезням листового аппарата, проводилась разработка структуры праймеров с использованием программы NCBI Primer BLAST и на основе анализа нуклеотидных последовательностей базы данных EST GenBank NCBI для Beta vulgaris Sugar Beet Group. При функциональной аннотации транскриптов использовалась база данных консервативных доменов NCBI ресурса CD-search (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/Stracture/cdd/cdd.shtml). Молекулярно-генетическую диагностику осуществляли с применением разработанного набора молекулярно-генетиче-ских маркеров согласно общепринятой методике [5]. ОТ-ПЦР в реальном времени проводили на ампли-фикаторе Mx3005P (Stratagene, США). Экспрессион-ную активность генов анализировали на основе метода ДДа [8].

Результаты исследований

По результатам оценки на устойчивость к болезням листового аппарата и фитопатологического анализа на основе применения молекулярно-генетиче-ских методов для исследуемых растений сахарной свёклы 25 линий и гибридов, выращенных на искусственном инфекционном фоне (ИИФ), на листовых пластинах идентифицированы патогенные микро-мицеты — возбудители болезней листового аппарата: Cercospora beticola (учётная запись NCBI GenBank: MF681068.1, уровень сходства — 100 %) и Phoma be-tae (учётная запись NCBI GenBank: MK249659.1, уровень сходства — 99 %). Полученные результаты об основных инфекционных агентах болезней листового аппарата использовались в последующем лабораторном моделировании инфекционного фона при проращивании растений сахарной свёклы.

При учёте поражённости в полевых условиях на каждой опытной делянке просматривали по 30 растений. Степень поражения определяли по 6-балльной шкале [9]. Проводили учёты развития и распространения болезни листового аппарата сахарной свёклы. Наименьший процент развития болезней имели селекционные образцы: три мужскостерильные формы — FMSGr148, FMS Gr1422, FMS Gr148 и многосемянный диплоидный опылитель ММ663872, которые будут использованы в дальнейшей селекционной работе для создания гибридов сахарной свёклы.

Для проведения анализа транскриптомной активности генов сахарной свёклы, ассоциированных с устойчивостью к основным типам болезней листового аппарата, разрабатывался набор ДНК-маркеров и олигонуклеотидных праймеров для их ПЦР-диагностики. С этой целью среди нуклеотид-ных последовательностей EST-локусов транскрип-томных данных, представленных в GenBank NCBI для Beta vulgaris, проводился скрининг транскриптов генов: высокомолекулярных антиоксидантов и ассоциированных с оксидативным стрессом (POX, GST, GLT, CAT, TRX), лейцин-богатых последовательностей (LRRs), PR-генов (AAI_LTSS, PP2C, LTPs, Ch, PR1), транскрипционных факторов (WRKY, AREB) генов, ассоциированных с ответными реакциями к биотическому стрессу. Разработка структуры оригинальных олигонуклеотидных праймеров для ПЦР-диагностики генов-кандидатов, включая количественный анализ методом ОТ-ПЦР-РВ, осуществлялась с использованием программы NCBI Primer BLAST. Выбирая области отжига праймеров, предпочтение отдавали консервативным регионам, в связи с чем проводилось множественное выравнивание идентифицированных транскриптов в базе данных GenBank NCBI. В результате анализа для конструирования праймеров использовался мономорфный, а не полиморфный регион (рис. 1). При разработке праймеров придерживались следующих характеристик: температура плавления праймеров — 57—63 °С (оптимум — 60 °С); различия в температурах плавления праймеров — 3 °С; GC-состав праймеров — 40—70 %; наибольшее количество G-повторов — 4; длина прай-мера — 18—25 нуклеотидов; максимальная компли-ментарность — 8; максимальная комплиментарность

Descriptions Graphic Summary

Alignments

Taxonomy

Alignment view Flat query-anchored with dots for identities

Line length: 60

] ©[

Restore defaults

A. Download ~ Query range 5: 241 to 300

Query 241

NM 0Й1303075.1 241 XM 010686934.4 423 XM 057396082.1 423

ACCTGGGTCAGGGTTAGGGTCAGGGAACTTCTCCTTAGCAAGACAACTATCAGTATATTC

300 300 482 482

i Download v Query range 6: 301 to 360

301

Query

NM 001363075.1 XM 018686934.4 XM 057396082.1 XM 010685439.3

301 483 483 635

СТТААС GTTCGACGAATTTCAGAATAC-ATTAGGTGGGATGGGGAAGG OTTTGGGTCAA

C-.fi..Т..6......С.С..СС...-...A..GT..А...А

359 359 541 541

Рис. 1. Множественное выравнивание транскриптов гена AREB1 в базе данных GenBank NCBI. Красным цветом выделен полиморфный регион

32 САХАР № 5 • 2024

ВМА

»

СПОНСОР НАУЧНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ

З'-конца — 3; максимальная длина мононуклеотид-ных повторов — 5; длина ампликона — 70—250 п.н.

В таблице представлен разработанный набор ДНК-маркеров и олигонуклеотидных праймеров для ПЦР-диагностики генов, ассоциированных с устойчивостью к болезням листового аппарата сахарной свёклы, в том числе количественной оценки — экс-прессионной активности данных генов методом ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). Функциональное назначение определяли на основе функциональной аннотации базы данных ресурса CD-search NCBI и согласно представленному описанию в литературе [10—14]. Тестирование предложенного набора ДНК-маркеров и олигонуклеотидных праймеров проводилось in silico (рис. 2).

Для проведения количественного анализа методом ОТ-ПЦР на основе относительной коли-

чественной оценки разрабатывались структуры оригинальных олигонуклеотипных праймеров ДНК-локусов генов-нормализаторов («домашнего хозяйства») — убиквитина (ubi), фактора элонгации 1 (EF1). Сконструированные праймеры характеризовались следующей структурой: ДНК-маркер ubi - F - 5'-TCGTGAAAACCCTAACGGGTA - 3', R - 5' - CTTCAAGTTGTTTTCCGGCGA - 3', ожидаемый размер продукта — 135 н.о.; ДНК-маркер EF1 - F - 5' - CTGACAGCAAAACGGCCAAG - 3', R - 5' - GGAGATTGAGAAGGAGCCCA - 3', ожидаемый размер продукта - 126 н.о. Разработанный набор ДНК-маркеров и олигонуклеотидных праймеров для ПЦР-диагностики генов, ассоциированных с устойчивостью к болезням листового аппарата сахарной свёклы, а также генов-нормализаторов в дальнейшем будет использоваться для оценки их функциональной

Набор ДНК-маркеров и олигонуклеотидных праймеров для ПЦР-диагностики генов-кандидатов, ассоциированных с устойчивостью к болезням листового аппарата сахарной свёклы

ДНК- маркер Функциональное назаначение Ожидаемый размер продукта, п.н. Структура олигонуклеотидных праймеров (5'-3')

POX12 Пероксидаза, реакция на абиотический и биотический стресс 198 F: GAGCACAGTACCAGTTGTGCC R: GCAGATCCATCCAGTAACACG

GLT_GTB Глюкозилтрансфераза, участвует в реакциях на биотический и абиотический стресс 185 F: GGAGAGCCTAACATCTGGCG R: CCTCACTCTCCATAACAACCTCC

Glu2 Глутаматсинтаза, участвует в реакциях на биотический и абиотический стресс 182 F: ACGGGAGACTAGGCAACAAC R: ATCGGAGCCGAGTGACCTTA

TRX Тиоредоксин, рост и развитие растений, участвует в реакциях на биотический и абиотический стресс 162 F: AATCCTACCAGAGCTTTCGCC R: GCGTTTGGAGGATTGAGTGC

LRR_CC Белок с множеством повторов лейцина, защитная функция 193 F: AGTTAGTCCTGCATGGGTGC R: TCTCCAACTTTGAAGCAATCCA

AAI_LTSS Семейство белков — ингибиторов альфа-амилазы (АА1), переноса липидов (ЪТ) и хранения семян (88), играет важную роль в защите от патогенов 200 F: GAACTTGCCCCATTGATGCC R: AGAGAGCGGGATCTCCAAGT

PP2Cc Серин/треонинфосфатазы, синтез вторичных метаболитов, модификации белков, участвует в реакциях на биотический и абиотический стресс 112 F: ATCCTTAACGCAGTCCACCG R: ACCGCATGTAACCGTTGAGA

Ch4 Хитиназа, деградация хитина, защита от фитопа-тогенных грибов 179 F: TTTGCCCATGTCACCCATGA R: AATCCAATGCTTCGACCAGC

AREB1 Белок, связывающий элемент абсцизовой кислоты, фактор транскрипции, участвует в реакциях на биотический и абиотический стресс 199 F: TGCAATTGAAGCAAGTTCACA R: GCTTCATTTCCATAGTTCTTACTGA

WRKY40 Факторы транскрипции WRKY, участвует в реакциях растений на абсцизовую кислоту, абиотический стресс, воздействие на растения патогенов 250 F: TGCTGTTCGAACTGAAGCGT R: GGCTGATGGTGCAGCCTCTT

PR1 Семейство генов, ассоциированных с патогенезом 1 (PR1), играет важную роль в ответе на биотический стресс 102 F: TGCCATGCACAAAATTCACCA R: GGCTGCCACTTGATCATCCC

TLP Тауматин-подобные белки, ассоциированые с защитными реакциями на биотический и абиотический стресс 188 F: GGCCATCCAGTGATAGCCAA R: CCGTCACAATCGCCTGTTTG

Рис. 2. Результаты тестирования in silico праймеров для ПЦР-диагностики ДНК-маркера AREBl

активности у растений сахарной свёклы в условиях биотического стресса.

На основе разработанных структур олигонуклеотидных праймеров для ПЦР-диагностики ДНК-маркеров, ассоциированных с устойчивостью (PR1, TLP, WRKY40), и генов-нормализаторов (EF1, ubi) проведён их синтез, а также апробация ПЦР-анализом

с визуализацией амплифицируемых фрагментов с помощью горизонтального электрофоре-тического фракционирования (рис. 3).

Методом ОТ-пЦр-РВ апробировали ДНК-маркеры, ассоциированные с устойчивостью (PR1, WRKY40, TLP), с оценкой их функциональной активности на основе референсных генов-нормализаторов (EF1, ubi). С этой целью проводилась ПЦР-диагностика

растений сахарной свёклы, выращенных в контролируемых условиях в присутствии инфекционного фона Cercospora beticola. По результатам молекуляр-но-генетического анализа для гена PR1, участвующего в защитных реакциях при патогенезе, установлена повышенная экспрессия (рис. 4) у растений с симптоматикой церкоспороза (наличие характерной пятнистости листовых пластин). Так, для группы растений с признаками болезни среднее значение относительного уровня экспрессии генов PR1 составляло: по ubi +0,74±0,18, по EF1 +0,69±0,20. Для группы растений без симптомов инфицирования среднее значение относительной экспрессии генов PR1 было ниже и составило по ubi -0,86±0,28, по EF1 -1,12±0,11. По результатам исследования для гена WRKY40, описанного как патоген-индуцированный транскрипционный фактор, установлена повышенная экспрессия (см. рис. 4) для группы растений варианта с отсустви-ем симптомов болезни, среднее значение относительного уровня экспрессии генов WRKY40 составило по ubi +0,31±0,07, по EF1 +1,78±0,67. Отмечена пониженная экспрессия генов WRKY40 для группы растений с признаками болезни со следующими средними значениями относительного уровня экспрессии: по ubi —0,10±0,26, по EF1 +0,75±0,19.

На рис. 5 представлен анализ флуоресцентных кривых ПЦР-амплификации ДНК-локусов — ubi, EF1, PR1, WRKY40 для инфицированных Cercospora

M W40 El l PR1 TLP ubi

Рис. 3. Фрагмент электрофоре-граммы ДНК-маркеров (WRKY40 (W40), EF1, PR1, TLP, ubi) образцов сахарной свёклы, М — маркер молекулярной массы 100 bp («Праймтех», Беларусь)

à

&

3 2,5 2 1,5 1

О,5

О

-О,5 -1

Рис. 4. Относительная экспрессионная активность PR1 и WRKY40 (W40) генов, ассоциированных cустойчивостью растений сахарной свёклы (З — растения без симптомов инфицирования, Б — растения с симптоматикой церкоспороза), гены-нормализаторы: EF1, ubi. Планками погрешности отмечен доверительный интервал, по оси OY — относительные единицы — ДДО, с переводом значений в log10

ЬеИсо1а образцов растений (листовых пластин) сахарной свёклы.

Как видно из графиков накопления флуоресцентного сигнала (см. рис. 5) ОТ-ПЦР-РВ для растений с симптоматикой фитозаболевания (пятнистость листовых пластин), отмечается повышенная функциональная активность гена РМ, когда экспрессия WRKY40 снижена. Для образцов растений, потенциально устойчивых (отсуствуют симптомы церкоспороза в условиях заражения), отмечается иная картина — уровень экспрессии PR1 снижен, а функциональная активность WRKY40 повышена. Проведён также анализ функциональной активности по ДНК-маркеру ПР и показана его индуцированная экспрессия у растений

с симптомами инфицирования (относительный уровень экспрессии группы растений с признаками болезни по ubi составил +0,36±0,12, по EF1 +0,20±0,11; без симптомов инфицирования по ubi —0,24±0,26, по EF1 —0,68±0,36). Таким образом, повышенная экспрессия транскриптов генов PR1 и TLP предположительно является маркером патогенетического состояния растений, а повышенную функциональную активность гена транскрипционного фактора WRKY40 можно рассматривать как потенциальный маркер признака устойчивости растений к Cercospora beticola. Использование предложенных ДНК-маркеров и праймеров позволило провести оценку патогенетического состояния растений, а также выделить потенциально устойчивые растения на основе оценки функциональной активности защитных генов.

Заключение

На основе анализа транскриптомных данных разработан набор из 12 ДНК-маркеров (POX12, GLT_ GTB, Glu2, TRX, LRRCC, AAI_LTSS, PP2Cc, Ch4, AREB1, WRKY40, PR1, TLP) и пар олигонуклеотидных праймеров для ПЦР-диагностики генов, ассоциированных с устойчивостью к болезням листового аппарата сахарной свёклы. В целях количественной оценки экспрессионной активности защитных генов методом ПЦР-РВ на основе относительного определения уровня представленности транскриптов сконструированы пары олигонуклеотидных праймеров генов-нормализаторов (EF1, ubi). По результатам ОТ-ПЦР-РВ-анализа для растений с симптоматикой фитоза-болевания — церкоспороза показана повышенная функциональная активность генов PR1 и TLP, таким

24GGG 2З000 22GGG 21GG0 2GGGG 19GG0 1BGGG 17GG0 16GG0 ^ 15GG0 14GG0 S 1З000 S 12GG0 Sí 11GG0 ï 1GGGG § 9GG0 í BGGO 7GGG 6GGG 5GGG 4GGG З000 2GGG 1GGG G

-1GG0 -2GG0 -З000

A

1

1

W! G

А

J

24000 23000 22000 21000 20000 19000 18000 17000 16000 15000 14000 13000 12000 11000 10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0

-1000 -2000 -3000

ut

i

/

/

/

/

/ )

у- -f-

/

У У

4- г*

1G 12 14 16 1B 2G 22 24 26 2B З0 З2 З4 З6 ЗВ 40 Cycles

6 8

10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 Cycles

Рис. 5. Результаты ПЦР-РВ-анализа уровня транскрипции ДНК-маркеров ubi, EF1, PR1, WRKY40 для инфицированных (А) Cercospora beticola образцов растений сахарной свёклы и потенциально устойчивых (Б) (отсуствуют симптомы церкоспороза в условиях заражения)

№ 5 . 2024 САХАР 35

СПОНСОР НАУЧНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ

BMA

Б

образом, данные ДНК-локусы предположительно могут рассматриваться как маркеры патогенетического состояния растений. Для устойчивых растений отмечена повышенная функциональная активность гена транскрипционного фактора WRKY40. Разработанный набор ДНК-маркеров и праймеров позволил провести оценку патогенетического состояния растений, а также выделить потенциально устойчивые растения на основе оценки функциональной активности защитных генов. Выделены 4 селекционных образца сахарной свёклы (FMSGr148, FMS Gr1422, FMS Gr148, ММ663872), устойчивых к болезням листового аппарата. Представленные результаты будут использованы в дальнейшей селекционной работе.

Список литературы

1. Корниенко, А.В. Система для создания адаптивных и устойчивых гибридов сахарной свёклы / А.В. Корниенко // Труды Кубанского гос. аграрн. ун-та. — 2018. - № 72. - С. 196-202.

2. Путилина, Л.Н. Формирование технологического качества и продуктивности сахарной свёклы в результате действия современных фунгицидов / Л.Н. Путилина, Н.А. Лазутина // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2021. - № 1. - С. 38-51.

3. Жеряков, Е.В. Устойчивость различных гибридов сахарной свёклы к поражению заболеваниями листового аппарата / Е.В. Жеряков, Е.С. Бредучева // Вестник Мичуринского гос. аграрн. ун-та - 2021. -Т. 2. - № 65. - С. 20-25.

4. Stevanato, P. Identification and validation of a SNP marker linked to the gene HsBvm-1 for nematode resistance in sugar beet / P. Stevanato // Plant Molecular Biology Reporter. - 2015. - V. 33. - № 3. - P. 474-479.

5. Падутов, В.Е. Методы молекулярно-генетиче-ского анализа / В.Е. Падутов, О.Ю. Баранов, Е.В. Воропаев. - Минск : Юнипол, 2007. - 176 с.

6. Gardes, M. ITS primers with enhanced specificity for basidiomycetes application to the identification of mycorrhizae and rusts / M. Gardes, T.D. Brans // Molecular ecology. - 1993. - V. 2. - № 2. - P. 113-118.

7. White, T.J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics / T.J. White [et al.] // PCR protocols: a guide to methods and applications. - 1990. - V. 18. - № 1. - P. 315-322.

8. Livak, K.J. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-DDCt method / K.J. Livak, T.D. Schmittgen // Methods. -2001. - Vol. 25. - № 4. - P. 402-408.

9. Котикова, Г.Ш. Болезни сахарной свёклы / Г.Ш. Котикова // Методические указания по регистрационным испытаниям фунгицидов в сельском хозяйстве / Ин-т защиты растений; под ред. С.Ф. Буга. - Несвиж, 2007. - С. 191-195.

10. Weltmeier, F. Transcript profiles in sugar beet genotypes uncover timing and strength of defense reactions to Cercospora beticola infection / F. Weltmeier [et al.] // Molecular plant-microbe interactions. — 2011. — V. 24. — № 7. - P. 758-772.

11. Schmidt, K. Accumulation of the hormone abscisic acid (ABA) at the infection site of the fungus Cercospora beticola supports the role of ABA as a repressor of plant defence in sugar beet / K. Schmidt [et al.] // Molecular plant pathology. - 2008. - V. 9. - № 5. - P. 661-673.

12. Afzal, A.J. Plant receptor-like serine threonine kinases: roles in signaling and plant defense / A.J. Afzal, A.J. Wood, D.A. Lightfoot // Molecular Plant-Microbe Interactions. - 2008. - V. 21. - № 5. - P. 507-517.

13. Nielsen, K.K An acidic class III chitinase in sugar beet: induction by Cercospora beticola, characterization, and expression in transgenic tobacco plants / K.K. Nielsen [et al.] // Molecular Plant Microbe Interactions. - 1993. -V. 6. - P. 495-495.

14. Balasubramanian, V. Plant p-1, 3-glucanases: their biological functions and transgenic expression against phy-topathogenic fungi / V. Balasubramanian [et al.] // Biotechnology letters. - 2012. - V. 34. - № 11. - P. 19831990.

Аннотация. В условиях опыта при создании искусственного инфекционного фона проведена молекулярно-генетическая идентификация основных возбудителей болезней листового аппарата сахарной свёклы. На основе анализа транскриптомных данных разработан набор из 12 ДНК-маркеров и пар олигонуклеотидных праймеров для ПЦР-диаг-ностики генов, ассоциированных с устойчивостью к болезням листового аппарата сахарной свёклы. Представлены результаты ДНК-анализа селекционных образцов сахарной свёклы на предмет устойчивости к болезням листового аппарата. Проведена оценка патогенетического состояния растений с использованием разработанных ДНК-маркеров и праймеров защитных генов (PR1, WRKY40, TLP) на основе изучения их функциональной активности, выделены потенциально устойчивые образцы. Ключевые слова: полимеразная цепная реакция (ПЦР), ДНК-маркеры, праймеры, сахарная свёкла, церкоспороз, фомоз.

Summary. Under experimental conditions, when creating an artificial infectious background, molecular genetic identification of the main pathogens of sugar beet leaf apparatus diseases was carried out. Based on the use of transcriptome analysis, a set of 12 DNA markers and pairs of oligonucleotide primers for PCR diagnostics of candidate genes associated with resistance to sugar beet foliar apparatus diseases was developed. The results of DNA analysis of sugar beet breeding samples for resistance to foliar apparatus diseases are presented. An assessment of the pathogenetic state of plants was carried out using the developed DNA markers and primers of protective genes (PR1, WRKY40, TLP) based on a study of their functional activity, and potentially resistant samples were isolated.

Keywords: polymerase chain reaction (PCR), DNA markers, primers, sugar beet, cercospora leaf spot, phomosis.